Implantación de cánula intracraneal para infusiones seriadas de células T con receptor de antígeno quimérico locorregional (CAR) en ratones

Resumen

Los tumores del sistema nervioso central (SNC) son la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en los niños, y las terapias locorregionales basadas en el sistema inmunitario se están probando cada vez más para pacientes en ensayos clínicos. Este protocolo describe métodos para la implantación de cánulas locorregionales en ratones para la evaluación preclínica de infusiones inmunoterapéuticas dirigidas a tumores del SNC.

Resumen

Los tumores pediátricos del SNC son responsables de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer en niños y tienen un mal pronóstico, a pesar de los avances en la quimioterapia y la radioterapia. Como muchos tumores carecen de tratamientos eficaces, existe una necesidad crucial de desarrollar opciones terapéuticas más prometedoras, como inmunoterapias; el uso de la terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigida contra los tumores del SNC es de particular interés. Los objetivos de la superficie celular como B7-H3, IL13RA2 y el disialogangliósido GD2 se expresan altamente en la superficie de varios tumores pediátricos y adultos del SNC, lo que aumenta la oportunidad de usar la terapia de células T con CAR contra estos y otros objetivos de superficie. Para evaluar la administración locorregional repetida de células T con CAR en modelos murinos preclínicos, se estableció un sistema de catéter permanente que recapitula los catéteres permanentes que se utilizan actualmente en ensayos clínicos en humanos. A diferencia de la administración estereotáctica, el sistema de catéter permanente permite la dosificación repetida sin el uso de múltiples cirugías. Este protocolo describe la colocación intratumoral de una cánula guía fija que se ha utilizado para probar con éxito infusiones seriadas de células T con CAR en modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrales pediátricos. Después de la inyección ortotópica y el injerto de las células tumorales en ratones, la colocación intratumoral de una cánula guía fija se completa en un aparato estereotáctico y se asegura con tornillos y resina acrílica. Luego, las cánulas de tratamiento se insertan a través de la cánula guía fija para la administración repetida de células T con CAR. La colocación estereotáctica de la cánula guía se puede ajustar para administrar células T con CAR directamente en el ventrículo lateral u otras ubicaciones en el cerebro. Esta plataforma ofrece un mecanismo confiable para las pruebas preclínicas de infusiones intracraneales repetidas de células T con CAR y otras terapias novedosas para estos tumores pediátricos devastadores.

Introducción

A pesar de las mejoras en la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía, los tumores del sistema nervioso central (SNC) son la neoplasia maligna más mortal en pediatría¹, lo que subraya una necesidad importante de nuevos enfoques con resultados más exitosos. Con avances significativos en el campo de la inmunoterapia, los enfoques de terapia celular adoptiva (TCA) han mostrado resultados prometedores en varios tipos de cáncer, especialmente neoplasias hematológicas². La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR), un tipo específico de ACT, aprovecha la capacidad natural del sistema inmunitario para reconocer y matar las células dañinas al redirigir la especificidad de las células T para generar células T dirigidas al tumor³. La terapia de células T con CAR ha demostrado un éxito sustancial en el tratamiento de leucemias y linfomas⁴, lo que la convierte en un enfoque inmunoterapéutico prometedor y fomenta su investigación en tumores sólidos. Sin embargo, hasta ahora, la terapia de células T con CAR en tumores sólidos ha logrado poco éxito clínico y enfrenta muchos desafíos, como la penetración tumoral ineficiente, antígenos dianables limitados y el microambiente tumoral supresor⁵.

