JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Résumé

Avec une efficacité, une précision et une facilité exceptionnelles, le système CRISPR / Cas9 a considérablement amélioré l’édition du génome dans la culture cellulaire et les expériences sur des animaux de laboratoire. Lors de la génération de modèles animaux, l’électroporation des zygotes offre une efficacité, une simplicité, un coût et un débit supérieurs à la méthode de référence de la micro-injection. L’électroporation est également plus douce, avec une plus grande viabilité, et délivre de manière fiable des ribonucléoprotéines (RNP) Cas9 / ARN monoguide (sgRNA) dans les zygotes de souches de souris de laboratoire courantes (par exemple, C57BL / 6J et C57BL / 6N) qui approche 100% d’efficacité de livraison. Cette technique permet des mutations d’insertion/délétion (indels), des mutations ponctuelles, la délétion de gènes entiers ou d’exons, et de petites insertions dans la plage de 100-200 bp pour insérer LoxP ou des étiquettes courtes comme FLAG, HA ou V5. Bien qu’en constante amélioration, nous présentons ici l’état actuel de CRISPR-EZ dans un protocole qui comprend la production d’ARNg par transcription in vitro , traitement embryonnaire, assemblage RNP, électroporation et génotypage d’embryons préimplantatoires. Un chercheur de niveau supérieur avec une expérience minimale de la manipulation d’embryons peut obtenir des embryons génétiquement modifiés en moins de 1 semaine en utilisant ce protocole. Ici, nous proposons une méthode simple, peu coûteuse, efficace et de grande capacité qui pourrait être utilisée avec des embryons de souris.

Introduction

L’édition du génome chez la souris vivante a été considérablement simplifiée et est devenue accessible et plus abordable depuis l’émergence de l’édition CRISPR 1,2,3. Les premières tentatives d’édition animale ont utilisé la micro-injection pour délivrer l’ARNm/ARNsg CRISPR Cas9 dans des embryons au stade pronucléaire 4,5,6. Bien que la micro-injection soit assez efficace, la quantité de pratique requise pour la maîtriser pleinement pourrait ne pas convenir aux stagiaires et aux étudiants et nécessite également un équipement coûteux qu’un laboratoire modestement financé n’est pas en mesure de se permettre. La micro-injection est normalement effectuée par des techniciens experts dans des installations transgéniques dont les horaires et les prix des services limitent le taux pour de nombreux chercheurs. Une approche plus accessible est celle de l’électroporation, qui s’est avérée très efficace pour l’administration de l’ARNm/ARNsg Cas9 CRISPR dans des embryons au stade pronucléaire7. D’autres améliorations dans les stratégies d’édition et de livraison du génome CRISPR suggèrent que les RNP pré-assemblés déjà engagés avec des sgRNA peuvent être un moyen efficace de réduire le mosaïcisme8.

La raison d’être de l’élaboration et de l’utilisation de ce protocole était de contourner bon nombre des limites et des obstacles associés à la micro-injection. Comme son nom l’indique, une méthode simple, interne et rentable qui pourrait rapidement déterminer si des conceptions d’ARNg non testées vaudraient la peine d’être utilisées lors d’une expérience de micro-injection serait une étape de contrôle de la qualité de premier passage très pratique (Figure 1). Bien que cette méthode ne puisse pas remplacer la microinjection pour des stratégies plus complexes, comme l’introduction de longues séquences d’ADN de donneur pour des résultats basés sur la recombinaison, elle est idéale pour les stratégies moins complexes telles que les petites délétions ou insertions et le marquage des gènes. Cette méthode convient aux chercheurs ayant des compétences de base en manipulation d’embryons qui ont des besoins d’édition simples, qui souhaitent tester leur hypothèse dans le délai de développement préimplantatoire ou préfèrent tester les ARNg dans les embryons avant de prendre rendez-vous avec un spécialiste de la micro-injection. Ici, les réactifs d’édition sont délivrés transitoirement dans des embryons au stade pronucléaire sous forme de RNP Cas9 / sgRNA par électroporation (une série d’impulsions électriques) pour maximiser l’efficacité tout en diminuant le mosaïcisme8. En utilisant une méthode de génotypage embryonnaire, les résultats d’édition sont disponibles en environ 1 semaine9, réduisant ainsi le besoin de diverses applications de micro-injection à un coût considérablement réduit.

