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Résumé

Un protocole détaillé est fourni ici pour établir des organoïdes mammaires humains à partir de résections de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou de tissu mammaire normal. Le protocole fournit des instructions complètes étape par étape pour la culture, la congélation et la décongélation d’organoïdes mammaires humains dérivés de patientes.

Résumé

Le cancer du sein est une maladie complexe qui a été classée en plusieurs sous-types histologiques et moléculaires différents. Les organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patients développés dans notre laboratoire consistent en un mélange de plusieurs populations cellulaires dérivées de tumeurs et représentent donc une meilleure approximation de la diversité et du milieu des cellules tumorales que les lignées cellulaires cancéreuses 2D établies. Les organoïdes servent de modèle in vitro idéal, permettant des interactions de matrice cellule-extracellulaire, connues pour jouer un rôle important dans les interactions cellule-cellule et la progression du cancer. Les organoïdes dérivés de patients présentent également des avantages par rapport aux modèles murins car ils sont d’origine humaine. En outre, il a été démontré qu’ils récapitulent l’hétérogénéité génomique, transcriptomique et métabolique des tumeurs des patients; Ainsi, ils sont capables de représenter la complexité tumorale ainsi que la diversité des patients. En conséquence, ils sont prêts à fournir des informations plus précises sur la découverte et la validation des cibles et les tests de sensibilité aux médicaments. Dans ce protocole, nous fournissons une démonstration détaillée de la façon dont les organoïdes mammaires dérivés de patients sont établis à partir de tumeurs mammaires réséquées (organoïdes cancéreux) ou de tissus mammaires dérivés de mammoplasties réductrices (organoïdes normaux). Ceci est suivi d’un compte rendu complet de la culture organoïde 3D, de l’expansion, du passage, de la congélation, ainsi que de la décongélation de cultures organoïdes mammaires dérivées de patientes.

Introduction

Le cancer du sein (BC) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes, avec 287 850 nouveaux cas estimés diagnostiqués aux États-Unis en 20221. Malgré les progrès récents de la détection précoce avec des dépistages annuels, des thérapies ciblées et une meilleure compréhension de la prédisposition génétique, il prévaut être la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes aux États-Unis, avec > 40 000 décès attribués au cancer du sein chaque année1. Le cancer du sein est actuellement classé en plusieurs sous-types basés sur l’évaluation histopathologique et moléculaire de la tumeur primaire. Une meilleure stratification des sous-types a amélioré les résultats pour les patients grâce à des options de traitement spécifiques au sous-type2. Par exemple, l’identification de HER2 en tant que proto-oncogène3 a conduit au développement du trastuzumab, ce qui a rendu ce sous-type très agressif gérable chez la plupart des patients4. D’autres recherches sur la génétique et la transcriptomique de cette maladie complexe d’une manière spécifique au patient aideront à développer et à prédire de meilleurs schémas thérapeutiques personnalisés spécifiques au patient 2,5. Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont un nouveau modèle prometteur pour mieux comprendre le cancer au niveau moléculaire, identifier de nouvelles cibles ou biomarqueurs et concevoir de nouvelles stratégies de traitement 6,7,8.

Les AOP sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) dérivées d’échantillons de tissus primaires fraîchement réséqués 8,9. Ils sont cultivés en trois dimensions en étant incorporés dans une matrice d’hydrogel, généralement composée d’une combinaison de protéines de la matrice extracellulaire (ECM), et peuvent donc être utilisés pour étudier les interactions cellule-ECM tumorale. Les AOP représentent la diversité des patients et récapitulent l’hétérogénéité cellulaire et les caractéristiques génétiques de la tumeur10,11,12. Étant des modèles in vitro, ils permettent la manipulation génétique et les criblages de médicaments à haut débit13,14,15. De plus, les AOP peuvent être utilisées de manière plausible pour évaluer la sensibilité des patients aux médicaments et les stratégies de traitement parallèlement à la clinique et aider à prédire les résultats pour les patients16,17,18. Outre la chimiothérapie, certains modèles organoïdes ont également été utilisés pour examiner les réponses individuelles des patients à la chimioradiothérapie19,20. Compte tenu de l’applicabilité prometteuse des AOP pour la recherche et l’utilisation clinique, le National Cancer Institute a lancé un consortium international, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, pour générer et fournir ces nouveaux modèles de cancer dérivés de tumeurs. Bon nombre des modèles organoïdes de divers types de cancer développés par l’intermédiaire de l’ICMH sont disponibles via l’American Type Culture Collection (ATCC)22.