Ensayos clínicos recientes han comenzado a evaluar la terapia de células T con CAR para tumores pediátricos del SNC, proporcionando pruebas de concepto y evidencia temprana de actividad de células T en informes preliminares ^6,7,8. Si bien la mayoría de los datos preclínicos iniciales se centraron en la administración intravenosa de las células T con CAR, la evidencia preclínica reciente ha sugerido la superioridad de la administración locorregional en el SNC 9,10, que también se ha utilizado con éxito en varios ensayos clínicos^6,7,8,11. Los estudios preclínicos realizados hasta la fecha que han incorporado la administración locorregional de células T con CAR en el SNC se han basado en una dosis intracraneal única de células T con CAR administradas estereotácticamente ^9,10. Sin embargo, los ensayos clínicos en humanos han requerido infusiones repetidas de células T con CAR en el SNC 6,7,8,11^, lo que subraya la necesidad de evaluar múltiples infusiones repetidas en el desarrollo preclínico. El objetivo de este procedimiento es probar con éxito infusiones seriadas de células T con CAR utilizando un catéter en modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrales pediátricos. La ventaja de esta técnica es la evitación de múltiples procedimientos quirúrgicos para proporcionar tratamientos repetidos dentro del SNC. Las cánulas se han utilizado principalmente para el muestreo de microdiálisis de neurotransmisores y la administración de sustancias neuroactivas en neurociencia e investigación conductual en roedores¹², con informes limitados de su uso para la administración de terapias contra el cáncer. Sobre la base de los informes anteriores, este protocolo utiliza un sistema de cánula permanente colocado estereotácticamente para administrar células T con CAR en modelos murinos de xenoinjerto de tumores del SNC. El protocolo se puede utilizar para probar terapias adicionales en modelos murinos de trastornos neurológicos o neurooncológicos, y puede ser útil para probar nuevas terapias donde eludir la barrera hematoencefálica es fundamental para la eficacia.

Protocolo

Todos los procedimientos de protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Niños de Filadelfia (IAC 19-000907), que está acreditado por la AAALAC. Este estudio utilizó ratones NOD gamma (NSG) de 6-12 semanas de edad con tumores de xenoinjerto ortotópico; Sin embargo, el protocolo se puede utilizar en cualquier cepa de ratón. Los ratones NSG se alojaron en condiciones de barrera estéril y la cirugía se realizó bajo gabinetes de bioseguridad estériles. Cuando se utiliza material humano, como células tumorales o células T, los procedimientos y la manipulación deben completarse en los gabinetes de bioseguridad ABSL-2.

1. Preparación del ratón para la cirugía

1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción con isoflurano (2-4%) a un caudal de oxígeno de 1 L/min hasta alcanzar un plano adecuado de anestesia (aproximadamente 5 min).
2. Pesar el ratón con una báscula con una precisión de 0,1 g y administrar buprenorfina subcutánea de liberación lenta (SR) (1 mg/kg) u otro analgésico.
   NOTA: La buprenorfina SR proporciona analgesia durante 72 h.
3. Afeite el pelaje en la parte superior de la cabeza del ratón con cortapelos eléctricos o agentes depilatorios.
4. Use una espátula para abrir suavemente la parte inferior del brazo estereotáctico e inserte la cánula guía con fórceps. Apriete el tornillo del brazo para asegurar la cánula, de modo que aproximadamente 1/2 a 2/3 de la porción de plástico blanco de la cánula sobresalga de la parte inferior de la abertura, junto con toda la longitud metálica de 5 mm de la cánula.
5. Inserte y asegure los dientes superiores del ratón en la barra de mordida del aparato estereotáxico. Tire del cono de la nariz hacia adelante y apriételo, asegurándose de que el ratón esté inhalando isoflurano.
6. Monte el ratón en el aparato estereotáxico calentado utilizando orejeras o barras para los oídos, evitando una presión excesiva.
   NOTA: La bandeja calentada debe tener un termómetro rectal insertado, y la bandeja de calentamiento debe ajustarse para mantener una temperatura corporal normal del ratón durante el procedimiento.
7. Aplique ungüento oftálmico estéril en ambos ojos con un aplicador con punta de algodón.
8. Limpie el sitio quirúrgico con povidona yodada en una almohadilla o aplicador, seguido de una almohadilla con alcohol. Realice este paso tres veces en total.
9. Antes de comenzar el procedimiento, realice un pellizco del dedo del pie con fórceps para evaluar la sedación adecuada.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: Todos los aspectos del procedimiento quirúrgico utilizan instrumentos esterilizados y técnicas asépticas. Los ratones continúan bajo anestesia con isoflurano (2-4%) durante toda la duración del procedimiento, aproximadamente 10-20 min.

