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요약

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

초록

탁월한 효율성, 정확성 및 용이성을 갖춘 CRISPR/Cas9 시스템은 세포 배양 및 실험실 동물 실험에서 게놈 편집을 크게 개선했습니다. 동물 모델을 생성할 때 접합체의 전기천공은 미세 주입의 황금 표준 방법의 대안으로 더 높은 효율성, 단순성, 비용 및 처리량을 제공합니다. 전기천공은 또한 더 부드럽고 생존력이 높으며 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보핵단백질(RNP)을 100% 전달 효율에 근접하는 일반적인 실험실 마우스 균주(예: C57BL/6J 및 C57BL/6N)의 접합체에 안정적으로 전달합니다. 이 기술은 삽입/결실(indels) 돌연변이, 점 돌연변이, 전체 유전자 또는 엑손의 결실, LoxP 또는 FLAG, HA 또는 V5와 같은 짧은 태그를 삽입하기 위해 100-200bp 범위의 작은 삽입을 가능하게 합니다. 지속적으로 개선되고 있는 한편, 여기에서는 시험관 내 전사, 배아 처리, RNP 조립, 전기천공 및 착상 전 배아의 유전형 분석을 통한 sgRNA 생산을 포함하는 프로토콜에서 CRISPR-EZ의 현재 상태를 제시합니다. 배아 조작 경험이 거의 없는 대학원 수준의 연구원은 이 프로토콜을 사용하여 1주일 이내에 유전자 편집 배아를 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스 배아와 함께 사용할 수 있는 간단하고 저렴하며 효율적인 고용량 방법을 제공합니다.

서문

살아있는 마우스에서의 게놈 편집은 상당히 단순화되었으며 CRISPR 편집 1,2,3의 출현 이후 접근 가능하고 저렴해졌습니다. 초기 동물 편집 시도는 CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA를 핵단계 배아 4,5,6에 전달하기 위해 미세 주입을 사용했습니다. 미세 주입은 매우 효과적이지만 완전히 마스터하는 데 필요한 연습량은 연수생과 학생에게 적합하지 않을 수 있으며 적당한 자금 지원을 받는 실험실에서는 감당할 수 없는 값비싼 장비가 필요합니다. 미세 주사는 일반적으로 많은 연구자에게 속도 제한적인 일정과 서비스 가격으로 형질 전환 시설의 전문 기술자가 수행합니다. 보다 접근하기 쉬운 접근법은 CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA를 핵 단계 배아7로 전달하는 데 매우 효과적인 것으로 입증 된 전기 천공법입니다. CRISPR 게놈 편집 및 전달 전략의 추가 개선은 이미 sgRNA와 결합된 사전 조립된 RNP가모자이크주의를 감소시키는 효과적인 수단이 될 수 있음을 시사했습니다8.

이 프로토콜의 개발 및 사용의 근거는 미세 주입과 관련된 많은 한계와 장애물을 우회하는 것이 었습니다. 이름에서 알 수 있듯이 미세주입 실험 중에 테스트되지 않은 sgRNA 설계가 가치가 있는지 여부를 신속하게 결정할 수 있는 쉽고 비용 효율적인 사내 방법은 매우 편리한 1차 통과 품질 관리 단계가 될 것입니다(그림 1). 이 방법은 재조합 기반 결과를 위해 긴 기증자 DNA 서열을 도입하는 것과 같은 더 복잡한 전략에 대한 미세 주입을 대체할 수는 없지만 작은 결실 또는 삽입 및 유전자 태깅과 같은 덜 복잡한 전략에는 이상적입니다. 이 방법은 간단한 편집이 필요하거나, 착상 전 발달 기간 내에 가설을 테스트하거나, 미세 주입 전문가와 약속을 잡기 전에 배아에서 sgRNA를 테스트하는 것을 선호하는 기본적인 배아 조작 기술을 가진 연구자에게 적합합니다. 여기에서 편집 시약은 전기천공(일련의 전기 펄스)을 통해 Cas9/sgRNA RNP로 핵 단계 배아에 일시적으로 전달되어모자이크를 줄이면서 효율성을 극대화합니다8. 배아 유전형 분석 방법을 사용하면 약 1주일 만에 편집 결과를 얻을 수 있습니다.9 따라서 크게 절감된 비용으로 다양한 미세 주입 응용 분야의 필요성을 줄일 수 있습니다.

