JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем простую технику, предназначенную для эффективной генерации генетически модифицированных мышей, под названием CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Этот метод обеспечивает редактирование реагентов путем электропорации в эмбрионы с эффективностью, приближающейся к 100%. Этот протокол эффективен для точечных мутаций, небольших геномных вставок и делеций у эмбрионов млекопитающих.

Аннотация

Благодаря исключительной эффективности, точности и простоте система CRISPR/Cas9 значительно улучшила редактирование генома в клеточных культурах и лабораторных экспериментах на животных. При создании животных моделей электропорация зигот обеспечивает более высокую эффективность, простоту, стоимость и пропускную способность в качестве альтернативы методу микроинъекции золотого стандарта. Электропорация также более мягкая, с более высокой жизнеспособностью и надежно доставляет рибонуклеопротеины Cas9 / однонаправленной РНК (sgRNA) (RNP) в зиготы распространенных лабораторных штаммов мышей (например, C57BL / 6J и C57BL / 6N), что приближается к 100% эффективности доставки. Этот метод позволяет вставлять / делеционировать (indels) мутации, точечные мутации, делецию целых генов или экзонов и небольшие вставки в диапазоне 100-200 bp для вставки LoxP или коротких тегов, таких как FLAG, HA или V5. Несмотря на постоянное улучшение, здесь мы представляем текущее состояние CRISPR-EZ в протоколе, который включает в себя производство sgRNA посредством транскрипции in vitro , обработки эмбрионов, сборки RNP, электропорации и генотипирования предимплантационных эмбрионов. Исследователь уровня выпускника с минимальным опытом манипулирования эмбрионами может получить генетически отредактированные эмбрионы менее чем за 1 неделю, используя этот протокол. Здесь мы предлагаем простой, недорогой, эффективный, высокопроизводительный метод, который можно использовать с эмбрионами мышей.

Введение

Редактирование генома у живых мышей было значительно упрощено и стало доступным и более доступным с момента появления редактирования CRISPR 1,2,3. Первоначальные попытки редактирования животных использовали микроинъекцию для доставки мРНК/сгРНК CRISPR Cas9 в эмбрионы пронуклеарной стадии 4,5,6. Хотя микроинъекция довольно эффективна, объем практики, необходимый для ее полного освоения, может не подходить для стажеров и студентов, а также требует дорогостоящего оборудования, которое скромно финансируемая лаборатория не может себе позволить. Микроинъекция обычно выполняется экспертами-техниками на трансгенных объектах с графиками и ценами на услуги, которые ограничивают скорость для многих исследователей. Более доступным подходом является электропорация, которая, как было продемонстрировано, довольно эффективна для доставки CRISPR Cas9 мРНК/сгРНК в эмбрионы пронуклеарной стадии7. Дальнейшие усовершенствования в стратегиях редактирования и доставки генома CRISPR показали, что предварительно собранные RNP, уже связанные с sgRNAs, могут быть эффективным средством снижения мозаицизма8.

Обоснование разработки и использования этого протокола заключалось в том, чтобы обойти многие ограничения и препятствия, связанные с микроинъекцией. Как следует из названия, простой, внутренний и экономически эффективный метод, который мог бы быстро определить, стоит ли использовать непроверенные конструкции сгРНК во время эксперимента с микроинъекцией, был бы очень удобным этапом контроля качества первого прохода (рисунок 1). Хотя этот метод не может заменить микроинъекцию для более сложных стратегий, таких как введение длинных последовательностей донорской ДНК для результатов, основанных на рекомбинации, он идеально подходит для менее сложных стратегий, таких как небольшие делеции или вставки и маркировка генов. Этот метод подходит для исследователей с базовыми навыками манипулирования эмбрионами, которые имеют простые потребности в редактировании, хотели бы проверить свою гипотезу в сроки развития до имплантации или предпочитают тестировать sgRNAs в эмбрионах, прежде чем назначать встречу со специалистом по микроинъекции. Здесь реагенты редактирования временно доставляются в эмбрионы пронуклеарной стадии в виде РНК Cas9/sgRNA посредством электропорации (серия электрических импульсов) для максимизации эффективности при одновременном снижении мозаицизма8. Используя метод генотипирования эмбрионов, результаты редактирования доступны примерно через 1 неделю9, что снижает потребность в различных применениях микроинъекций при значительно сниженных затратах.