1. Levante suavemente el cuero cabelludo entre las orejas con fórceps. Usando tijeras estériles, corte el cuero cabelludo levantado paralelo al cráneo y retire un colgajo ovalado de piel (0.75-1 cm de longitud) para exponer el cráneo.
   NOTA: Se prefieren las tijeras sobre un bisturí para proporcionar una abertura limpia y ovalada y para evitar daños innecesarios a la piel y el tejido circundantes.
2. Empuje la fascia con un bisturí o hisopos con punta de algodón y una bolita de algodón hemostático para ayudar a retardar el sangrado excesivo según sea necesario.
   NOTA: Usar el lado de madera de una punta de algodón estéril también puede alejar la fascia y ayudar a evitar el sangrado excesivo.
3. Identifique los puntos de referencia bregma y lambda, las respectivas marcas anteriores y posteriores en el cráneo donde las placas craneales se encuentran¹³.
   NOTA: La identificación se puede aumentar limpiando la parte superior del cráneo expuesto con peróxido de hidrógeno.
4. Marque suavemente el cráneo con un bisturí para crear una superficie para que el acrílico se adhiera. La puntuación debe incluir múltiples líneas lineales de aproximadamente 0,5-1 cm de longitud en ángulos de 90° entre sí.
5. Usando el brazo estereotáxico, localice la cánula al punto de referencia de interés (bregma o lambda). Una vez localizada, levante la punta de la cánula 1-2 mm por encima de la superficie del cráneo y muévase a las coordenadas deseadas. Para las inyecciones intratumorales, esto utiliza las mismas coordenadas A/P y M/L que la colocación del tumor.
6. En el cráneo expuesto, lejos del área donde entrará la cánula, haga dos orificios para tornillos con una aguja de 18 G o un taladro quirúrgico. Asegúrese de que los orificios estén espaciados para incluir suficiente espacio para la cánula. Usando una broca, gire a través de los orificios de los tornillos hasta que se enganchen en el cráneo. Inserte y fije dos tornillos en los orificios con un destornillador de punta plana. Luego, tire suavemente de los tornillos hacia arriba para asegurarse de que estén asegurados.
   NOTA: No inserte los tornillos hasta que estén al ras del cráneo, o pueden dañar el cerebro del ratón debajo. Deje al menos un espacio de 1-2 mm entre el tornillo y el cráneo.
7. Usando una aguja de 18 G o un taladro quirúrgico, perfore el cráneo en las coordenadas identificadas para crear un orificio para insertar la cánula.
8. Usando el brazo estereotáctico, baje la cánula a la coordenada D/V deseada.
   NOTA: La coordenada D/V de la implantación de la cánula debe tener en cuenta la longitud de proyección de la maniquí y las cánulas de tratamiento, y puede ser más superficial que la inyección ortotópica de células tumorales (Figura 1).
9. En una placa de porcelana de 12 pocillos, llene un pocillo con polvo de resina acrílica (aproximadamente 0,3 g) y 10-15 gotas (aproximadamente 0,5-0,75 ml) de líquido de resina acrílica. Esto produce un material viscoso de color blanco. Extraiga la mezcla en una jeringa de 1 ml y úsela para cubrir y cubrir el cráneo, rellenando los espacios alrededor de la cánula y los tornillos.
   NOTA: El material viscoso se endurece en cemento con el tiempo, por lo que este paso debe completarse inmediatamente después de mezclar.
10. Mientras el cemento aún es flexible, afloje el tornillo del brazo estereotáctico y use una espátula en la abertura en la parte inferior para liberar suavemente la cánula del soporte y retraer lentamente el brazo estereotáxico hacia arriba lejos del mouse.
11. Una vez que el cemento esté completamente seco, inserte la cánula ficticia en la cánula guía y asegúrela firmemente girando en el sentido de las agujas del reloj.
12. Una vez que se complete el procedimiento, vuelva a colocar el ratón en su jaula casera calentada para monitorear cuidadosamente, asegurando una recuperación adecuada y registrando cualquier observación posterior al procedimiento, incluido que el ratón haya recuperado completamente la conciencia, antes de regresar a la colonia.
    NOTA: En general, se recomienda colocar solo la mitad de la jaula en una almohadilla térmica para permitir que el animal se mueva hacia el lado más frío para evitar el sobrecalentamiento.
13. Administre analgésicos adicionales según sea necesario si los ratones muestran comportamientos indicativos de dolor después de la operación, como meloxicam 5 mg / kg administrado por vía subcutánea una vez al día durante un máximo de 3 días.