이 방법의 효과는 배아가 아직 모계와 부계 전핵을 융합하지 않았거나 S기에 진입하지 않은 전핵 배아 단계에서 최고조에 달합니다(그림 2). 과배란은 접합체의 수를 최대화하는 데 사용되지만 전핵 접합체와 수정되지 않은 난자를 모두 생성합니다. 건강한 접합체는 또한 전체 효율을 높이기 위해 전기 천공 전에 미리 선택할 수 있습니다. 다른 전기천공 프로토콜이 유사한 단계 7,10,11,12,13,14,15를 포함할 필요 없이 접합체를 효율적으로 편집함에 따라, 이 프로토콜의 선택적 단계는 조나 펠루시다(ZP)의 약간의 침식이다. ZP는 핵 단계 배아를 둘러싼 정자 결합, 선체 반응 및 수정을 돕는 당 단백질 층입니다. 우리의 경험에서, 우리는 ZP의 부드러운 산 기반 침식이 생존력에 미미한 영향으로 신뢰할 수있는 Cas9 RNP 전기 천공 전달을 제공한다는 것을 발견했습니다.

우리는 C57BL/6J 및 C57BL/6N 9,16과 같은 연구에서 일반적으로 사용되는 마우스 균주에서 전기천공을 통해 최대 100% 효율의 RNP 전달 속도를 관찰했습니다. 독립적 인 그룹은 또한 미세 주입 11,12,13,14,15,17보다 크거나 일치하는 효율을 가진 전기 천공 기반 절차를 개발했으며, 전기 천공 프로토콜은 쥐18,19, 돼지 20,21,22 및 소 23에서 잘 작동합니다. 따라서 독자는 프로토콜을 비교하여 실험 및 장비 요구 사항에 가장 적합한 조건을 찾는 것이 좋습니다. 여기에 설명 된 시스템은 일반적인 재료와 장비를 사용하므로 기본적인 배아 조작 기술 만 필요합니다. 이 기술은 다양한 편집 전략에 효과적이므로 연구 커뮤니티에서 이 방법에 광범위하게 액세스할 수 있습니다.

이상적인 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하는 것은 효율적인 편집을 위해 필수적입니다. 특히 마우스 라인 생성이 필요한 경우 마우스 배아에서 직접 표적 부위당 2-3개의 sgRNA 전략을 스크리닝하는 것이 좋습니다. 일단 설계되면 고품질 sgRNA를 생산하기 위해 체외 전사(IVT)와 같은 클로닝 없는 방법을 권장합니다3. RNP 및 sgRNA는 30-50개의 처리된 핵 단계 배아와 혼합되고 일련의 전기 펄스에 노출되어 먼저 ZP 및 세포막을 일시적으로 투과화하고, 후속 펄스는 기공을 열린 상태로 유지하고 접합체(24)를 통해 RNP를 전기영동합니다. 최적화 후, 우리는 벌크 배아(~50)에 대해 30V에서 6개의 3ms 펄스가 편집 효율성과 생존력에 최적이며 매우 효율적인 Cas9/sgRNA RNP 전달 9,16,25를 제공한다는 것을 발견했습니다. 개별 마우스 모룰라에서의 편집 이벤트는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), T7 엔도뉴클레아제 소화 및 관심 영역26의 Sanger 시퀀싱과 같은 CRISPR 편집에 공통적인 다양한 검증 전략을 사용하여 확인할 수 있습니다.

현재의 방법은 삽입/삭제(indels), 500-2000bp 정도의 엑손 크기 결실, 점 돌연변이 및 C- 또는 N-말단 태그(예: FLAG, HA 또는 V5)9,16,27과 같은 작은 삽입의 전달과 같은 간단한 편집 체계(그림 3)에 가장 적합합니다. 형광 태그 또는 조건부 대립 유전자의 대규모 삽입과 같은 복잡한 게놈 편집의 가능성은 여전히 불확실하며 향후 개선의 현재 초점입니다.

이 방법은 쉽게 마스터할 수 있으며1주일 만에 배양된 마우스 배아에서 sgRNA를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다9(그림 1). 이 연구에서는 1) sgRNA 디자인을 포함하는 6 단계 프로토콜이 제시됩니다. 2) sgRNA 합성; 3) 과배란 및 짝짓기; 4) 배아 배양, 수집 및 가공; 5) RNP 조립 및 전기 천공; 6) 배아 배양 및 유전형 분석. 사용 된 모든 재료에 대한 정보가 제공됩니다 (재료 표). 양성 대조군으로서, 티로시나제(Tyr) 유전자좌 9,16을 편집하는 시약이 보충 표 1에 포함되었다.