Эффективность этого метода достигает пика на стадии пронуклеарного эмбриона, когда эмбрион еще не слил материнскую и отцовскую пронуклеи или не вошел в S-фазу (рисунок 2). Суперовуляция используется для максимизации количества зигот, но производит как пронуклеарные зиготы, так и неоплодотворенные яйцеклетки. Здоровые зиготы также могут быть предварительно отобраны перед электропорацией для повышения общей эффективности. Поскольку другие протоколы электропорации эффективно редактируют зиготы без необходимости включать аналогичную стадию 7,10,11,12,13,14,15, факультативным шагом этого протокола является небольшая эрозия зоны пеллюцидов (ZP). ZP представляет собой слой гликопротеинов, который способствует связыванию сперматозоидов, акросомному ответу и оплодотворению, окружающему эмбрионы пронуклеарной стадии. По нашему опыту, мы обнаружили, что мягкая эрозия ZP на кислотной основе обеспечивает надежную электропорацию Cas9 RNP с лишь незначительным влиянием на жизнеспособность.

Мы наблюдали скорость доставки RNP до 100% эффективности посредством электропорации в штаммах мышей, которые обычно используются в таких исследованиях, как C57BL / 6J и C57BL / 6N 9,16. Независимые группы также разработали процедуры на основе электропорации с эффективностью более или соответствующей микроинъекцией 11,12,13,14,15,17, с протоколами электропорации, хорошо функционирующими у крыс 18,19, свиней 20,21,22 и коров 23 Поэтому мы предлагаем читателям сравнить протоколы, чтобы найти условия, которые наилучшим образом соответствуют их экспериментальным потребностям и потребностям в оборудовании. Система, описанная здесь, использует общие материалы и оборудование, требующие только базовых навыков манипулирования эмбрионами. Этот метод эффективен для целого ряда стратегий редактирования, что делает этот метод широко доступным для исследовательского сообщества.

Проектирование идеальных малых направляющих РНК (sgRNAs) имеет важное значение для эффективного редактирования. Мы рекомендуем проводить скрининг двух-трех стратегий сгРНК на целевой участок непосредственно у эмбрионов мышей, особенно если требуется генерация линии мыши. После разработки рекомендуются методы без клонирования, такие как транскрипция in vitro (IVT) для получения высококачественных sgRNAs3. RNP и sgRNAs смешивают с 30-50 обработанными эмбрионами пронуклеарной стадии и подвергают воздействию серии электрических импульсов, чтобы сначала временно проникнуть в ZP и клеточную мембрану, с последующими импульсами, чтобы держать поры открытыми и электрофоризировать RNP через зиготу24. После оптимизации мы обнаружили, что шесть импульсов 3 мс при 30 В для объемных эмбрионов (~ 50) были оптимальными для эффективности и жизнеспособности редактирования, обеспечивая высокоэффективную доставку РНП Cas9 / sgRNA 9,16,25. События редактирования в отдельных морулах мыши могут быть подтверждены с использованием различных стратегий проверки, общих для редактирования CRISPR, таких как полиморфизм длины фрагмента ограничения (RFLP), переваривание эндонуклеазы T7 и секвенирование Сэнгера интересующей области26.

Текущий метод наиболее подходит для простых схем редактирования (рисунок 3), таких как вставка/удаление (indels), удаление размером с экзон порядка 500-2000 bp, а также доставка точечных мутаций и небольших вставок, таких как C- или N-концевые теги (например, FLAG, HA или V5)9,16,27. Потенциал для сложного редактирования генома, такого как большие вставки флуоресцентных меток или условных аллелей, остается неопределенным и в настоящее время находится в центре внимания предстоящих улучшений.