3. Preparación de células T con CAR

1. Mida la concentración de células T con CAR pretransfectadas utilizando un contador de células.
2. Centrífuga de células T pretransfectadas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
3. Aspirar el sobrenadante utilizando una pipeta estéril Pasteur en un sistema de aspiración al vacío y resuspender el pellet en solución salina tamponada con fosfatae (PBS) a la concentración deseada. Los volúmenes de administración típicos son de 2-5 μL. Las dosis celulares típicas son 0.5-5 x 10⁶ células.

4. Infusiones de células T con CAR

1. Prepare la cánula de tratamiento alimentando la parte superior a través de un pequeño trozo de tubo PKG.
2. Llene la jeringa de tratamiento con la suspensión de células T con CAR e insértela a través del otro extremo del tubo PKG, lo suficiente como para cubrir la parte superior de la cánula de tratamiento.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano (2-4%) a un caudal de oxígeno de 1 L/min.
4. Estabilice la cánula guía con pinzas en la base, y luego desenrosque y retire cuidadosamente la cánula ficticia, permitiendo el acceso a la cánula guía.
   NOTA: No es necesaria una configuración estereotáxica, pero se puede utilizar para estabilizar la cabeza para el tratamiento.
5. Infundir las células T con CAR durante 1 minuto y mantener la cánula de tratamiento en su lugar durante 1 minuto adicional después del cese de la infusión.
6. Retire la cánula de tratamiento y vuelva a atornillar la cánula ficticia firmemente en su lugar.
7. Administrar meloxicam subcutáneo (5 mg/kg) para el control opcional del dolor.

Resultados

Implantación exitosa de cánula en el SNC del ratón
Los ratones con canulación exitosa tienen una cánula guía segura en su lugar, que no interfiere con las actividades de la vida diaria (Figura 2A) y que puede pasar fácilmente una cánula de tratamiento y administrar líquido sin resistencia (Figura 2B). En nuestra experiencia, la mayoría de las cánulas permanecen en su lugar durante más de 4 semanas, aunque el 0-25% puede desprenderse con el tiempo. La verificación de la colocación correcta se puede confirmar con el tinte azul Evans inyectado en la cánula. Por ejemplo, una cánula insertada en el ventrículo lateral muestra un tinte azul de Evans en todo el sistema ventricular a medida que viaja a través del líquido cefalorraquídeo, confirmando la colocación correcta (Figura 2C). Las cánulas insertadas en el tumor muestran un tinte azul de Evans en el sitio de implantación del tumor.