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프로토콜

이 프로토콜 전반에 걸친 모든 동물 관리 및 사용은 동물 복지법 정책인 ILAR 실험실 동물 관리 및 사용 가이드를 준수하고 안락사에 대한 AVMA 및 펜실베니아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침 및 정책의 지침을 따랐습니다. 동물 관리 및 사용 프로토콜은이 프로젝트를 위해 펜실베니아 대학 IACUC에서 검토하고 승인했습니다. 규정 준수 및주의의 문제로이 프로토콜을 시도하기 전에 필요한 모든 승인을 받으십시오.

1. sgRNA 및 선택적 기증자 올리고 디자인

  1. sgRNA 디자인
    1. CRISPR에 대한 서열 스캔 (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 또는 CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29와 같이 널리 사용되는 온라인 알고리즘에서 후보 sgRNA를 선택합니다. 각 플랫폼은 고유하므로 이상적인 sgRNA를 설계하기 위해 사용자 지침을주의 깊게 읽으십시오. in/del 실험의 경우 테스트할 sgRNA를 2-3개 선택합니다. 결실을 위해, 표적 영역의 플랭크에 있는 sgRNA, 예를 들어, 표적의 상류에 있는 2개의 sgRNA 및 표적의 하류에 있는 2개의 sgRNA가 제안된다.
      참고: 다양한 온라인 sgRNA 알고리즘이 결함이 있는 sgRNA 설계를 피하기 위해 오프 타겟을 고려하지만, NCBI의 BLAST 도구는 선택한 sgRNA 서열의 품질을 확인하는 데 도움이 됩니다.
    2. 이전 단계(1.1.1)에서 결정된 19-20개의 뉴클레오티드(nt)를 sgRNA 올리고의 가변 영역에 삽입하고(보충표 1) 합성된 sgRNA를 맞춤형 DNA 올리고로 구입한다.
      참고: PAGE 정제는 필요하지 않습니다.
  2. (선택 사항) 상동성 지시 수리(HDR) 매개 녹인을 위한 공여 올리고 설계.
    1. 원하는 실험 결과(정확한 점 돌연변이, loxP 삽입, 작은 태그 삽입 등)를 기반으로 적절한 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)를 설계하고, 중앙 영역 측면에 50nt 이상의 상동성 암으로 총 길이를 100-200nt로 유지합니다.
    2. 더 높은 녹인 효율을 보장하기 위해, sgRNA가 ssODN30에 상보적이도록 설계하고, Cas9 효소에 의한 반복적인 절단을 방지하기 위해 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 침묵 돌연변이로 대체한다.
    3. 사용자 지정 올리고 옵션을 사용하여 ssODN을 주문합니다.