Этот метод легко осваивается и может быть использован для быстрого тестирования sgRNAs в культивируемых эмбрионах мышей за 1 неделю9 (рисунок 1). Представленный в данной работе шестиступенчатый протокол, который включает в себя 1) проектирование сгРНК; 2) синтез сгРНК; 3) суперовуляция и спаривание; 4) культивирование, сбор и обработка эмбрионов; 5) сборка и электропорация РНП; 6) культивирование эмбрионов и генотипирование. Информация обо всех используемых материалах предоставляется (Таблица материалов). В качестве положительного контроля реагенты для редактирования локуса тирозиназы (Тир) 9,16 были включены в Дополнительную таблицу 1.

протокол

Все методы ухода за животными и их использование в рамках этого протокола соответствовали политике Закона о благополучии животных, Руководству ILAR по уходу и использованию лабораторных животных и следовали руководящим принципам AVMA по эвтаназии и Руководящим принципам и политикам Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Пенсильвании (IACUC). Протокол по уходу за животными и их использованию был рассмотрен и одобрен Университетом Пенсильвании IACUC для этого проекта. В целях соблюдения и осторожности просьба запросить все необходимые разрешения до начала применения этого протокола.

1. sgRNA и опциональный дизайн донорского олиго

  1. Конструкция сгРНК
    1. Выберите кандидаты sgRNAs из любых широко используемых онлайн-алгоритмов, таких как Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 или CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Поскольку каждая платформа уникальна, пожалуйста, внимательно прочитайте инструкции пользователя, чтобы спроектировать идеальные sgRNAs. Для экспериментов in/del выберите два-три sgRNAs для тестирования. Для удаления предлагаются sgRNAs, которые обрамляют целевую область, например, две sgRNAs вверх по течению от цели и две sgRNAs ниже по течению от цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как различные онлайн-алгоритмы sgRNA учитывают внемишенные цели, чтобы избежать дефектных конструкций sgRNA, инструмент BLAST NCBI полезен для подтверждения качества выбранных последовательностей sgRNA.
    2. Вставить 19-20 нуклеотидов (nt), определенных из предыдущей стадии (1.1.1), в переменную область олиго sgRNA (дополнительная таблица 1) и приобрести синтезированную sgRNA в качестве пользовательских олиго ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка СТРАНИЦЫ не требуется.
  2. (Необязательно) Донорская олиго-конструкция для гомологического направленного восстановления (HDR) - опосредованного нокдауна.
    1. Спроектировать соответствующий одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN) на основе желаемого экспериментального результата (точная точечная мутация, вставка loxP, вставка малого метки и т. Д.), Сохраняя общую длину до 100-200 нт с гомологическими рукавами 50 нт или более, фланкирующими центральную область.
    2. Чтобы обеспечить более высокую эффективность выбивания, спроектируйте sgRNA, чтобы она была комплементарной к ssODN30, и замените последовательность протоспейсерного смежного мотива (PAM) бесшумной мутацией, чтобы предотвратить повторное разрезание ферментом Cas9.
    3. Закажите ssODN с помощью пользовательского параметра олиго.