L’efficacité de cette méthode culmine au stade embryonnaire pronucléaire, lorsque l’embryon n’a pas encore fusionné les pronuclei maternel et paternel ou n’est pas encore entré en phase S (Figure 2). La superovulation est utilisée pour maximiser le nombre de zygotes mais produit à la fois des zygotes pronucléaires et des œufs non fécondés. Les zygotes sains peuvent également être présélectionnés avant l’électroporation pour augmenter l’efficacité globale. Comme d’autres protocoles d’électroporation ont efficacement édité les zygotes sans qu’il soit nécessaire d’inclure une étape similaire 7,10,11,12,13,14,15, une étape facultative de ce protocole est la légère érosion de la zone pellucide (ZP). Le ZP est une couche de glycoprotéine qui facilite la liaison des spermatozoïdes, la réponse acrosomique et la fécondation autour des embryons au stade pronucléaire. D’après notre expérience, nous avons constaté qu’une légère érosion à base d’acide du ZP fournit une administration fiable de l’électroporation Cas9 RNP avec seulement un impact marginal sur la viabilité.

Nous avons observé des taux d’administration de RNP allant jusqu’à 100% d’efficacité par électroporation dans des souches de souris couramment utilisées dans la recherche comme C57BL / 6J et C57BL / 6N 9,16. Des groupes indépendants ont également mis au point des procédures basées sur l’électroporation avec des rendements supérieurs ou équivalents à la microinjection 11,12,13,14,15,17, avec des protocoles d’électroporation fonctionnant bien chez le rat18,19, le porc 20,21,22 et la vache 23 , nous suggérons donc aux lecteurs de comparer les protocoles pour trouver les conditions qui répondent le mieux à leurs besoins expérimentaux et d’équipement. Le système décrit ici utilise des matériaux et des équipements communs, ne nécessitant que des compétences de base en manipulation d’embryons. Cette technique est efficace pour une gamme de stratégies de révision, ce qui rend cette méthode largement accessible à la communauté de la recherche.

La conception de petits ARN guides idéaux (ARNsg) est essentielle pour une édition efficace. Nous recommandons de dépister deux à trois stratégies d’ARNg par site cible directement dans les embryons de souris, en particulier si la génération de lignées de souris est souhaitée. Une fois conçues, les méthodes sans clonage comme la transcription in vitro (IVT) pour produire des sgRNA de haute qualité sont recommandées3. Les RNP et les ARNg sont mélangés avec 30 à 50 embryons traités au stade pronucléaire et exposés à une série d’impulsions électriques pour perméabiliser d’abord temporairement la ZP et la membrane cellulaire, puis pour maintenir les pores ouverts et électrophorèse les RNP à travers le zygote24. Après optimisation, nous avons constaté que six impulsions de 3 ms à 30 V pour les embryons en vrac (~50) étaient optimales pour l’efficacité et la viabilité de l’édition, fournissant une livraison très efficace de Cas9 / sgRNA RNP 9,16,25. Les événements d’édition dans la morula de souris individuelle peuvent être confirmés à l’aide d’une variété de stratégies de validation communes à l’édition CRISPR, telles que le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP), la digestion de l’endonucléase T7 et le séquençage de Sanger de la région d’intérêt26.

La méthode actuelle est la plus appropriée pour les schémas d’édition simples (Figure 3), tels que l’insertion/suppression (indels), les suppressions de la taille d’un exon de l’ordre de 500-2000 pb, et la livraison de mutations ponctuelles et de petites insertions telles que les balises C- ou N-Terminal (par exemple, FLAG, HA ou V5)9,16,27. Le potentiel d’édition complexe du génome, comme de grandes insertions de marqueurs fluorescents ou d’allèles conditionnels, reste incertain et fait actuellement l’objet d’améliorations à venir.

Cette méthode est facilement maîtrisable et peut être utilisée pour tester rapidement les ARNg dans des embryons de souris en culture en 1 semaine9 (Figure 1). Ce travail présente un protocole en six étapes, qui comprend 1) la conception de l’ARNg; 2) synthèse de l’ARNg; 3) la superovulation et l’accouplement; 4) la culture, la collecte et le traitement d’embryons; 5) assemblage et électroporation RNP; 6) culture embryonnaire et génotypage. Des informations sur tous les matériaux utilisés sont fournies (Tableau des matériaux). En tant que contrôle positif, les réactifs pour modifier le locus 9,16 de la tyrosinase (Tyr) ont été inclus dans le tableau supplémentaire 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Tous les soins et l’utilisation des animaux tout au long de ce protocole respectaient les politiques de la Loi sur le bien-être des animaux, le Guide ILAR pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et suivaient les directives de l’AVMA pour l’euthanasie et les directives et politiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie. Le protocole de soin et d’utilisation des animaux a été examiné et approuvé par l’IACUC de l’Université de Pennsylvanie pour ce projet. Par souci de conformité et de prudence, veuillez demander toutes les autorisations nécessaires avant d’essayer ce protocole.