2. sgRNA 합성

  1. 체외 전사(IVT)를 위한 템플릿 생성
    1. PCR을 통해 sgRNA IVT에 대한 DNA 주형을 생성하려면 RNAse가 없는 PCR 스트립 튜브에서 IVT 반응을 준비합니다. ( 보충 표 2 참조).
    2. 다음 열 순환기 조건을 사용하십시오.
      2분 동안 95°C; 2 분 동안 95 ° C, 10 초 동안 57 ° C, 및 10 초 동안 72 ° C의 30 사이클; 그런 다음 2분 동안 72°C
    3. sgRNA DNA 주형 PCR 반응의 성공을 확인하기 위해 2%(wt/vol) 아가로스 겔에 5μL의 생성물을 6x 로딩 염료 1μL와 결합했습니다.
      참고: 예상 제품 크기는 127bp입니다. 나머지 PCR 반응은 -20 °C에서 최대 5개월 동안 보관할 수 있습니다.
  2. sgRNA의 시험관 내 전사 (IVT)
    1. sgRNA를 생성하려면 PCR 튜브에서 반응 혼합물(제조업체 지침에 따라 T7 IVT)을 준비하고 플릭하여 시약을 혼합합니다.
      참고: 반응 설정 예는 보충 표 3 을 참조하십시오. IVT 반응은 RNase 오염에 민감합니다. 따라서 RNase가 없는 환경을 제공하기 위해 모든 노력을 기울이십시오.
    2. 반응이 시작되고 진행되도록 하려면 IVT 반응 혼합물을 열 순환기 또는 열 블록에서 37°C에서 >18시간 동안 배양합니다.
    3. 본래의 DNA 주형을 분해하려면(단계 2.1.3), 1 μL의 DNase I(반응당 2 유닛)을 도입하고, 실온(RT)에서 20분 동안 반응물을 인큐베이션한다.
    4. 자기 정제 비드에 대한 RNA 결합을 촉진하려면 반응에서 129μL의 100% 에탄올을 결합하면 이제 150μL가 됩니다.
    5. 저장 중에 침전되는 경향이 있는 정제 비드를 재현탁하려면 분취량을 최소 10초 동안 와동시킵니다.
    6. sgRNA를 정제하려면 재현탁 비드 100μL(단계 2.2.5)를 IVT 반응(단계 2.2.4)에 추가하고 10배 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
    7. 결합을 허용하려면 혼합물을 RT에서 5분 동안 그대로 두십시오.
    8. 통합되지 않은 반응 생성물에서 sgRNA를 분리하려면 RT에서 5분 동안 자기 스탠드에 반응을 놓고 작은 펠릿이 형성될 때까지 기다립니다.
    9. sgRNA를 세척하려면 먼저 상청액을 조심스럽게 버린 다음 펠릿에서 80% 에탄올 200μL를 추가합니다.
      알림: 80%(vol/vol) 에탄올 세척 단계에서는 sgRNA 농도를 상당히 감소시킬 수 있으므로 피펫팅으로 펠릿을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 대신 펠릿이 잠기도록 80% 에탄올을 부드럽게 피펫팅하고 피펫으로 부피를 부드럽게 제거합니다.
    10. 이전 단계(2.2.9단계)를 반복하고 펠릿을 5-6분 이상 자연 건조하지 않으면 sgRNA가 비드와 영구적으로 연결됩니다.
    11. 펠릿을 10x 피펫팅하고 (RT)에서 2분 동안 배양한 다음 마그네틱 스탠드에 다시 놓아 현재 정제된 sgRNA에서 비드를 분리하여 뉴클레아제가 없는 물 20μL로 sgRNA를 용리합니다.
    12. sgRNA의 품질과 양을 평가하려면 분광 광도계 또는 생물 분석기와 같은 기기를 사용하십시오. 또는 2% 아가로스 겔에서 2.1.3단계와 유사하게 2μL의 sgRNA를 실행합니다.
      알림: 품질은 단일 클리어 밴드로 확인됩니다. sgRNA의 나머지 부분은 즉시 사용하거나 -80 ° C 조건에서 보관할 수 있습니다.

3. 과배란

  1. 각 sgRNA 디자인을 테스트하기에 충분한 배아를 제공하기 위해,앞서 설명한 바와 같이 3-5주 사이의 C57BL/6J 암컷 2-3마리를 과배란시킨다9. 효과를 확인하기에 충분한 결과를 생성하기 위해 sgRNA 당 20-30 개의 배아를 전기 천공하는 것이 좋습니다.
    참고 : 수정이 성공하면 짝짓기 당 10-20 개의 배아를 기대하십시오.
  2. 배란을 유도하려면 다음 호르몬 주사 일정을 따르십시오.
    1. 1일차: 3-5주 된 암컷 마우스에 26G 주사기를 사용하여 복강내(IP) 주사를 통해 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)(PMSG) 5IU(100μL)를 투여합니다.
    2. 3 일째 : PMSG 주사 46-48 시간 후, IP 주사를 통해 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG) (100 μL) 5 IU를 주사하여 배란을 유도합니다.
    3. 번식을 설정하려면 hCG 주사 직후 암컷과 신뢰할 수있는 번식 수컷을 1 : 1로 짝을 지으십시오.
      알림: 호르몬이 저하되고 활동이 감소하는 것을 방지하려면 해동 후 30분 이내에 주사를 수행하십시오.