2. синтез сгРНК

  1. Генерация шаблонов для транскрипции in vitro (IVT)
    1. Чтобы сгенерировать шаблон ДНК для sgRNA IVT через ПЦР, подготовьте реакцию IVT в трубке полосы ПЦР, которая не содержит РНКазы. (см. дополнительную таблицу 2).
    2. Используйте следующие условия термоциклера:
      95 °C в течение 2 мин; 30 циклов при 95 °C в течение 2 мин, 57 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с; затем 72 °C в течение 2 мин
    3. Чтобы проверить успешность реакции ПЦР по шаблону ДНК сгРНК, электрофорез 5 мкл продукта сочетают с 1 мкл 6-кратного нагрузочного красителя на 2% (масс./об.) агарозный гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый размер продукта составляет 127 bp. Любая оставшаяся реакция ПЦР может храниться при −20 °C до 5 месяцев.
  2. Транскрипция in vitro (IVT) sgRNA
    1. Чтобы получить сгРНК, приготовьте реакционную смесь (T7 IVT в соответствии с инструкциями производителя) в трубке ПЦР и щелкните, чтобы смешать реагенты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример настройки реакции см. в дополнительной таблице 3 . Реакция ИВТ чувствительна к загрязнению РНКазой; поэтому приложите все усилия, чтобы обеспечить среду, свободную от RNase.
    2. Чтобы реакция началась и протекала, инкубируйте реакционную смесь IVT в течение >18 ч при 37 °C либо в тепловом цикле, либо в тепловом блоке.
    3. Для разложения исходного шаблона ДНК (стадия 2.1.3) вводят 1 мкл ДНКазы I (2 единицы на реакцию) и инкубируют реакцию в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Чтобы способствовать связыванию РНК с шариками магнитной очистки, объедините 129 мкл 100% этанола в реакции, которая теперь составит 150 мкл.
    5. Для повторного суспендирования очистительных шариков, которые имеют свойство оседать во время хранения, вихрейте аликвоту не менее 10 с.
    6. Для очистки sgRNAs добавляют 100 мкл повторно суспендированных шариков (стадия 2.2.5) к реакции IVT (стадия 2.2.4) и осторожно перемешивают, пипетируя вверх и вниз 10x.
    7. Чтобы обеспечить связывание, дайте смеси отдохнуть при RT в течение 5 мин.
    8. Чтобы изолировать sgRNA от неинкорпорированных продуктов реакции, поместите реакцию на магнитные подставки в течение 5 мин при RT и подождите, пока не образуется небольшая гранула.
    9. Чтобы промыть sgRNAs, сначала осторожно выбросьте супернатант, а затем добавьте 200 мкл 80% этанола из гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На стадии промывки этанола 80% (об/об.) крайне важно избегать нарушения гранул при пипетке, так как это значительно снизит концентрацию сгРНК. Вместо этого аккуратно выложите в пипетку 80% этанола, чтобы гранула была погружена, и аккуратно удалите объем пипеткой.
    10. Повторите предыдущую стадию (стадия 2.2.9) и высушите гранулу на воздухе не более 5-6 мин, иначе сгРНК будет постоянно связана с шариками.
    11. Элюируют sgRNA 20 мкл воды без нуклеазы путем пипетки гранулы 10x, инкубации в течение 2 мин при (RT), а затем помещают ее обратно на магнитную подставку, чтобы отделить шарики от теперь очищенной sgRNA.
    12. Чтобы оценить качество и количество сгРНК, используйте такой инструмент, как спектрофотометр или биоанализатор. Альтернативно, на 2% агарозном геле, запускают 2 мкл сгРНК, аналогично этапу 2.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество подтверждается одной четкой полосой. Остальная часть сгРНК может быть использована немедленно или сохранена в условиях −80 °C.

3. Суперовуляция

  1. Чтобы обеспечить достаточное количество эмбрионов для тестирования каждой конструкции sgRNA, суперовулируют от двух до трех самок C57BL / 6J в возрасте от 3 до 5 недель, как описано ранее9. Рекомендуется электропорация 20-30 эмбрионов на сгРНК для получения достаточных результатов для подтверждения эффективности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если оплодотворение прошло успешно, ожидайте 10-20 эмбрионов на спаривание.
  2. Чтобы вызвать овуляцию, следуйте этому графику инъекций гормонов:
    1. День 1: Введите 5 МЕ гонадотропина сыворотки беременной кобылы (PMSG) (100 мкл) через внутрибрюшинную (IP) инъекцию с использованием шприца 26 G в 3-5-недельных самок мышей.
    2. День 3: После 46-48 ч инъекции PMSG ввести 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (100 мкл) через инъекцию IP, чтобы вызвать овуляцию.
    3. Чтобы наладить разведение, спаривайте самок 1:1 с самцом надежного разведения сразу после инъекции ХГЧ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гормоны не деградировали и не теряли активность, выполняйте инъекции в течение 30 минут оттаивания.