Administración efectiva de células T con CAR en el SNC para el tratamiento de tumores de xenoinjerto.
La eficacia del sistema de cánula intracraneal y la eficacia terapéutica de las células T con CAR en modelos murinos se pueden medir a través de una variedad de mecanismos, incluidas las imágenes bioluminiscentes y la supervivencia general. Las células T con CAR dirigidas a GPC2 se probaron contra meduloblastoma murino y glioma difuso de línea media, modelos 7316-4509 y 7316-3058, respectivamente, utilizando dosis repetidas de células T con CAR a través del sistema de cánula intracraneal indicado¹⁴. La colocación y el injerto del tumor ortotópico se confirmaron mediante imágenes bioluminiscentes, y las cánulas se colocaron en el lecho tumoral utilizando las mismas coordenadas que la colocación del tumor ortotópico. Los tratamientos consistieron en infusiones de células T con CAR GPC2 una o dos veces por semana durante 2-4 semanas, totalizando de cuatro a seis dosis. Después del tratamiento, la terapia de células T con CAR dirigida a GPC2 indujo una regresión tumoral significativa en el meduloblastoma modelo 7316-4509 (p < 0,01) (Figura 3A) y una supervivencia significativamente prolongada en el glioma de línea media difusa talámico 7316-3058 (p < 0,05) (Figura 3B)¹⁴.

Figura 1: Cánula guía con maniquí de proyección y cánulas de tratamiento. (A) Cánula guía con proyección de 0,5 mm y cánulas ficticias de proyección de 2 mm en su lugar. (B) Cánula guía con proyección de 0,5 mm y cánulas de tratamiento de proyección de 2 mm en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sistema de administración de cánula de tratamiento para dosis repetidas de células T con CAR . (A) Cánula implantada en un cráneo de ratón con una tapa en su lugar cuando no está en uso. (B) Infusión de células T con CAR en un tumor pontino a través de la cánula de tratamiento mientras el ratón está bajo anestesia. (C) Verificación de la colocación de la cánula en el ventrículo lateral utilizando tinte azul de Evans. El tinte se insertó a través de la cánula, seguido de eutanasia y escisión cerebral, con tinte presente en todos los ventrículos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Las células T con CAR dirigidas a GPC2 median las respuestas antitumorales y prolongan la supervivencia en tumores cerebrales pediátricos in vivo. (A) Cuantificación de la bioluminiscencia del xenoinjerto de meduloblastoma del grupo ortotópico 4 7316-4509 tratado con células T CAR de ARNm dirigidas a GPC2 o CD19. Las dosis se indican con flechas en el gráfico. Los datos se muestran como media con DE, n = 9-11 ratones por brazo. (B) Supervivencia global de ratones implantados con xenoinjerto talámico DMG 7316-3058 tratados con seis dosis repetidas de 2 x 10⁶ células T con CAR. Las dosis se indican con flechas en el gráfico. n = 7 ratones por brazo. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = no significativo. Esta cifra ha sido reproducida con permiso de Foster et ^al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La terapia de células T con CAR ha revolucionado el tratamiento de los cánceres hematológicos y muestra un valor prometedor en el tratamiento de tumores cerebrales sólidos ^6,7,8. Este protocolo fue diseñado para permitir la evaluación preclínica de la administración locorregional de células T con CAR para el tratamiento de tumores pediátricos del SNC. El sistema de cánula replica un reservorio de Ommaya o Rickham, un sistema de catéter intraventricular que actualmente se utiliza en ensayos clínicos en curso de terapia de células T con CAR en tumores pediátricos del SNC ^6,7,8, lo que subraya la relevancia y el potencial traslacional de estos métodos. Este sistema permite la administración repetida de células T con CAR que evitan la barrera hematoencefálica, nuevamente similar a los métodos que se emplean en los ensayos clínicos en curso. La administración locorregional puede proporcionar la máxima eficacia en el SNC⁹ y también puede reducir el riesgo de toxicidades sistémicas asociadas con el tráfico de circulación¹⁵. Si bien la administración estereotáctica puede proporcionar una dosis única en el SNC, la ventaja de este sistema es la oportunidad de proporcionar múltiples dosis repetidas en una ubicación específica en el SNC sin la necesidad de múltiples cirugías. Las limitaciones de este procedimiento incluyen un sitio de entrega fijo sin la capacidad de cambiar de ubicación o hacer ajustes una vez que la cánula está en su lugar, y la posibilidad de desplazamiento de la cánula.