1. ARNg et oligo-conception optionnelle du donneur

  1. Conception de l’ARNg
    1. Sélectionnez les sgRNA candidats parmi tous les algorithmes en ligne largement utilisés, tels que Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 ou CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Comme chaque plate-forme est unique, veuillez lire attentivement les instructions d’utilisation afin de concevoir des sgRNA idéaux. Pour les expériences in/del, sélectionnez deux à trois ARNg à tester. Pour les délétions, les sgRNA qui flanquent la région cible sont suggérés, par exemple, deux sgRNA en amont de la cible et deux sgRNA en aval de la cible.
      REMARQUE: Alors que divers algorithmes de sgRNA en ligne prennent en compte les cibles hors cibles pour éviter les conceptions imparfaites de sgRNA, l’outil BLAST de NCBI est utile pour confirmer la qualité des séquences sgRNA sélectionnées.
    2. Insérez 19-20 nucléotides (nt) déterminés à partir de l’étape précédente (1.1.1) dans la région variable de l’oligo-ARNg (tableau supplémentaire 1) et achetez l’ARNg synthétisé en tant qu’oligos d’ADN personnalisés.
      REMARQUE: La purification PAGE n’est pas nécessaire.
  2. (Facultatif) Conception d’oligo donneur pour la réparation dirigée par homologie (HDR) knock-in.
    1. Concevoir l’oligodésoxynucléotide simple brin approprié (ssODN) en fonction du résultat expérimental souhaité (mutation ponctuelle précise, insertion de loxP, insertion de petites étiquettes, etc.), en maintenant la longueur totale à 100-200 nt avec des bras d’homologie de 50 nt ou plus flanquant la région centrale.
    2. Pour assurer une plus grande efficacité de frappe, concevez l’ARNg pour qu’il soit complémentaire au ssODN30 et remplacez la séquence de motif adjacent protospacer (PAM) par une mutation silencieuse pour empêcher la coupure récurrente par l’enzyme Cas9.
    3. Commandez ssODN à l’aide de l’option oligo personnalisée.