4. Сбор и обработка эмбрионов

  1. Коллекция эмбрионов
    1. Чтобы усыпить самок и извлечь необходимый материал, как описано ранее31, обязательно сначала подтвердите соответствующий метод в соответствии с институциональной политикой. Например, используйте асфиксиюCO2 , вывих шейки матки и / или другие одобренные методы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, >75% самок, стимулируемых гормонами, демонстрируют копуляторные пробки, что указывает на успешное спаривание.
    2. Чтобы предотвратить затруднение сбора тканей волосками, поместите усыпленных самок на спину и распылите 70% (об/об) этанола на область живота, которая будет вскрыта хирургическим путем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента рекомендуется выполнять хирургические шаги в вентилируемой вытяжке, чтобы поддерживать асептическую среду и уменьшить вероятность загрязнения.
    3. Чтобы открыть брюшную полость и удалить яйцеводы, срежьте слой кожи / волос (подкожный) хирургическими ножницами и найдите яичники (рисунок 4), которые находятся рядом с почкой и разделяют участок жировой подушки. Яйцеводы расположены проксимально к яичникам (рисунок 4). Хирургическим путем удаляют оба яйцевода у самки и помещают их в отдельные капли 50 мкл среды M2 + BSA (4 мг / мл BSA) (рисунок 5A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции для этого раздела процедуры можно просмотреть визуально31 или следовать шагу9 с использованием ранее опубликованных протоколов.
    4. Чтобы освободить кучевые ооцитарные комплексы (CoCs), содержащие ооциты (рисунок 4), используют рассеченные щипцы для прокола ампулы яйцевода при просмотре через стереомикроскоп.
    5. Чтобы уменьшить количество мусора (кровь, жир, ткань), перенесите и объедините каждый CoC в одну каплю 50 мкл среды M2 + BSA с ручной пипеткой, установленной на 20-30 мкл, чтобы избежать переноса мусора.
  2. Удаление кучевых клеток
    1. Чтобы начать удаление кучевых клеток из зигот (рисунок 4), перенесите CoCs с как можно меньшим количеством дополнительных сред в каплю 100 мкл M2 + гиалуронидазы (рисунок 5B) и осторожно перемешайте, пипетируя CoC до тех пор, пока эмбрионы не будут заметно отделены от гораздо меньших кучевых клеток. Обязательно сведите воздействие M2 + гиалуронидазы на эмбрионы к минимуму, так как это может повлиять на жизнеспособность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно либо предварительно разогреть (37 °C), либо добавить дополнительные 50 мкл M2 + гиалуронидазы, если эмбрионы не отделяются от кучевых клеток в течение 2 минут.
    2. Чтобы разбавить гиалуронидазу и удалить рыхлые кучевые клетки из зигот, используйте пипетку, управляемую ртом, чтобы переместить зиготы в свежую каплю M2 + BSA объемом 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство шагов после этого момента требуют использования пипетки, управляемой ртом, если не указано иное. Хотя риск загрязнения со стороны пользователя низок, рекомендуется использовать встроенный воздушный фильтр для поддержания асептической среды. Просьба ознакомиться с ранее описанными методами подготовки и использования этого документа 9,31.
    3. Используя ротовую пипетку, пропустите эмбрионы через, по крайней мере, четыре-пять еще 50 мкл капель M2 + BSA, чтобы уменьшить количество кучевых клеток.
  3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Разбавление зоны пеллюцида раствором кислотного тирода (АТ).
    1. Чтобы размыть пеллюцидную зону эмбриона и уменьшить дополнительные физические препятствия для доставки реагента, перенесите эмбрионы в предварительно расплавленную (37 °C) каплю раствора АТ объемом 100 мкл на пластине диаметром 60 мм (рисунок 5С). Непрерывно наблюдают за зиготами с помощью стереомикроскопа до тех пор, пока примерно 30% пеллюцидной зоны не будет эродировано9. Общая экспозиция АТ должна составлять 60-90 с. Длительное воздействие АТ может полностью растворить пеллюцидную зону и поставить под угрозу жизнеспособность эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробных инструкций и изображений этого раздела процедуры, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным методам 9,16.
    2. Чтобы разбавить АТ, используйте ротовую пипетку, чтобы пропустить эмбрионы по крайней мере через четыре капли 50 мкл M2 + BSA.
    3. Чтобы определить, было ли обработано соответствующее количество эмбрионов, используйте стереомикроскоп для подсчета эмбрионов. В зависимости от количества используемых самок мышей, можно ожидать примерно 10-20 жизнеспособных зигот на самку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе эмбрионы должны быть относительно свободны от мусора, который будет препятствовать оценке количества и качества. Например, при использовании пяти самок ожидаемое число зигот, вероятно, будет между 50-100, и механический счетчик клеток будет уместен для отслеживания эмбрионов. Обычно теряется около 10-20% эмбрионов из-за неспособности оплодотворения или овуляции низкокачественных яйцеклеток. Во время следующего этапа кратковременно храните эмбрионы в 50 мкл M2+BSA в течение не более 30 мин в инкубаторе.