Un paso crítico en este protocolo es la implantación de la cánula guía fija en una coordenada D/V que tiene en cuenta la proyección de las cánulas de tratamiento. La cánula de tratamiento sobresaldrá más allá de la punta de la cánula guía, por lo que se debe tener cuidado para garantizar que la colocación resulte en la entrega de células T con CAR a la región de interés. Las longitudes de proyección de la cánula de tratamiento se pueden personalizar, y en la experiencia del autor, 0,5 mm es una longitud de proyección útil. Esta longitud garantiza que el terapéutico no permanezca en la cánula guía al dispensar, pero tampoco requiere un ajuste significativo de las coordenadas D / V para la cánula guía a la región de interés. Un paso importante adicional en este protocolo es el tiempo que la cánula de tratamiento se deja en su lugar después de la infusión de células T con CAR. La cánula de tratamiento debe mantenerse en su lugar durante al menos 1 minuto después del final de la infusión, para evitar fugas y la pérdida de la administración locorregional de la terapia de células T con CAR.

La solución de problemas de este método es sencilla, y la mayoría de las complicaciones implican dificultad para extraer la cánula ficticia o insertar la cánula de tratamiento en la cánula guía fija, probablemente debido a la sangre seca en el interior de la cánula guía. Esto se puede resolver fácilmente pasando suavemente la cánula ficticia a través de la cánula guía hasta que haya menos resistencia y los residuos se hayan eliminado. La resina acrílica puede ocasionalmente desprenderse del cráneo, lo que resulta en la pérdida del sistema de cánula. En nuestra experiencia, esto generalmente se limita al marcar el cráneo con un bisturí y la colocación de dos tornillos. Además, se retiran todos los elementos de la jaula que puedan aplicar fuerza accidentalmente a la cánula mientras el ratón se mueve, como las cabañas de enriquecimiento del ratón con pequeñas aberturas.

En conclusión, aquí se describe un protocolo para la inserción de un sistema de cánula en modelos murinos de tumores del SNC para la administración repetida de células T con CAR. La colocación de la cánula se puede ajustar a múltiples ubicaciones de entrega locorregionales, probando la eficacia de diferentes sitios de entrega. Además, este sistema se puede utilizar para terapias adicionales más allá de las células T con CAR para evaluar la eficacia al eludir la barrera hematoencefálica, y también puede ser útil para la evaluación de terapias en modelos murinos de trastornos no oncológicos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needles	BD	511097	1 1/2 inch metal hub
Acrylic resin liquid	Lang Dental	B1323
Acrylic resin powder	Lang Dental	B1323
Alcohol wipes	BD	326895
Centrifuge 5240	Eppendorf	5420000040	Centrifuge
Cotton tipped swabs	Puritan	826-WC	Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500)
Drill bit holder	P1 Technologies	DH-1	Drill bit holder for D56-D70
Drill bit	P1 Technologies	D58	1.07 mm
Dummy cannula	P1 Technologies	C315DCS-5/SPC	Configuration: Small cap;  Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm
Flat tip screwdriver	P1 Technologies	SD-80	Screwdriver
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Forceps
Guide cannula	P1 Technologies	C315GS-5/SPC	Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine	Pascal	1151602
MOXI Z Mini automated cell counter Kit	Moxi	MXZ001	Cell counter
NOD scid gamma (NSG) mice	Jackson Laboratory	5557	6 to 12-week-old males and females
Pasteur pipet	VWR	14673-043
PKG tubing	P1 Technologies	C313CT	Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm
Porcelain 12 well plate	Flinn Scientific	AP6064
Povidone iodine	Medline	MDS093943
Scalpel	World Precision Instrument	50-822-457	Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler
Screws	P1 Technologies	0-80 X 3/32	2.4 mm
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	940	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console
Student fine scissors	Fine Science Tools	91460-12	Scissors
Treatment cannula	P1 Technologies	C315IS-5/SPC	33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm
Treatment syringes	Hamilton	87908	5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3
Vactrap XL	Foxx Life Sciences	305-4401-FLS	Vacuum System