4. 배아 수집 및 처리

  1. 배아 수집
    1. 앞서 설명한31에서 여성을 안락사시키고 필요한 물질을 회수하려면 먼저 제도적 정책에 따라 적절한 방법을 확인하십시오. 예를 들어,CO2 질식, 자궁경부 탈구, 및/또는 다른 승인된 방법을 사용한다.
      알림: 일반적으로 호르몬 자극을받은 암컷의 >75 %가 교합 플러그를 표시하여 성공적인 짝짓기를 나타냅니다.
    2. 머리카락으로 인해 조직 수집이 어려워지는 것을 방지하려면 안락사 된 암컷을 등에 대고 외과 적으로 열 복부 부위에 70 % (vol / vol) 에탄올을 뿌립니다.
      알림: 이 시점부터 무균 환경을 유지하고 오염 가능성을 줄이기 위해 통풍이 잘되는 후드에서 수술 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
    3. 복강을 열고 난관을 제거하려면 수술용 가위로 피부/모발(피하) 층을 자르고 신장 근처에서 발견되고 지방 패드의 일부를 공유하는 난소(그림 4)를 찾습니다. 난관은 난소 근위에 위치합니다 (그림 4). 암컷에서 두 난관을 외과적으로 제거하고 M2+BSA(4mg/mL BSA) 배지의 개별 50μL 방울에 넣습니다(그림 5A).
      참고: 절차의 이 섹션에 대한 자세한 지침은 시각적으로 볼 수 있습니다.31 또는 이전에 게시된 프로토콜을 사용하여 단계적으로9 따를 수 있습니다.
    4. 난모세포를 포함하는 적운-난모세포 복합체(CoC)를 방출하려면(그림 4), 해부 집게를 사용하여 실체 현미경을 통해 보면서 난관의 팽대부에 흠집을 냅니다.
    5. 파편(혈액, 지방, 조직)의 양을 줄이려면 이물질의 이월을 방지하기 위해 휴대용 피펫을 20-30μL로 설정한 상태에서 각 CoC를 M2+BSA 배지의 단일 50μL 방울로 옮기고 결합합니다.
  2. 적운 세포 제거
    1. 접합체에서 적운 세포 제거를 시작하려면(그림 4), 가능한 한 적은 추가 배지로 CoC를 100μL M2+히알루로니다아제 방울로 옮기고(그림 5B), 배아가 훨씬 더 작은 적운 세포에서 눈에 띄게 분리될 때까지 CoC를 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. M2+히알루로니다아제의 배아에 대한 노출은 생존력에 영향을 미칠 수 있으므로 최소한으로 유지하십시오.
      알림: 배아가 37분 이내에 적운 세포에서 분리되지 않는 경우 예열(37°C)하거나 50μL의 M2+히알루로니다아제를 추가할 수 있습니다.
    2. 히알루로니다아제를 희석하고 접합체에서 느슨한 적운 세포를 제거하려면 구강 작동식 피펫을 사용하여 접합체를 신선한 50μL M2+BSA 방울로 옮깁니다.
      알림: 이 시점을 초과하는 대부분의 단계는 달리 명시되지 않는 한 구강 작동식 피펫을 사용해야 합니다. 사용자의 오염 위험은 낮지만 무균 환경을 유지하려면 인라인 공기 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 이 기기 9,31을 준비하고 사용하려면 이전에 설명한 방법을 참조하십시오.
    3. 구강 피펫을 사용하여 배아를 최소 4-5 개의 50 μL M2 + BSA 방울에 통과시켜 적운 세포 수를 줄입니다.
  3. (선택 사항) 산성 티로드 (AT) 용액으로 조나 펠루시다의 희석.
    1. 배아의 조나 펠루시다를 침식하고 시약 전달을 위한 추가적인 물리적 장애물을 줄이려면 배아를 60mm 플레이트의 예열된(37°C) 100μL AT 용액 방울로 옮깁니다(그림 5C). 실체 현미경을 사용하여 접합체를 지속적으로 관찰하여 약 30%의 조나 펠루시다가 침식될 때까지9. 총 AT 노출은 60-90 초이어야합니다. AT에 장기간 노출되면 조나 펠루시다를 완전히 용해시키고 배아 생존력을 위태롭게 할 수 있습니다.
      알림: 절차의 이 섹션에 대한 자세한 지침과 이미지는 이전에 게시된 방법 9,16을 참조하십시오.
    2. AT를 희석하려면 구강 피펫을 사용하여 최소 4개의 50μL M2+BSA 방울을 통해 배아를 통과시킵니다.
    3. 적절한 수의 배아가 처리되었는지 확인하려면 실체 현미경을 사용하여 배아 수를 세십시오. 사용 된 암컷 마우스의 수에 따라 암컷 당 약 10-20 개의 생존 가능한 접합체를 기대할 수 있습니다.
      참고: 이 단계에서 배아는 양과 질의 평가를 방해하는 파편이 상대적으로 없어야 합니다. 예를 들어, 5 명의 암컷을 사용하는 경우 예상되는 접합체 수는 50-100 사이 일 수 있으며 배아를 추적하려면 기계식 세포 카운터가 적합합니다. 수정에 실패하거나 품질이 낮은 난 모세포가 배란되어 배아의 약 10 % -20 %를 잃는 것이 일반적입니다. 다음 단계에서 배아를 M2+BSA 50μL에 인큐베이터에서 30분 이상 잠깐 보관하지 마십시오.