5. Сборка и электропорация РНП

  1. Сборка RNP
    1. Чтобы собрать комплекс RNP, используйте прилагаемые примеры таблиц для объединения соответствующих реакционных смесей на основе желаемой стратегии редактирования в буфере RNP (100 мМ HEPES pH 7,5, 750 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 50% глицерина и 100 мМ Tris(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид [TCEP] в воде без нуклеазы)
      ПРИМЕЧАНИЕ: TCEP является удобным восстановителем, но имеет короткий период полураспада в водных растворах; поэтому добавьте TCEP непосредственно перед сложной сборкой RNP.
      1. Для негомологичных соединений концов (NHEJ), опосредованных инделей, см. Дополнительную таблицу 4.
      2. Сведения о редактировании, опосредованном гомологией (HDR), приведены в Дополнительной таблице 5.
      3. Технические исключения с использованием парных sgRNAs приведены в Дополнительной таблице 6.
        1. Независимо от стратегии, объедините желаемые реагенты на РТ в ПЦР-трубку.
        2. Чтобы обеспечить образование комплекса РНП, инкубируйте смесь в течение 10 мин при 37 °C.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс RNP может храниться в RT до 1 ч.
  2. Электропорация
    1. Чтобы разбавить BSA перед электропорацией, пропустите эмбрионы через, по меньшей мере, две капли по 50 мкл восстановленной сывороточной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA увеличивает сопротивление во время электропорации и может повредить зиготы.
    2. Для приготовления и смешивания зигот (стадия 4.3.2) с комплексом RNP (этап 5.1.1.2) для электропорации, ротовая пипетка 25-30 эмбрионов в капельку 10 мкл восстановленной сывороточной среды, а затем используйте ручную пипетку для добавления 10 мкл комплекса RNP (стадия 5.1.1.2).
    3. Чтобы разбавить вязкий глицерин из комплекса RNP и гомогенизировать образец, перемешивают путем пипетирования 10x или до тех пор, пока смесь не перестанет проявлять признаки вязкости (вихревой рисунок) с помощью стереомикроскопа.
    4. Чтобы подготовить образец к введению в электропоратор, пипетку этой смеси 20 мкл эмбриона + RNP в электропорационную кювету 0,1 см, избегая при этом пузырьков.
    5. Чтобы доставить реагенты редактирования в зиготу, электропорируйте эмбрионы, используя квадратно-волновой протокол с такими условиями: 30 В, 4-6 импульсов, длина импульса 3 мс и интервалы импульсов 100.
    6. Чтобы извлечь зиготы из кюветы, используйте ручную пипетку, чтобы доставить 50 мкл KSOM + BSA (1 мг / мл BSA) в верхнюю часть кюветы, чтобы промыть эмбрионы, которые, возможно, осели на дно. Аккуратно выложите эту смесь на пластину толщиной 60 мм.
    7. Повторите шаг 5.2.6 по крайней мере 2x-3x и объедините каждый смыв на пластине 60 мм до тех пор, пока большинство эмбрионов не будут восстановлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное восстановление составляет >90% первоначально загруженных эмбрионов. Чтобы обеспечить выживание эмбриона, протестируйте инкубатор и проверьте сроки годности для всех реагентов. Эмбрионы восприимчивы к неидеальным условиям культивирования, таким как температура, уровень CO2 , влажность и pH.