2. Synthèse de l’ARNg

  1. Génération de modèles pour la transcription in vitro (IVT)
    1. Pour générer le modèle d’ADN pour l’IVT sgRNA par PCR, préparez une réaction IVT dans un tube de bandelette de PCR exempt d’ARNase. (voir le tableau supplémentaire 2).
    2. Utilisez les conditions suivantes du thermocycleur :
      95 °C pendant 2 min; 30 cycles de 95 °C pendant 2 min, 57 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 10 s; puis 72 °C pendant 2 min
    3. Pour vérifier le succès de la réaction PCR matrice d’ADN de l’ARNg, l’électrophorèse 5 μL du produit combiné avec 1 μL de colorant de chargement 6x sur un gel d’agarose à 2% (pt / vol).
      REMARQUE : La taille prévue du produit est de 127 pb. Toute réaction PCR restante peut être conservée à -20 °C jusqu’à 5 mois.
  2. Transcription in vitro (IVT) de l’ARNg
    1. Pour générer l’ARNg, préparez le mélange réactionnel (T7 IVT selon les instructions du fabricant) dans un tube PCR et effleurez pour mélanger les réactifs.
      REMARQUE : reportez-vous au tableau supplémentaire 3 pour obtenir l’exemple de configuration de la réaction. La réaction IVT est sensible à la contamination par la RNase; par conséquent, faites tous les efforts possibles pour fournir un environnement sans RNase.
    2. Pour permettre à la réaction de s’amorcer et de se poursuivre, incuber le mélange réactionnel IVT pendant >18 h à 37 °C dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
    3. Pour dégrader la matrice d’ADN originale (étape 2.1.3), introduire 1 μL de DNase I (2 unités par réaction) et incuber la réaction pendant 20 min à température ambiante (RT).
    4. Pour favoriser la liaison de l’ARN aux billes de purification magnétique, combinez 129 μL d’éthanol à 100% dans la réaction, qui sera maintenant de 150 μL.
    5. Pour remettre en suspension les billes de purification, qui ont tendance à se déposer pendant le stockage, vortex l’aliquote pendant au moins 10 s.
    6. Pour purifier les ARNg, ajouter 100 μL des billes en suspension (étape 2.2.5) à la réaction IVT (étape 2.2.4) et mélanger doucement en pipetant de haut en bas 10x.
    7. Pour permettre la liaison, laisser reposer le mélange à TA pendant 5 min.
    8. Pour isoler l’ARNg des produits de réaction non incorporés, placez la réaction sur les supports magnétiques pendant 5 minutes à TA et attendez qu’une petite pastille se forme.
    9. Pour laver les ARNg, jetez d’abord soigneusement le surnageant, puis ajoutez 200 μL d’éthanol à 80% loin de la pastille.
      REMARQUE: Pendant l’étape de lavage à 80% (vol/vol) d’éthanol, il est essentiel d’éviter de perturber la pastille par pipetage, car cela réduira considérablement les concentrations d’ARNg. Au lieu de cela, pipeter doucement l’éthanol à 80% afin que la pastille soit immergée, et retirer doucement le volume avec une pipette.
    10. Répétez l’étape précédente (étape 2.2.9) et séchez la pastille à l’air libre pendant 5-6 minutes au maximum, sinon l’ARNg sera associé en permanence aux billes.
    11. Éluer l’ARNg avec 20 μL d’eau sans nucléase en pipetant la pastille 10x, en l’incubant pendant 2 minutes à (RT), puis en la replaçant sur le support magnétique pour séparer les billes de l’ARNg maintenant purifié.
    12. Pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARNg, utilisez un instrument comme un spectrophotomètre ou un bioanalyseur. Alternativement, sur un gel d’agarose à 2%, exécutez 2 μL d’ARNg, comme à l’étape 2.1.3.
      REMARQUE: La qualité est confirmée par une seule bande claire. Le reste de l’ARNg peut être utilisé immédiatement ou stocké dans des conditions de -80 °C.

3. Superovulation

  1. Pour fournir suffisamment d’embryons pour tester chaque conception d’ARNG, superovulez deux à trois femelles C57BL/6J âgées de 3 à 5 semaines, comme décrit précédemment9. L’électroporation de 20 à 30 embryons par ARNg est recommandée pour générer suffisamment de résultats pour confirmer l’efficacité.
    NOTE: Si la fécondation réussit, attendez-vous à 10-20 embryons par accouplement.
  2. Pour induire l’ovulation, suivez ce calendrier d’injection d’hormones:
    1. Jour 1: Administrer 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) (100 μL) par injection intrapéritonéale (IP) à l’aide d’une seringue de 26 G à des souris femelles âgées de 3 à 5 semaines.
    2. Jour 3: Après 46-48 h d’injection de PMSG, injecter 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) (100 μL) par injection IP pour induire l’ovulation.
    3. Pour mettre en place la reproduction, jumeler les femelles 1:1 avec un mâle de reproduction fiable juste après l’injection d’hCG.
      REMARQUE: Pour empêcher les hormones de se dégrader et de perdre de l’activité, effectuez des injections moins de 30 minutes de décongélation.