5. RNP 조립 및 전기 천공

  1. RNP 어셈블리
    1. RNP 복합체를 조립하려면 첨부된 예시 표를 사용하여 RNP 완충액(뉴클레아제가 없는 물에서 100mM HEPES pH 7.5, 750mM KCl, 5mMMgCl2, 50% 글리세롤 및 100mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드[TCEP])에서 원하는 편집 전략에 따라 적절한 반응 혼합물을 결합합니다.
      참고 : TCEP는 편리한 환원제이지만 수용액에서 반감기가 짧습니다. 따라서 RNP 복합 어셈블리 바로 앞에 TCEP를 추가합니다.
      1. 비상동 말단 접합(NHEJ) 매개 인델에 대해서는 보충 표 4를 참조하십시오.
      2. 상동성 지시 복구(HDR) 매개 편집에 대해서는 보충 표 5를 참조하십시오.
      3. 쌍을 이루는 sgRNA를 사용한 공학적 결실에 대해서는 보충 표 6을 참조하십시오.
        1. 전략에 관계없이 RT에서 원하는 시약을 PCR 튜브에 결합합니다.
        2. RNP 복합체 형성을 허용하기 위해, 혼합물을 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
          참고: RNP 복합체는 최대 1시간 동안 RT에 보관할 수 있습니다.
  2. 전기 천공
    1. 전기천공 전에 BSA를 희석하기 위해, 배아를 50μL의 환원된 혈청 배지의 적어도 두 방울에 통과시킨다.
      알림: BSA는 전기 천공 중에 저항을 증가시키고 접합체를 손상시킬 수 있습니다.
    2. 전기 천공을 위해 접합체 (단계 4.3.2)를 RNP 복합체 (단계 5.1.1.2)와 준비하고 혼합하기 위해 25-30 배아를 환원 된 혈청 배지 10 μL 방울에 구강 피펫 한 다음 휴대용 피펫을 사용하여 RNP 복합체 10μL를 추가합니다 (단계 5.1.1.2).
    3. RNP 복합체에서 점성 글리세롤을 희석하고 샘플을 균질화하려면 실체 현미경을 사용하여 10x 피펫팅하거나 혼합물에 더 이상 점도 징후(소용돌이 패턴)가 나타나지 않을 때까지 혼합합니다.
    4. 전기천공기에 삽입할 샘플을 준비하려면 기포를 피하면서 이 20μL의 배아 + RNP 혼합물을 0.1cm 전기천공 큐벳에 피펫팅합니다.
    5. 편집 시약을 접합체에 전달하려면 30V, 4-6 펄스, 3ms 펄스 길이 및 100 펄스 간격의 조건에서 구형파 프로토콜을 사용하여 배아를 전기천공합니다.
    6. 큐벳에서 접합체를 검색하려면 핸드 피펫을 사용하여 50μL의 KSOM+BSA(1mg/mL BSA)를 큐벳 상단에 전달하여 바닥에 가라앉았을 수 있는 배아를 플러시합니다. 이 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 60mm 플레이트에 놓습니다.
    7. 5.2.6 단계를 최소 2x-3x 반복하고 대부분의 배아가 회복 될 때까지 60mm 플레이트에서 각 플러시를 결합합니다.
      참고: 일반적인 회복은 원래 로드된 배아의 >90%입니다. 배아 생존을 보장하려면 인큐베이터를 테스트하고 모든 시약의 만료 날짜를 확인하십시오. 배아는 온도,CO2 수준, 습도 및 pH와 같은 비이상적인 배양 조건에 취약합니다.