6. Культивирование эмбрионов и генотипирование

  1. Культура эмбрионов
    1. Чтобы культивировать зиготы до нужной стадии, используйте ротовую пипетку для переноса 20-30 зигот в каплю KSOM + BSA в предварительно уравновешенной культуральной пластине и переместите эмбрионы в каплю (рисунок 5D). Инкубируйте пластину в течение ночи в 5% CO2, при 37 °C, с влажностью 95%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно уравновешивают, помещая подготовленную 35-миллиметровую культуральную пластину в инкубатор либо за день до этого, либо по меньшей мере за 4 ч до инкубации (рисунок 5D).
    2. Для создания идеальных условий роста перенесите только двухклеточные эмбрионы на следующий день в свежую каплю смеси KSOM+BSA с помощью стереомикроскопа и вернитесь в инкубатор. Обязательно оставьте или выбросьте мертвые или неоплодотворенные эмбрионы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы пронуклеарной стадии обычно вырастают в морулы после 72 ч культуры и бластоцисты через 84 ч.
  2. Генотипирование
    1. Чтобы разбавить компоненты среды, которые могут мешать реакции ПЦР, промыть эмбрионы морулы / бластоцисты с помощью пипетки для рта, пройдя через две капли DPBS.
    2. Чтобы загрузить отдельные эмбрионы для лизиса, перенесите отдельные эмбрионы в одну лунку 8-луночной полоски ПЦР, установив пипетку на 1 мкл, а затем добавьте 10 мкл буфера лизиса (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl ph 8,5, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл желатина, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 мг/мл протеиназы K в не нуклеазномH2O).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте протеиназу K непосредственно перед приготовлением буфера лизиса.
    3. Чтобы лизировать эмбрионы, программируют тепловой циклер до 55 °C в течение 4 ч, а затем инактивируют протеиназу K с помощью 10-минутной инкубации при 95 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно для начинающих пользователей, попробуйте провести эксперимент по редактированию в локусах Tyr . Этот рабочий процесс оптимизирован и может служить положительным контролем. При необходимости хранят лизаты эмбриона при 4 °C в течение 2-3 дней или в морозильной камере до 2 недель до ПЦР-анализа. Предотвращение повторных циклов замораживания-оттаивания.
    4. Чтобы увеличить шансы на успешный анализ генотипирования, выполните вложенную стратегию ПЦР, амплифицируя немного более длинные фрагменты ДНК, которые обрамляют целевой сайт, а также области, которые будут использоваться для амплификации более точного фрагмента ДНК. Следуйте условиям , приведенным в дополнительной таблице 7.
    5. Следуйте приведенным ниже условиям теплового циклера:
      95 °C в течение 2 мин
      30+ циклов: 95 °C в течение 2 мин, 60 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с
      72 °C в течение 2 мин
    6. Чтобы подготовить второй этап стратегии вложенной ПЦР, производят разбавление первого продукта ПЦР в соотношении 1:10 (этап 6.2.5) и загружают 2 мкл этого в следующую реакцию ПЦР (с праймерами, предназначенными для нахождения внутри предыдущего ампликона).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первая реакция ПЦР должна быть разбавлена, чтобы уменьшить перенос фланкирующих праймеров во второй реакции ПЦР. Подготовьте вложенную ПЦР, выполнив действия, описанные в дополнительной таблице 8.
    7. Поместите реакцию ПЦР в термоциклер, используя следующие условия цикла:
      95 °C в течение 2 мин
      30 циклов: 95 °C в течение 2 мин, 60 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 10 с
      72 °C в течение 2 мин
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, >90% реакций ПЦР являются успешными, когда размер ампликона составляет 500 bp или менее.
    8. (Опциональный элемент управления) Для NHEJ-опосредованных мутаций in/del с использованием Tyr в качестве положительного контроля переваривают 10 мкл вложенных продуктов ПЦР со стадии 6.2.7 путем инкубации при 37 °C в течение 4 ч с использованием 10 ЕД HinfI в реакции 20 мкл (см. Дополнительную таблицу 9). На 2% агарозном геле запустите переваренный продукт для оценки редактирования и используйте непереваренный продукт ПЦР в качестве контроля нагрузки. Запускайте гель при 135 В в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование HinfI в качестве соответствующего фермента рестрикции было выбрано из-за удобно расположенного сайта HinfI, присутствующего в целевой области sgRNA, который, по прогнозам, будет удален после успешного редактирования NHEJ. Подробный метод и результаты были ранее описаны 9,16.
    9. (Опциональный элемент управления) Для HDR-опосредованных мутаций с использованием Tyr в качестве положительного контроля переваривайте 10 мкл вложенных продуктов ПЦР со стадии 6.2.7 путем инкубации при 37 °C в течение 4 ч с использованием 10 ЕД EcoRI в реакции 20 мкл (см. Дополнительную таблицу 10). На 2% агарозном геле запустите переваренный продукт для оценки редактирования и используйте непереваренный продукт ПЦР в качестве контроля нагрузки. Запускайте гель при 135 В в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор EcoRI в качестве диагностического фермента рестрикции использует преимущества оригинальной последовательности, обнаруженной в целевой области sgRNA, где после успешного HDR естественный сайт HinfI заменяется сайтом EcoRI, и возникает мутация сдвига кадра, которая вмешивается в ген Tyr. Для анализа HDR выполните анализ NHEJ (шаг 6.2.8) и HDR (шаг 6.2.9) на каждом образце, поскольку оба исхода могут произойти и могут помочь определить мозаицизм. Подробный метод и результаты были ранее описаны 9,16.