Il a été démontré que les organoïdes mammaires normaux sont composés de différentes populations de cellules épithéliales présentes dans la glande mammaire 11,23 et servent donc d’excellents modèles pour étudier les processus biologiques de base, pour analyser les mutations conductrices causant la tumorigenèse et pour les études de lignée cancéreuse 6,15 . Des modèles organoïdes de tumeurs mammaires ont été utilisés pour identifier de nouvelles cibles qui ouvrent des perspectives encourageantes pour le développement de nouvelles thérapies, en particulier pour les tumeurs résistantes24,25,26. En utilisant des xénogreffes dérivées de patients (PDX) et des modèles organoïdes dérivés de PDX appariés (PDxO) de tumeurs mammaires résistantes au traitement, Guillen et al. ont montré que les organoïdes sont des modèles puissants pour la médecine de précision, qui peuvent être exploités pour évaluer les réponses aux médicaments et diriger les décisions thérapeutiques en parallèle28. De plus, le développement de nouvelles méthodes de co-culture pour la culture d’AOP avec diverses cellules immunitaires27,28,29, fibroblastes 30,31 et microbes 32,33 présente une opportunité d’étudier l’impact du microenvironnement tumoral sur la progression du cancer. Alors que de nombreuses méthodes de co-culture de ce type sont activement établies pour les AOP dérivées de tumeurs pancréatiques ou colorectales, des méthodes de co-culture similaires établies pour les AOP mammaires n’ont été signalées que pour les cellules tueuses naturelles34 et les fibroblastes35.

La première biobanque de >100 organoïdes dérivés de patients représentant différents sous-types de cancer du sein a été développée par le groupe Hans Clevers36,37. Dans le cadre de cet effort, le groupe Clevers a également développé le premier milieu de culture complexe pour la croissance organoïde mammaire, qui est actuellement largement utilisé36. Une étude de suivi a fourni un compte rendu complet de l’établissement et de la culture des AOP mammaires et des xénogreffes organoïdes dérivées de patientes (PDOX)38. Le laboratoire Welm a développé une vaste collection de modèles BC PDX et PDxO qui sont cultivés dans un milieu de croissance comparativement plus simple contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et moins de facteurs de croissance39,40. Nous avons indépendamment développé et caractérisé un large éventail de modèles organoïdes de cancer du sein naïfs dérivés de patientes11, et participé à l’élaboration de modèles PDO BC dans le cadre de l’initiative HCMI21. Ici, nous visons à fournir un guide pratique détaillant la méthodologie que nous employons pour générer des systèmes modèles organoïdes mammaires dérivés de patientes.

Protocole

Les résections tumorales de patientes atteintes d’un cancer du sein, ainsi que les tissus normaux distaux et adjacents, ont été obtenues auprès de Northwell Health conformément aux protocoles IRB-03-012 et IRB 20-0150 du comité d’examen institutionnel, et avec le consentement éclairé écrit des patientes.

REMARQUE : Toutes les interventions mentionnées ci-dessous ont été effectuées dans une salle de culture tissulaire de mammifères BSL2 désignée pour les échantillons de patients après approbation du comité de biosécurité. Toutes les procédures doivent être effectuées en suivant les protocoles de sécurité en maintenant des conditions aseptiques dans les enceintes de biosécurité. Chaque étape de centrifugation est effectuée à température ambiante (RT), sauf indication contraire. Les tissus/organoïdes et les stocks de matrice membranaire basale sont toujours placés sur de la glace, sauf indication contraire. Les nouvelles plaques sont incubées pendant la nuit pour le préchauffage. Les dômes de placage sur des plaques préchauffées garantissent les meilleurs résultats pour obtenir des dômes arrondis qui ne s’aplatissent pas lors du placage ou du décollage ultérieur de la surface de la plaque.