4. Collecte et traitement des embryons

  1. Collecte d’embryons
    1. Pour euthanasier les femelles et récupérer le matériel nécessaire, tel que décrit précédemment31, assurez-vous d’abord de confirmer la méthode appropriée conformément aux politiques de l’établissement. Par exemple, utilisez l’asphyxie au CO2 , la luxation cervicale et/ou d’autres méthodes approuvées.
      REMARQUE: Normalement, >75% des femelles stimulées par les hormones présentent des bouchons copulatoires, indiquant un accouplement réussi.
    2. Pour éviter que les poils ne rendent difficile la collecte de tissus, placez les femelles euthanasiées sur le dos et vaporisez de l’éthanol à 70% (vol/vol) sur la région de l’abdomen pour l’ouvrir chirurgicalement.
      REMARQUE: À partir de ce moment, il est conseillé d’effectuer les étapes chirurgicales dans une hotte ventilée afin de maintenir un environnement aseptique et de réduire le risque de contamination.
    3. Pour ouvrir la cavité abdominale et enlever les oviductes, coupez la couche peau / cheveux (sous-cutanée) avec des ciseaux chirurgicaux et localisez les ovaires (Figure 4), qui se trouvent près du rein et partagent une section d’un coussinet adipeux. Les oviductes sont situés à proximité des ovaires (Figure 4). Retirer chirurgicalement les deux oviductes de la femelle et les placer dans des gouttelettes individuelles de 50 μL de milieu M2+BSA (4 mg/mL de BSA) (figure 5A).
      REMARQUE : Les instructions détaillées pour cette section de la procédure peuvent être visualiséesvisuellement 31 ou suivies étape9 à l’aide de protocoles publiés précédemment.
    4. Pour libérer les complexes cumulus-ovocytes (CoC) contenant des ovocytes (Figure 4), utilisez des pinces à dissection pour entailler l’ampoule de l’oviducte tout en regardant à travers un stéréomicroscope.
    5. Pour réduire la quantité de débris (sang, graisse, tissu), transférez et combinez chaque CoC dans une seule gouttelette de 50 μL de milieu M2+BSA avec une pipette portative réglée à 20-30 μL pour éviter le transfert de débris.
  2. Élimination des cellules cumulus
    1. Pour commencer l’élimination des cellules cumulus des zygotes (Figure 4), transférer les CoC avec le moins de milieu supplémentaire possible dans une gouttelette de 100 μL M2+hyaluronidase (Figure 5B), et mélanger doucement en pipetant les CoC jusqu’à ce que les embryons soient visiblement séparés des cellules cumulus beaucoup plus petites. Assurez-vous de réduire au minimum l’exposition de M2+hyaluronidase aux embryons, car cela pourrait avoir un impact sur la viabilité.
      NOTE: On peut soit préchauffer (37 ° C) ou ajouter 50 μL supplémentaires de M2 + hyaluronidase si les embryons ne se séparent pas des cellules cumulus dans les 2 minutes.
    2. Pour diluer la hyaluronidase et éliminer les cellules cumulus lâches des zygotes, utilisez une pipette buccale pour déplacer les zygotes vers une gouttelette fraîche de 50 μL M2 + BSA.
      REMARQUE : La plupart des étapes au-delà de ce point nécessitent l’utilisation d’une pipette à commande buccale, sauf indication contraire. Bien que le risque de contamination par l’utilisateur soit faible, l’utilisation d’un filtre à air en ligne est recommandée pour maintenir un environnement aseptique. Veuillez vous référer aux méthodes décrites précédemment pour préparer et utiliser cet instrument 9,31.
    3. À l’aide d’une pipette buccale, faire passer les embryons dans au moins quatre à cinq gouttelettes supplémentaires de 50 μL M2 + BSA pour réduire le nombre de cumulus.
  3. (FACULTATIF) Amincissement de la zone pellucide avec une solution de tyrode acide (AT).
    1. Pour éroder la zone pellucide de l’embryon et réduire les obstacles physiques supplémentaires à l’administration de réactifs, transférer les embryons dans une gouttelette préchauffée (37 °C) de 100 μL de solution d’AT sur une plaque de 60 mm (figure 5C). Observer en continu les zygotes à l’aide d’un stéréomicroscope jusqu’à ce qu’environ 30% de la zone pellucide soit érodée9. L’exposition totale à l’AT doit être de 60 à 90 s. Une exposition prolongée à l’AT peut dissoudre entièrement la zone pellucide et compromettre la viabilité de l’embryon.
      NOTE: Pour des instructions détaillées et des images de cette section de la procédure, veuillez vous référer aux méthodespubliées précédemment 9,16.
    2. Pour diluer l’AT, utilisez une pipette buccale pour faire passer les embryons à travers au moins quatre gouttelettes de 50 μL de M2 + BSA.
    3. Pour déterminer si un nombre approprié d’embryons ont été traités, utilisez un stéréomicroscope pour compter les embryons. Selon le nombre de souris femelles utilisées, on peut s’attendre à environ 10 à 20 zygotes viables par femelle.
      NOTE: À ce stade, les embryons doivent être relativement exempts de débris qui empêcheraient l’évaluation de la quantité et de la qualité. Par exemple, si l’on utilise cinq femelles, le nombre de zygotes attendu se situerait probablement entre 50 et 100, et un compteur de cellules mécaniques serait approprié pour suivre les embryons. Il est fréquent de perdre environ 10% à 20% des embryons en raison de l’absence de fécondation ou de l’ovulation d’ovocytes de mauvaise qualité. Au cours de l’étape suivante, conservez brièvement les embryons dans 50 μL de M2 + BSA pendant 30 minutes au maximum dans un incubateur.