Результаты

Этот метод генерирует более 100 мкг сгРНК (20 мкл при концентрации >6000 нг/л) для эффективной сборки РНП Cas9/sgRNA. Обычный метод суперовуляции, описанный здесь, обычно производит 10-20 жизнеспособных эмбрионов на закупоренную самку. Из-за ошибок обработки и типичных потерь, связанных с манипуляц?...

Обсуждение

Здесь представлена простая и высокоэффективная технология редактирования генома мыши. Электропорация может быть использована для генерации модифицированных эмбрионов за 1-2 недели (рисунок 1) и может производить отредактированных мышей в течение 6 недель9....

Раскрытие информации

Соответствующих финансовых деклараций авторов нет.

Благодарности

A.J.M. создал оригинальную концепцию, которая привела к разработке CRISPR-EZ и произвел цифры. C.K.D. составил и адаптировал внутренние и опубликованные протоколы для этой текущей рукописи. A.J.M. поддерживается NIH (R00HD096108).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-cm-gap electroporation cuvetteBio-Radcat. no. 1652089Electroporation
26-G, 1/2-inch needleBDcat. no. 305111Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female miceJAXcat. no. 000664Superovulation
35-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 627-160Embryo Culture
60-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 628-160Embryo Processing
6x loading dyeThermo Fisher Scientificcat. no. R0611sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture gradeSigma-Aldrich,cat. no. T1788Embryo Processing
BSA, embryo culture gradeSigma-Aldrichcat. no. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 proteinAlt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLScat. no. 1074181Electroporation
DNase I, RNase-freeNew England BioLabs,cat. no. M0303sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)Gibcocat. no. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBcat. no. R3101SGenotyping
EDTA, anhydrousSigma-Aldrichcat. no. EDS-100GRNP Buffer
EthanolKopteccat. no. V1016sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory gradeFisher,cat. no. G7-500Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology gradeFishercat. no. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegacat. no. M712Genotyping
HEPES, cell culture gradeSigma-Aldrichcat. no. H4034RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)NEBcat. no. R0155SGenotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,cat. no. E2040sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)Milliporecat. no. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2Milliporecat. no. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)Zenith Biotechcat. no. ZEKS-050Embryo Culture
LE agarose, analytical gradeBioExpresscat. no. E-3120-500sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 mediumZenith Biotechcat. no. ZFM2-050Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)Sigma-Aldrichcat. no. M8266RNP and Lysis Buffer
Mineral OilMilliporecat. no. ES-005CEmbryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)Sigma-Aldrichcat. no. 74385Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology gradeAmbioncat. no. AM9937sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotypingIntegrated DNA Technologiescustom orderssgRNA Design
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientificcat. no. 31985062Embryo Culture
High-fidelity DNA polymeraseNew England BioLabs,cat. no. M0530sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)Sigma-Aldrichcat. no. P9333RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)ProspecBiocat. no. HOR-272Superovulation
Proteinase K, molecular-biology gradeFishercat. no. BP1700-100Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubeVWRcat. no. 20170-333sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubesVWRcat. no. 82006-606sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beadsGE Healthcarecat. no. 65152105050250sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrichcat. no. C4706RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology gradeTeknovacat. no. T1085Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology gradeSigma-Aldrichcat. no. P7949-500Lysis Buffer

Ссылки

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены