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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Resumen

El cáncer de mama es una enfermedad compleja que se ha clasificado en varios subtipos histológicos y moleculares diferentes. Los organoides tumorales de mama derivados de pacientes desarrollados en nuestro laboratorio consisten en una mezcla de múltiples poblaciones de células derivadas de tumores y, por lo tanto, representan una mejor aproximación de la diversidad y el entorno de las células tumorales que las líneas celulares de cáncer 2D establecidas. Los organoides sirven como un modelo ideal in vitro , lo que permite las interacciones célula-matriz extracelular, que se sabe que desempeñan un papel importante en las interacciones célula-célula y la progresión del cáncer. Los organoides derivados de pacientes también tienen ventajas sobre los modelos de ratón, ya que son de origen humano. Además, se ha demostrado que recapitulan la heterogeneidad genómica, transcriptómica y metabólica de los tumores de los pacientes; Por lo tanto, son capaces de representar la complejidad tumoral, así como la diversidad del paciente. Como resultado, están preparados para proporcionar información más precisa sobre el descubrimiento y la validación de objetivos y los ensayos de sensibilidad a los medicamentos. En este protocolo, proporcionamos una demostración detallada de cómo se establecen los organoides mamarios derivados de pacientes a partir de tumores de mama resecados (organoides de cáncer) o tejido mamario derivado de la mamoplastia reductora (organoides normales). Esto es seguido por una descripción completa del cultivo de organoides 3D, expansión, paso, congelación, así como la descongelación de cultivos de organoides mamarios derivados de pacientes.

Introducción

El cáncer de mama (CB) es la neoplasia maligna más común en las mujeres, con 287,850 nuevos casos estimados para ser diagnosticados en los Estados Unidos en 20221. A pesar de los recientes avances en la detección temprana con exámenes anuales, terapias dirigidas y una mejor comprensión de la predisposición genética, prevalece como la segunda causa principal de muertes por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con > 40,000 muertes atribuidas al cáncer de mama anualmente1. El cáncer de mama se clasifica actualmente en múltiples subtipos basados en la evaluación histopatológica y molecular del tumor primario. Una mejor estratificación del subtipo ha mejorado los resultados de los pacientes con opciones de tratamiento específicas del subtipo2. Por ejemplo, la identificación de HER2 como protooncogén3 ha llevado al desarrollo de Trastuzumab, lo que ha hecho que este subtipo altamente agresivo sea manejable en la mayoría de los pacientes4. La investigación adicional sobre la genética y la transcriptómica de esta enfermedad compleja de una manera específica del paciente ayudará a desarrollar y predecir mejores regímenes de tratamiento personalizados específicos para el paciente 2,5. Los organoides derivados de pacientes (DOP) son un nuevo modelo prometedor para obtener información sobre el cáncer a nivel molecular, identificar nuevos objetivos o biomarcadores y diseñar nuevas estrategias de tratamiento 6,7,8.

Las DOP son estructuras multicelulares tridimensionales (3D) derivadas de muestras de tejido primario recién resecadas 8,9. Se cultivan tridimensionalmente al estar incrustados en una matriz de hidrogel, típicamente compuesta de una combinación de proteínas de matriz extracelular (ECM) y, por lo tanto, se pueden usar para estudiar las interacciones entre células tumorales y ECM. Las PDO representan la diversidad del paciente y recapitulan la heterogeneidad celular y las características genéticas del tumor10,11,12. Al ser modelos in vitro, permiten la manipulación genética y el cribado de fármacos de alto rendimiento13,14,15. Además, las PDO se pueden utilizar de manera plausible para evaluar la sensibilidad a los medicamentos y las estrategias de tratamiento del paciente en paralelo a la clínica y ayudar a predecir los resultados de los pacientes16,17,18. Además de la quimioterapia, también se han utilizado ciertos modelos de organoides para examinar las respuestas individuales de los pacientes a la quimiorradiación19,20. Dada la prometedora aplicabilidad de las PDO para la investigación y el uso clínico, el Instituto Nacional del Cáncer ha iniciado un consorcio internacional, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, para generar y proporcionar estos nuevos modelos de cáncer derivados de tumores. Muchos de los modelos organoides de varios tipos de cáncer desarrollados a través del HCMI están disponibles a través de la American Type Culture Collection (ATCC)22.

Se ha demostrado que los organoides normales de mama están compuestos por diferentes poblaciones de células epiteliales presentes en la glándula mamaria 11,23 y, por lo tanto, sirven como excelentes modelos para estudiar procesos biológicos básicos, analizar mutaciones impulsoras que causan tumorigénesis y estudios de linaje de células cancerosas de origen 6,15 . Se han utilizado modelos de organoides tumorales de mama para identificar nuevas dianas que son alentadoras perspectivas para el desarrollo de nuevas terapias, en particular para tumores resistentes24,25,26. Utilizando xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y modelos organoides derivados de PDX (PDxO) emparejados de tumores de mama resistentes al tratamiento, Guillén et al. demostraron que los organoides son modelos poderosos para la medicina de precisión, que pueden aprovecharse para evaluar las respuestas a los medicamentos y las decisiones de terapia directa de manera paralela28. Además, el desarrollo de nuevos métodos de cocultivo para el cultivo de PDOs con diversas células inmunes27,28,29, fibroblastos 30,31 y microbios 32,33 presenta una oportunidad para estudiar el impacto del microambiente tumoral en la progresión del cáncer. Si bien muchos de estos métodos de cocultivo se están estableciendo activamente para las PDO derivadas de tumores pancreáticos o colorrectales, solo se han informado métodos similares de cocultivo establecidos para las PDO de mama para las células asesinas naturales34 y los fibroblastos35.

El primer biobanco de >100 organoides derivados de pacientes que representan diferentes subtipos de cáncer de mama fue desarrollado por el grupo Hans Clevers36,37. Como parte de este esfuerzo, el grupo Clevers también desarrolló el primer medio de cultivo complejo para el crecimiento de organoides mamarios, que actualmente es ampliamente utilizado36. Un estudio de seguimiento proporcionó una descripción exhaustiva del establecimiento y cultivo de DOP mamarias y xenoinjertos organoides derivados de pacientes (PDOX)38. El laboratorio de Welm desarrolló una gran colección de modelos BC PDX y PDxOs que se cultivan en un medio de crecimiento comparativamente más simple que contiene suero bovino fetal (FBS) y menos factores de crecimiento39,40. Hemos desarrollado y caracterizado de forma independiente una gran variedad de modelos organoides de cáncer de mama naïve derivados de pacientes11, y hemos participado en el desarrollo de modelos BC PDO como parte de la iniciativa HCMI21. Aquí, nuestro objetivo es proporcionar una guía práctica que detalle la metodología empleada por nosotros en la generación de sistemas de modelos de organoides mamarios derivados de pacientes.

Protocolo

Las resecciones tumorales de pacientes con cáncer de mama, junto con el tejido normal distal y adyacente, se obtuvieron de Northwell Health de acuerdo con los protocolos IRB-03-012 e IRB 20-0150 de la Junta de Revisión Institucional, y con el consentimiento informado por escrito de los pacientes.

NOTA: Todos los procedimientos mencionados a continuación se realizaron en una sala BSL2 de cultivo de tejido de mamíferos designada para muestras de pacientes previa aprobación del comité de bioseguridad. Todos los procedimientos deben realizarse siguiendo protocolos de seguridad manteniendo condiciones asépticas en gabinetes de bioseguridad. Cada paso de centrifugación se realiza a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario. Los tejidos / organoides y las existencias de la matriz de la membrana basal siempre se colocan en hielo a menos que se indique lo contrario. Las nuevas placas se incuban durante la noche para el precalentamiento. El revestimiento de domos en placas precalentadas garantiza los mejores resultados para obtener domos redondeados que no se aplanan mientras se recubren o se levantan más tarde de la superficie de la placa.

1. Preparación media y recetas

  1. Prepare los medios acondicionados R-spondin1 como se describe a continuación (alternativamente se pueden comprar comercialmente).
    1. Prepare dos medios de cultivo separados compuestos por el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% FBS, 5% penicilina-estreptomicina y con o sin 300 μg / ml de suplementación con zeocina.
    2. Descongele un vial de células HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (obtenidas del laboratorio de Calvin Kuo en la Universidad de Stanford y también disponibles comercialmente) en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 con 15 ml de medio.
    3. Dividir las células en 2 frascos de cultivo de 175 cm2 , cada uno con 35 ml de medio que contenga zeocina.
    4. Pasar las células de nuevo para obtener tantos matraces como sea necesario para generar el lote deseado de medio acondicionado R-spondin1. Use medio de crecimiento sin zeocina.
    5. Cuando los matraces que contienen medio sin zeocina sean confluentes, retirar y sustituir el medio de cultivo por Ad-DF+++ (paso 1.2; Tabla 1). Colocar las células en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 semana.
    6. Gire el medio a 400 x g durante 5 minutos para eliminar las células no adheridas. Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 μm. Hacer 25 ml de alícuotas y almacenarlas a -20 °C (se pueden conservar hasta 6 meses).
    7. Usando células HEK293T, realice un ensayo dual de luciferasa TOPFLASH41,42 utilizando un reactivo de transfección de ADN comercial en una proporción de reactivo a ADN de 4.8: 1 con el diluyente DMEM (glucosa alta, piruvato). Añadir 100 μL de medio condicionado R-spondin1 (o medio basal para el control negativo) a 100 μL de células transfectadas. Luego, realice el ensayo de luciferasa dual según el protocolo del fabricante para verificar la actividad Wnt del medio acondicionado R-spondin1.
      NOTA: El ensayo utiliza un plásmido TOP con lectura de actividad luciferasa Firefly, y el plásmido FOP se utiliza como control negativo.
  2. Preparar medio basal (medio Ad-DF+++, como ya había publicado Sachs et al.36).
    ReactivoConcentración de existenciasConcentración final
    DMEM/F12 avanzado1x1x
    GlutaMax100x1x
    HEPES2 .10 mM
    Penicilina-estreptomicina10.000 U/ml; 10.000 μg/ml100 U/ml; 100 μg/ml

    Tabla 1: Composición basal del medio Ad-DF+++.
  3. Preparar un medio completo para organoides mamarios derivados de pacientes como se publicó anteriormente por Sachs et al.36.
    ReactivoConcentración de existenciasConcentración final
    Ad-DF+++ medio1x1x
    R-spondin en casa100%10%
    B-27 suplemento50x1x
    Nicotinamida2 .5 mM
    NAC500 mM1,25 mM
    Primocina50 mg/ml50 μg/ml
    Cabeza100 μg/ml100 ng/ml
    FEAG humano5 μg/ml5 ng/ml
    Heregulin humano β1/Neuregulin175 μg/ml37,5 ng/ml
    Y-27632 Diclorhidrato (Rho-quinasa)100 mM5 μM
    A83-015 mM500 nM
    FGF-7 humano100 μg/ml5 ng/ml
    FGF-10 humano1 mg/ml20 ng/ml
    p38i30 mM498 nM

    Tabla 2: Composición media completa para organoides mamarios derivados de pacientes.
  4. Prepare una solución de 2 mg/ml de colagenasa IV pesando la cantidad requerida de polvo de colagenasa IV y solubilizándola en medio basal Ad-DF+++. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm antes de usarlo.
  5. Prepare una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% a partir de una solución madre al 7,5% utilizando 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco como diluyente. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm antes de usarlo.

2. Establecimiento de tumor de mama/organoides normales a partir de tejido resecado (Figura 1)

  1. Transporte un tumor de mama/muestra de tejido normal resecado quirúrgicamente al laboratorio en un tubo cónico de 50 ml que contiene Ad-DF+++. Guarde el tubo en hielo hasta el inicio del aislamiento.
  2. Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C.
  3. Transfiera el tejido resecado a una placa de Petri estéril de 10 cm. Examine el tejido macroscópicamente y tome nota si parece morfológicamente graso, vascularizado o necrótico. Además, registre el tamaño y la forma del tejido. Lo ideal es tomar una fotografía del tejido con una regla a la vista (Figura 2).
  4. Picar el tejido en trozos muy pequeños (~1 mm3) con un bisturí estéril nº 10 y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml.
  5. Agregue 10 ml de solución IV de 2 mg/ml de colagenasa y selle el tubo con una película transparente. Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 30-90 min en una posición angular (ángulo de ~30°).
  6. Durante la incubación, colocar una alícuota de medio completo a precalentar en un baño de perla/maría a 37 °C.
  7. Cada 15 min, resuspender el tejido mezclando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica estéril de 5 ml. Cubra previamente la pipeta con una solución de BSA al 0,5% para evitar la pérdida de tejido causada por la picadura de la muestra. Monitoree la disociación a lo largo del tiempo observando el tubo cónico bajo el microscopio a un aumento de 5x o más.
  8. Una vez disociado el tejido, centrifugar a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de Ad-DF+++ y centrifugar a 400 x g durante 5 min.
  9. Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Los gránulos de tejido ocasionalmente pueden estar sueltos, así que tenga cuidado al aspirar. Repita el paso una vez más.
  10. Si el pellet de tejido está parcialmente rojo, agregue 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. No incubar por más tiempo, ya que esto reducirá significativamente la viabilidad celular.
  11. Agregue 10 ml de Ad-DF+++ al tubo, centrifugar a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 50-300 μL de matriz de membrana basal fría sin diluir y mezclar pipeteando cuidadosamente para evitar la formación de burbujas.
    NOTA: El volumen de la matriz de membrana basal agregada depende del tamaño del pellet. Si no está seguro, coloque una pequeña cúpula de ~ 10 μL del pellet resuspendido y observe la confluencia bajo el microscopio. Ajuste agregando más matriz de membrana basal si es necesario. Consulte la Figura 3 (imagen del día 1) para obtener una densidad de siembra de referencia.
  12. Placa de 300 μL de cúpula de matriz de membrana basal que contiene organoides en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos precalentada, etiquetada. Consulte la Tabla 3 para ver la matriz de membrana basal recomendada y los volúmenes medios si se utilizan placas diferentes.
    Número de pocillos por placaMatriz de membrana basal por domo (μL)Medio por pocillo (μL)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (suspensión en lugar de cúpula)100

    Tabla 3: Cantidad de matriz de membrana basal y medio de crecimiento recomendado por pocillo basado en el tamaño de la placa.
  13. Deje la placa sin perturbaciones en la campana durante 5 minutos y luego colóquela cuidadosamente en la incubadora a 37 °C durante 20-30 minutos para que la cúpula de la matriz de la membrana basal se solidifique completamente.
  14. Añadir 3 ml de medio completo precalentado gota a gota a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y colocar en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Tome imágenes de los organoides usando un objetivo 5x en un microscopio de campo claro invertido.
  15. Reponer el medio cada 4-8 días en función del crecimiento de los organoides. Aspire cuidadosamente el medio viejo sin perturbar la cúpula y agregue un medio fresco y precalentado gota.
    NOTA: El protocolo es el mismo para establecer organoides de cáncer de mama derivados del tumor resecado y para organoides normales derivados de tejido mamario sano resecado (ya sea de tejido mamario adyacente y normal de la misma paciente o tejido mamario sano obtenido de una cirugía de mamoplastia reductiva).

3. Pasar y expandir los organoides mamarios derivados de pacientes en cultivo

  1. Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C.
  2. Levante la cúpula de la matriz de la membrana basal en el medio en el pozo usando un raspador celular o una punta de pipeta de 1 ml.
  3. Recubra previamente la punta de la pipeta con una solución de BSA al 0,5% y luego transfiera la cúpula flotante de los organoides con un tubo cónico de medio a 15 ml o 50 ml, dependiendo del número de pocillos que se cosechan. Para más de dos pocillos que contienen 300 μL de domos de matriz de membrana basal, use un tubo cónico de 50 ml. Agregue 1x DPBS para aumentar el volumen a al menos 5 ml.
  4. Girar los tubos a 400 x g durante 5 min. La matriz de la membrana basal con organoides forma una capa en la parte inferior. Aspirar cuidadosamente para eliminar el sobrenadante.
  5. Agregue 5-20 ml de 1x DPBS, dependiendo de la cantidad de pozos agrupados en un tubo. Cubra previamente una pipeta desechable estéril con BSA al 0,5% y mezcle el pellet de matriz de membrana basal organoide en DPBS uniformemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  6. Girar los tubos a 400 x g durante 5 min. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  7. Agregue reactivo de disociación celular a tres veces el volumen de la matriz de la membrana basal al tubo. Usando una punta de pipeta recubierta con BSA al 0,5%, resuspender los organoides en el reactivo de disociación celular.
  8. Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 8-15 min en posición angulosa. Controle el tubo observándolo bajo el microscopio cada 5 minutos para asegurarse de que los organoides se descompongan en grupos más pequeños.
  9. Agregue un medio basal (es decir, Ad-DF +++) a un volumen igual o mayor que el reactivo de disociación celular, y pipetear para mezclar los organoides. Girar a 400 x g durante 5 min a RT para obtener un pellet de organoide.
  10. Si el pellet contiene organoides aún incrustados dentro de la matriz de la membrana basal no disuelta, repita los pasos 3.7-3.9 durante 5-8 minutos adicionales de tripsinización.
  11. Una vez que se obtenga un pellet de organoide blanco sin matriz de membrana basal no disuelta, deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de Ad-DF +++ para resuspender el pellet mediante pipeteo. Luego agregue más Ad-DF +++ hasta 10 ml.
  12. Girar a 400 x g durante 5 min en RT para el paso de lavado. Aspirar y desechar el sobrenadante.
  13. Agregue la cantidad requerida de matriz de membrana basal a los organoides digeridos en función de la proporción de división apropiada (esto variará ampliamente para cada línea de organoides según la tasa de crecimiento). Consulte la Figura 3 (imagen del día 1) para ver un ejemplo de densidad de siembra. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar crear burbujas. Colocar inmediatamente sobre hielo.
  14. Abra y etiquete una placa de 6 pocillos precalentada. Se recomienda colocar una cúpula de 10-20 μL en la esquina de un pozo para observar la confluencia bajo el microscopio. Si los organoides son confluentes, se puede agregar más matriz de membrana basal para aumentar la relación de división.
  15. Domos en placa de 300 μL de organoides resuspendidos en matriz de membrana basal. Asegúrese de mantener el tubo en hielo mientras cubre múltiples pocillos para que la matriz de la membrana basal permanezca en solución.
  16. Deje la placa sin perturbaciones en la campana durante 5 minutos y luego colóquela cuidadosamente en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 sin alterar las cúpulas.
  17. Después de 20-30 minutos, las cúpulas se solidifican. Agregue 3 ml de medio completo precalentado a cada pocillo y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Agregue un medio completo fresco cada 5-7 días. Realizar pruebas rutinarias de los cultivos para detectar la contaminación por micoplasma.
    NOTA: El protocolo para el cultivo de tumores de mama y organoides normales es el mismo. Sin embargo, en nuestra experiencia, los organoides normales tienden a crecer bien hasta el pasaje 6-8 antes de disminuir la velocidad. Es aconsejable hacer tantas existencias de paso temprano como sea posible para futuras investigaciones.

4. Congelación de organoides mamarios derivados de pacientes

  1. Pasar pozos confluentes de organoides para eliminar cualquier matriz de membrana basal, como se indica en los pasos 3.1-3.12.
  2. Resuspender el pellet de organoides en medio de congelación celular (descongelado durante la noche a 4 ºC) con 1 mL de medio por cada 200-300 μL de volumen de matriz de membrana basal antes de pasar por deaging. Realice un recuento de células antes de congelar como referencia. Alícuota un pequeño volumen (al menos 100 μL) de células para someterse a una tripsinización adicional, si es necesario, para obtener células individuales, y luego contarlas usando una máquina contadora de células.
  3. Transfiera 1 ml de células a crioviales de 2 ml marcados con el número de línea del organoide, la fecha y el número de pasaje. Asegúrese de etiquetar los tubos con un marcador permanente o use crioetiquetas.
  4. Mover los viales a un recipiente de congelación de celdas y transferir el recipiente a un congelador a -80 °C. Después de la incubación durante la noche, los viales están listos para ser trasladados a un congelador de almacenamiento de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

5. Descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes

  1. Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C. Precaliente Ad-DF+++ medio a 37 °C. Alícuota 9 ml de medio precalentado en tubos cónicos de 15 ml para cada vial congelado.
  2. Descongelar rápidamente el vial congelado de organoides colocándolo en un baño de perlas a 37 °C. Rocíe etanol al 70% y transfiera el tubo al gabinete de bioseguridad.
  3. Enjuague la punta de la pipeta con una solución BSA al 0,5% para evitar la pérdida de organoides. Mezcle los organoides descongelados suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar los organoides sedimentados en el tubo.
  4. Transfiera suavemente 1 ml de organoides congelados a 9 ml de Ad-DF+++ precalentado gota. Gire las celdas a 400 x g durante 5 minutos y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  5. Lave el pellet agregando 10 ml de Ad-DF+++ fresco precalentado al pellet organoide y mezcle suavemente con una pipeta prerecubierta con BSA al 0,5% para resuspender el pellet. Gire las celdas a 400 x g durante 5 minutos y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  6. Coloque el pellet organoide en hielo y retire cualquier remanente de Ad-DF+++ con cuidado utilizando una punta de pipeta de menor volumen. Resuspender el pellet en 300 μL de matriz de membrana basal y placa en una placa de 6 pocillos precalentada. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% deCO2.
    NOTA: Se recomienda colocar una pequeña cúpula de 10 μL del pellet resuspendido en una esquina del pozo para discernir la confluencia bajo el microscopio. Si los organoides parecen confluentes, diluir agregando 300 μL de matriz de membrana basal a la placa en dos pocillos de una placa de 6 pocillos.
  7. Después de una incubación de 20-30 minutos, agregue 3 ml de medio completo precalentado a la cúpula solidificada.

Resultados

Hemos establecido un biobanco de organoides tumorales de mama derivados de pacientes que comprende varios subtipos11. Además, hemos establecido múltiples líneas organoides mamarias normales derivadas de muestras de tejido de mamoplastia reductora o mama normal adyacente/distal de pacientes con BC utilizando el enfoque descrito en la Figura 1.

Las diversas líneas organoides de tumores de mama derivados de pacientes difieren en su morfolo...

Discusión

Nuestro laboratorio ha empleado con éxito los protocolos anteriores para establecer organoides a partir de resecciones o raspados tumorales ingenuos. También hemos utilizado este protocolo para desarrollar organoides normales a partir de tejido mamario obtenido a través de mamoplastias reductoras o de tejido mamario normal adyacente o distal de pacientes con cáncer. Alrededor de 30 a 40 % de los tumores primarios resecados dieron lugar a cultivos de organoides tumorales exitosos a largo plazo (paso 8 >). Las...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Spector por las discusiones críticas a lo largo de este trabajo. Agradecemos a Norman Sachs y Hans Clevers (Hubrecht Institute, Países Bajos) por proporcionarnos inicialmente su protocolo de cultivo de organoides. Reconocemos los Recursos Compartidos de Histología y Microscopía del Centro Oncológico de CSHL por sus servicios y experiencia técnica (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos al Dr. Qing Gao por su ayuda con la preparación de muestras histológicas. Estamos agradecidos por el apoyo de la Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por proporcionar muestras de tumores de pacientes. También apreciamos los esfuerzos del equipo de Northwell Health Biobanking para la adquisición de muestras, y agradecemos a los pacientes y sus familias por donar tejidos para la investigación. Esta investigación fue apoyada por CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) y Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson y D.L.S).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubesVWR525-1068
175 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubesVWR525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well culture plates Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-304
96-well opaque platesCorning353296For CTG assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent cell viability assay
Centrifuge Eppendorf5804
Collagenase from Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (human)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (human)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216 For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellsR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (human)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)Corning356231Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing ContainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detection kitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteineMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (human)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparent film
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010cell freezing medium
Red Blood Cell lysis bufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin conditioned mediaIn-house or commercial from Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redLife Technologies12605028cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

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