5. Assemblage et électroporation RNP

  1. Assemblage RNP
    1. Pour assembler le complexe RNP, utilisez les exemples de tableaux ci-joints pour combiner les mélanges réactionnels appropriés en fonction de la stratégie d’édition souhaitée dans le tampon RNP (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glycérol et 100 mM chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine [TCEP] dans de l’eau sans nucléase)
      NOTE: Le PTCE est un agent réducteur pratique, mais a une demi-vie courte dans les solutions aqueuses; par conséquent, ajoutez le TCEP juste avant l’assemblage du complexe RNP.
      1. Pour les indels non homologues médiés par l’assemblage final (NHEJ), se reporter au tableau supplémentaire 4.
      2. Pour l’édition assistée par homologie (HDR), reportez-vous au tableau supplémentaire 5.
      3. Pour les délétions techniques utilisant des sgRNA appariés, reportez-vous au tableau supplémentaire 6.
        1. Quelle que soit la stratégie, combinez les réactifs souhaités à RT dans un tube de PCR.
        2. Pour permettre la formation du complexe RNP, incuber le mélange pendant 10 min à 37 °C.
          REMARQUE: Le complexe RNP peut être stocké à RT jusqu’à 1 h.
  2. Électroporation
    1. Pour diluer le BSA avant l’électroporation, faire passer les embryons à travers au moins deux gouttelettes de 50 μL de milieux sériques réduits.
      REMARQUE: BSA augmente la résistance pendant l’électroporation et pourrait endommager les zygotes.
    2. Pour préparer et mélanger les zygotes (étape 4.3.2) avec le complexe RNP (étape 5.1.1.2) pour l’électroporation, pipette buccale 25-30 embryons dans une gouttelette de 10 μL de milieux sériques réduits, puis utiliser une pipette portative pour ajouter 10 μL du complexe RNP (étape 5.1.1.2).
    3. Pour diluer le glycérol visqueux du complexe RNP et homogénéiser l’échantillon, mélanger en pipetant 10x ou jusqu’à ce que le mélange ne présente plus de signes de viscosité (motif de tourbillon) à l’aide d’un stéréomicroscope.
    4. Pour préparer l’échantillon à insérer dans l’électroporateur, pipeter ce mélange embryon + RNP de 20 μL dans une cuvette d’électroporation de 0,1 cm tout en évitant les bulles.
    5. Pour délivrer les réactifs d’édition dans le zygote, électroporate les embryons en utilisant un protocole d’onde carrée avec ces conditions: 30 V, 4-6 impulsions, 3 ms de longueur d’impulsion et 100 intervalles d’impulsions.
    6. Pour récupérer les zygotes de la cuvette, utilisez une pipette à main pour délivrer 50 μL de KSOM + BSA (1 mg / mL de BSA) dans le haut de la cuvette pour rincer les embryons qui peuvent s’être déposés au fond. Introduire délicatement ce mélange sur une plaque de 60 mm.
    7. Répéter l’étape 5.2.6 au moins 2x-3x et combiner chaque rinçage sur une plaque de 60 mm jusqu’à ce que la plupart des embryons soient récupérés.
      REMARQUE: Une récupération typique représente >90% des embryons chargés à l’origine. Pour assurer la survie de l’embryon, testez l’incubateur et vérifiez les dates de péremption de tous les réactifs. Les embryons sont sensibles à des conditions de culture non idéales telles que la température, le niveau de CO2 , l’humidité et le pH.