6. 배아 배양 및 유전형 분석

  1. 배아 배양
    1. 접합체를 원하는 단계로 배양하려면 구강 피펫을 사용하여 20-30개의 접합체를 사전 평형화된 배양 플레이트의 KSOM+BSA 방울로 옮기고 배아를 액적으로 옮깁니다(그림 5D). 플레이트를 95% 습도로 37°C에서 5%CO2에서 밤새 인큐베이션한다.
      참고: 준비된 35mm 배양 플레이트를 배양 전날 또는 최소 4시간 전에 인큐베이터에 넣어 사전 평형을 유지합니다(그림 5D).
    2. 이상적인 성장 조건을 촉진하려면 다음 날 실체 현미경을 사용하여 KSOM+BSA 혼합물의 신선한 방울에 2세포 배아만 옮기고 인큐베이터로 돌아갑니다. 죽은 배아 또는 수정되지 않은 배아를 남기거나 버리십시오.
      참고: 핵 단계 배아는 일반적으로 배양 72시간 후에 상충으로 성장하고 84시간 후에 배반포로 자랍니다.
  2. 유전형 분석
    1. PCR 반응을 방해할 수 있는 배지 성분을 희석하려면 DPBS 두 방울을 통과시켜 구강 피펫을 사용하여 상복층/배반포 배아를 세척합니다.
    2. 용해를 위해 단일 배아를 로드하려면 피펫을 1μL로 설정하여 개별 배아를 8웰 PCR 스트립의 한 웰로 옮긴 다음 10μL의 용해 완충액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5mMMgCl2, 0.1mg/mL 젤라틴, 0.45% 노니뎃 P-40, 0.45% 트윈 20, 뉴클레아제가 없는H2O에서 0.2mg/mL 프로테이나제 K)을 추가합니다.
      참고: 용해 완충액을 준비하기 직전에 프로테이나제 K를 추가하십시오.
    3. 배아를 용해시키기 위해, 열 순환기를 4시간 동안 55°C로 프로그래밍한 다음, 95°C에서 10분 배양하여 프로테이나제 K를 불활성화시킨다.
      참고: 특히 처음 사용하는 경우 Tyr 위치에서 편집 실험을 시도하십시오. 이 워크플로는 최적화되었으며 포지티브 컨트롤 역할을 할 수 있습니다. 필요한 경우 배아 용해물을 4°C에서 2-3일 동안 보관하거나 PCR 분석 전에 최대 2주 동안 냉동실에 보관합니다. 반복되는 동결-해동 주기를 방지합니다.
    4. 성공적인 유전형 분석 가능성을 높이려면 표적 부위 측면에 있는 약간 더 긴 DNA 단편과 보다 정확한 DNA 단편을 증폭하는 데 사용할 영역을 증폭하여 중첩 PCR 전략을 수행하십시오. 보충 표 7의 조건을 따르십시오.
    5. 아래에 언급된 열 순환기 조건을 따르십시오.
      95 °C 2분 동안
      30+ 사이클: 2분 동안 95°C, 10초 동안 60°C, 10초 동안 72°C
      72 °C 2분 동안
    6. 중첩된 PCR 전략의 두 번째 단계를 준비하려면 첫 번째 PCR 산물을 1:10으로 희석하고(6.2.5단계) 이 중 2μL를 다음 PCR 반응에 로드합니다(이전 앰플리콘 내부에 있도록 설계된 프라이머 사용).
      참고: 첫 번째 PCR 반응은 두 번째 PCR 반응에서 측면 프라이머의 캐리오버를 줄이기 위해 희석되어야 합니다. 보충 표 8의 단계에 따라 중첩된 PCR을 준비합니다.
    7. PCR 반응을 다음 사이클링 조건을 사용하여 열 순환기에 넣습니다.
      95 °C 2분 동안
      30 사이클 : 2 분 동안 95 ° C, 10 초 동안 60 ° C, 10 초 동안 72 ° C
      72 °C 2분 동안
      참고: 일반적으로 PCR 반응의 >90%는 앰플리콘 크기가 500bp 이하일 때 성공합니다.
    8. (선택적 컨트롤) Tyr 을 양성 대조군으로 사용하는 NHEJ 매개 in/del 돌연변이의 경우, 20μL 반응에서 10U의 HinfI를 사용하여 37°C에서 4시간 동안 배양하여 6.2.7단계의 중첩된 PCR 산물 10μL를 분해합니다( 보충 표 9 참조). 2% 아가로스 겔에서 소화된 생성물을 실행하여 편집을 평가하고 소화되지 않은 PCR 산물을 로딩 대조군으로 사용합니다. 젤을 135V에서 30 분 동안 실행하십시오.
      참고: HinfI를 적절한 제한 효소로 사용하는 것은 성공적인 NHEJ 편집 시 절제될 것으로 예상되는 sgRNA 표적 영역 내에 존재하는 편리한 위치의 HinfI 부위로 인해 선택되었습니다. 상세한 방법 및 결과는 앞서 9,16에서 설명되었다.
    9. (선택적 컨트롤) Tyr 을 양성 대조군으로 사용하는 HDR 매개 돌연변이의 경우, 20μL 반응에서 10U의 EcoRI를 사용하여 37°C에서 4시간 동안 배양하여 6.2.7단계의 중첩된 PCR 산물 10μL를 분해합니다( 보충 표 10 참조). 2% 아가로스 겔에서 소화된 생성물을 실행하여 편집을 평가하고 소화되지 않은 PCR 산물을 로딩 대조군으로 사용합니다. 젤을 135V에서 30 분 동안 실행하십시오.
      참고: 진단 제한 효소로 EcoRI를 선택하면 sgRNA 표적 영역에서 발견되는 원래 서열을 활용하며, HDR에 성공하면 자연 발생 HinfI 부위가 EcoRI 부위로 대체되고 Tyr 유전자를 방해하는 프레임 시프트 돌연변이가 강제됩니다. HDR 분석의 경우 각 샘플에 대해 NHEJ(6.2.8단계) 및 HDR(6.2.9단계) 분석을 모두 수행하면 두 결과가 모두 발생할 수 있고 모자이크를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 상세한 방법 및 결과는 앞서 9,16에서 설명되었다.