6. Culture embryonnaire et génotypage

  1. Culture d’embryons
    1. Pour mettre en culture les zygotes au stade souhaité, utiliser une pipette buccale pour transférer 20 à 30 zygotes dans une gouttelette de KSOM + BSA dans une plaque de culture prééquilibrée et déplacer les embryons vers la gouttelette (Figure 5D). Incuber la plaque pendant une nuit dans 5% de CO2, à 37 °C, avec 95% d’humidité.
      NOTA : Prééquilibrer en plaçant une plaque de culture préparée de 35 mm dans un incubateur la veille ou au moins 4 heures avant l’incubation (figure 5D).
    2. Pour favoriser des conditions de croissance idéales, transférer uniquement les embryons à deux cellules le lendemain dans une gouttelette fraîche de mélange KSOM + BSA à l’aide d’un stéréomicroscope et retourner à l’incubateur. Assurez-vous de laisser ou de jeter les embryons morts ou non fécondés.
      NOTE: Les embryons au stade pronucléaire se développent généralement en morulae après 72 h de culture et en blastocystes après 84 heures.
  2. Génotypage
    1. Pour diluer les composants du milieu qui pourraient interférer avec une réaction de PCR, laver les embryons de morula/blastocyste à l’aide d’une pipette buccale en passant à travers deux gouttes de DPBS.
    2. Pour charger des embryons uniques pour la lyse, transférer les embryons individuels dans un puits d’une bandelette de PCR à 8 puits en plaçant une pipette à 1 μL, puis ajouter 10 μL de tampon de lyse (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg/mL gélatine, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20,0,2 mg/mL protéinase K dansH2Osans nucléase).
      REMARQUE: Ajouter la protéinase K juste avant de préparer le tampon de lyse.
    3. Pour lyser les embryons, programmer un thermocycleur à 55 °C pendant 4 h, puis inactiver la protéinase K avec une incubation de 10 min à 95 °C.
      REMARQUE: En particulier pour les nouveaux utilisateurs, essayez une expérience d’édition au Tyr loci. Ce flux de travail a été optimisé et peut servir de contrôle positif. Si nécessaire, conservez les lysats embryonnaires à 4 °C pendant 2-3 jours ou au congélateur jusqu’à 2 semaines avant l’analyse PCR. Prévenir les cycles répétés de gel-dégel.
    4. Pour augmenter les chances de réussite de l’analyse de génotypage, effectuez une stratégie de PCR imbriquée en amplifiant des fragments d’ADN légèrement plus longs qui flanquent le site ciblé ainsi que des régions qui seront utilisées pour amplifier un fragment d’ADN plus précis. Suivez les conditions du tableau supplémentaire 7.
    5. Suivez les conditions de thermocycleur mentionnées ci-dessous:
      95 °C pendant 2 min
      30+ cycles : 95 °C pendant 2 min, 60 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 10 s
      72 °C pendant 2 min
    6. Pour préparer la deuxième étape d’une stratégie de PCR imbriquée, effectuez une dilution 1:10 du premier produit de PCR (étape 6.2.5) et chargez 2 μL de celui-ci dans la réaction PCR suivante (avec des amorces conçues pour être à l’intérieur de l’amplicon précédent).
      NOTE: La première réaction PCR doit être diluée pour réduire le transfert des amorces latérales dans la deuxième réaction PCR. Préparez la PCR imbriquée en suivant les étapes du tableau supplémentaire 8.
    7. Placer la réaction PCR dans un thermocycleur en utilisant les conditions de cyclage suivantes :
      95 °C pendant 2 min
      30 cycles : 95 °C pendant 2 min, 60 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 10 s
      72 °C pendant 2 min
      REMARQUE: Normalement, >90% des réactions PCR réussissent lorsque la taille de l’amplicon est de 500 pb ou moins.
    8. (Contrôle facultatif) Pour les mutations in/del médiées par NHEJ utilisant Tyr comme témoin positif, digérer 10 μL des produits de PCR imbriqués de l’étape 6.2.7 en incubant à 37 °C pendant 4 h en utilisant 10 U de HinfI dans une réaction de 20 μL (voir le tableau supplémentaire 9). Sur un gel d’agarose à 2 %, exécutez le produit digéré pour évaluer l’édition et utilisez un produit PCR non digéré comme contrôle de charge. Faites fonctionner le gel à 135 V pendant 30 min.
      NOTE: L’utilisation de HinfI comme enzyme de restriction appropriée a été choisie en raison d’un site HinfI idéalement situé présent dans la région cible de l’ARNg qui devrait être ablé après une édition NHEJ réussie. Une méthode détaillée et des résultats ont déjà été décrits 9,16.
    9. (Contrôle facultatif) Pour les mutations médiées par HDR utilisant Tyr comme témoin positif, digérer 10 μL des produits de PCR imbriqués de l’étape 6.2.7 en incubant à 37 °C pendant 4 h en utilisant 10 U d’EcoRI dans une réaction de 20 μL (voir le tableau supplémentaire 10). Sur un gel d’agarose à 2 %, exécutez le produit digéré pour évaluer l’édition et utilisez un produit PCR non digéré comme contrôle de charge. Faites fonctionner le gel à 135 V pendant 30 min.
      REMARQUE: Le choix d’EcoRI comme enzyme de restriction diagnostique tire parti de la séquence originale trouvée dans la région cible de l’ARNg, où, en cas de HDR réussi, le site HinfI naturel est remplacé par un site EcoRI, et une mutation de décalage de trame est forcée qui interfère avec le gène Tyr. Pour l’analyse HDR, effectuer des analyses NHEJ (étape 6.2.8) et HDR (étape 6.2.9) sur chaque échantillon, car les deux résultats peuvent se produire et aider à déterminer le mosaïcisme. Une méthode détaillée et des résultats ont déjà été décrits 9,16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Cette méthode génère plus de 100 μg d’ARNg (20 μL à >concentration de 6 000 ng/L) pour un assemblage efficace de RNP Cas9/sgRNA. La méthode de superovulation de routine décrite ici produit généralement 10 à 20 embryons viables par femelle bouchée. En raison des erreurs de manipulation et des pertes typiques associées à la manipulation des embryons, on s’attend à ce que 80% des embryons soient fécondés, viables et en excellent état après électroporation. Pour aider les chercheurs à exécuter une e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Présenté ici est une technologie d’édition du génome de souris simple et très efficace. L’électroporation peut être utilisée pour générer des embryons modifiés en 1-2 semaines (Figure 1) et peut produire des souris éditées en 6 semaines9. Par rapport aux protocoles basés sur l’électroporation développés simultanément qui délivrent des RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, la méthode décrite ici est conceptuellement similaire et offre des rendements...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de déclarations financières pertinentes des auteurs.