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결과

이 방법은 효율적인 Cas9/sgRNA RNP 조립을 위해 100μg 이상의 sgRNA(>6,000ng/L 농도에서 20μL)를 생성합니다. 여기에 설명된 일상적인 과배란 방법은 일반적으로 연결된 암컷당 10-20개의 생존 가능한 배아를 생성합니다. 배아 조작과 관련된 취급 오류 및 일반적인 손실로 인해 예상되는 배아의 80%는 수정되고 생존 가능하며 전기천공 후 우수한 상태를 유지합니다. 연구자들이 성공적인 실험을 수행하는 데 ...

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토론

여기에 제시된 것은 간단하고 매우 효율적인 마우스 게놈 편집 기술입니다. 전기천공은 1-2주 내에 변형된 배아를 생성하는 데 사용할 수 있으며(그림 1)6주 이내에 편집된 마우스를 생산할 수 있습니다9. RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32를 제공하는 동시대에 개발된 전기천공 기반 프로토콜과 비교할 때

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공개

저자의 관련 재무 선언은 없습니다.

감사의 말

A.J.M.은 CRISPR-EZ의 개발로 이어진 독창적인 개념을 만들고 피규어를 제작했습니다. C.K.D.는 이 현재 원고에 대한 내부 및 출판된 프로토콜을 편집하고 조정했습니다. AJM은 NIH (R00HD096108)에 의해 지원됩니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-cm-gap electroporation cuvetteBio-Radcat. no. 1652089Electroporation
26-G, 1/2-inch needleBDcat. no. 305111Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female miceJAXcat. no. 000664Superovulation
35-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 627-160Embryo Culture
60-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 628-160Embryo Processing
6x loading dyeThermo Fisher Scientificcat. no. R0611sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture gradeSigma-Aldrich,cat. no. T1788Embryo Processing
BSA, embryo culture gradeSigma-Aldrichcat. no. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 proteinAlt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLScat. no. 1074181Electroporation
DNase I, RNase-freeNew England BioLabs,cat. no. M0303sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)Gibcocat. no. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBcat. no. R3101SGenotyping
EDTA, anhydrousSigma-Aldrichcat. no. EDS-100GRNP Buffer
EthanolKopteccat. no. V1016sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory gradeFisher,cat. no. G7-500Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology gradeFishercat. no. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegacat. no. M712Genotyping
HEPES, cell culture gradeSigma-Aldrichcat. no. H4034RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)NEBcat. no. R0155SGenotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,cat. no. E2040sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)Milliporecat. no. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2Milliporecat. no. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)Zenith Biotechcat. no. ZEKS-050Embryo Culture
LE agarose, analytical gradeBioExpresscat. no. E-3120-500sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 mediumZenith Biotechcat. no. ZFM2-050Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)Sigma-Aldrichcat. no. M8266RNP and Lysis Buffer
Mineral OilMilliporecat. no. ES-005CEmbryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)Sigma-Aldrichcat. no. 74385Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology gradeAmbioncat. no. AM9937sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotypingIntegrated DNA Technologiescustom orderssgRNA Design
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientificcat. no. 31985062Embryo Culture
High-fidelity DNA polymeraseNew England BioLabs,cat. no. M0530sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)Sigma-Aldrichcat. no. P9333RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)ProspecBiocat. no. HOR-272Superovulation
Proteinase K, molecular-biology gradeFishercat. no. BP1700-100Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubeVWRcat. no. 20170-333sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubesVWRcat. no. 82006-606sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beadsGE Healthcarecat. no. 65152105050250sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrichcat. no. C4706RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology gradeTeknovacat. no. T1085Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology gradeSigma-Aldrichcat. no. P7949-500Lysis Buffer

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