Remerciements

A.J.M. a créé le concept original qui a conduit au développement de CRISPR-EZ et a produit les figurines. C.K.D. a compilé et adapté les protocoles internes et publiés pour ce présent manuscrit. A.J.M. est pris en charge par NIH (R00HD096108).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-cm-gap electroporation cuvetteBio-Radcat. no. 1652089Electroporation
26-G, 1/2-inch needleBDcat. no. 305111Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female miceJAXcat. no. 000664Superovulation
35-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 627-160Embryo Culture
60-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 628-160Embryo Processing
6x loading dyeThermo Fisher Scientificcat. no. R0611sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture gradeSigma-Aldrich,cat. no. T1788Embryo Processing
BSA, embryo culture gradeSigma-Aldrichcat. no. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 proteinAlt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLScat. no. 1074181Electroporation
DNase I, RNase-freeNew England BioLabs,cat. no. M0303sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)Gibcocat. no. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBcat. no. R3101SGenotyping
EDTA, anhydrousSigma-Aldrichcat. no. EDS-100GRNP Buffer
EthanolKopteccat. no. V1016sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory gradeFisher,cat. no. G7-500Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology gradeFishercat. no. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegacat. no. M712Genotyping
HEPES, cell culture gradeSigma-Aldrichcat. no. H4034RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)NEBcat. no. R0155SGenotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,cat. no. E2040sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)Milliporecat. no. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2Milliporecat. no. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)Zenith Biotechcat. no. ZEKS-050Embryo Culture
LE agarose, analytical gradeBioExpresscat. no. E-3120-500sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 mediumZenith Biotechcat. no. ZFM2-050Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)Sigma-Aldrichcat. no. M8266RNP and Lysis Buffer
Mineral OilMilliporecat. no. ES-005CEmbryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)Sigma-Aldrichcat. no. 74385Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology gradeAmbioncat. no. AM9937sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotypingIntegrated DNA Technologiescustom orderssgRNA Design
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientificcat. no. 31985062Embryo Culture
High-fidelity DNA polymeraseNew England BioLabs,cat. no. M0530sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)Sigma-Aldrichcat. no. P9333RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)ProspecBiocat. no. HOR-272Superovulation
Proteinase K, molecular-biology gradeFishercat. no. BP1700-100Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubeVWRcat. no. 20170-333sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubesVWRcat. no. 82006-606sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beadsGE Healthcarecat. no. 65152105050250sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrichcat. no. C4706RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology gradeTeknovacat. no. T1085Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology gradeSigma-Aldrichcat. no. P7949-500Lysis Buffer

Références

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474(2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554(2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069(2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888(2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811(2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406(2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081(2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87(2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47(2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92(2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703(2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479(2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biologie du d veloppementnum ro 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.