1. Préparation moyenne et recettes

  1. Préparer les milieux conditionnés par R-spondin1 comme décrit ci-dessous (peut également être acheté dans le commerce).
    1. Préparer deux milieux de culture distincts composés du milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, de 10 % de FBS, de 5 % de pénicilline-streptomycine et avec ou sans supplémentation en zéocine de 300 μg/mL.
    2. Décongeler un flacon de cellules HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (obtenues dans le laboratoire de Calvin Kuo à l’Université de Stanford et également disponibles dans le commerce) dans une fiole de culture tissulaire de 75cm2 contenant 15 ml de milieu.
    3. Diviser les cellules en 2 flacons de culture de 175 cm2 , chacun contenant 35 mL de milieu contenant de la zéocine.
    4. Repasser les cellules pour obtenir autant de flacons que nécessaire pour générer le lot souhaité de milieu conditionné à la R-spondine1. Utilisez un milieu de croissance sans zéocine.
    5. Lorsque les fioles contenant un milieu sans zéocine sont confluentes, retirer et remplacer le milieu de culture par Ad-DF+++ (étape 1.2 ; Tableau 1). Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 1 semaine.
    6. Faire tourner le milieu à 400 x g pendant 5 minutes pour enlever toutes les cellules non attachées. Filtrer le milieu à travers un filtre de 0,22 μm. Fabriquer des aliquotes de 25 mL et les conserver à -20 °C (peut être conservé jusqu’à 6 mois).
    7. À l’aide de cellules HEK293T, effectuer un double dosage de luciférase TOPFLASH41,42 en utilisant un réactif de transfection d’ADN commercial à un rapport réactif/ADN de 4,8:1 avec le diluant DMEM (glucose élevé, pyruvate). Ajouter 100 μL de milieu conditionné à la R-spondine1 (ou milieu basal pour le témoin négatif) à 100 μL de cellules transfectées. Ensuite, effectuez le double test de luciférase selon le protocole du fabricant pour vérifier l’activité Wnt du milieu conditionné à la R-spondine1.
      REMARQUE: Le test utilise un plasmide TOP avec lecture de l’activité luciférase Firefly, et le plasmide FOP est utilisé comme témoin négatif.
  2. Préparer le milieu basal (milieu Ad-DF+++, tel que publié précédemment par Sachs et al.36).
    RéactifConcentration des stocksConcentration finale
    DMEM/F12 avancé1x1x
    GlutaMax100x1x
    HEPES2 .10 mM
    Pénicilline-streptomycine10 000 U/mL; 10 000 μg/mL100 U/mL; 100 μg/mL

    Tableau 1 : Composition basale du milieu Ad-DF+++.
  3. Préparer un milieu complet pour les organoïdes mammaires dérivés de patientes, tel que publié précédemment par Sachs et al.36.
    RéactifConcentration des stocksConcentration finale
    Ad-DF+++ moyen1x1x
    R-spondin en interne100%10%
    Supplément B-2750x1x
    Nicotinamide2 .5 mM
    CNA500 mM1,25 mM
    Primocin50 mg/mL50 μg/mL
    Noggin100 μg/mL100 ng/mL
    EGF humain5 μg/mL5 ng/mL
    Héréguline humaine β1/Neuréguline175 μg/mL37,5 ng/mL
    Y-27632 Dichlorhydrate (Rho-kinase)100 mM5 μM
    A83-015 mM500 nM
    FGF-7 humain100 μg/mL5 ng/mL
    FGF-10 humain1 mg/mL20 ng/mL
    p38i30 mM498 nM

    Tableau 2 : Composition moyenne complète pour les organoïdes mammaires dérivés de patientes.
  4. Préparer 2 mg/mL de solution de collagénase IV en pesant la quantité requise de collagénase IV en poudre et en la solubilisant dans un milieu basal Ad-DF+++. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
  5. Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % à partir d’une solution mère à 7,5 % en utilisant 1x la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco comme diluant. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.

2. Établissement d’une tumeur du sein/organoïdes normaux à partir de tissus réséqués (Figure 1)

  1. Transporter une tumeur mammaire réséquée chirurgicalement ou un échantillon de tissu normal au laboratoire dans un tube conique de 50 ml contenant Ad-DF+++. Rangez le tube sur de la glace jusqu’au début de l’isolement.
  2. Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C.
  3. Transférer le tissu réséqué dans une boîte de Petri stérile de 10 cm. Examinez le tissu macroscopiquement et notez s’il semble morphologiquement gras, vascularisé ou nécrotique. De plus, notez la taille et la forme du tissu. Idéalement, prenez une photo du tissu avec une règle en vue (Figure 2).
  4. Hacher le tissu en très petits morceaux (~1 mm3) avec un scalpel stérile no 10 et le transférer dans un tube conique de 50 mL.
  5. Ajouter 10 mL de solution de collagénase IV à 2 mg/mL et sceller le tube avec un film transparent. Placer le tube sur un agitateur orbital à 37 °C à 140 tr/min pendant 30-90 min en position inclinée (angle ~30°).
  6. Pendant l’incubation, placer une partie aliquote de milieu complet à préchauffer dans un bain-marie à 37 °C.
  7. Toutes les 15 minutes, remettre le tissu en suspension en mélangeant vigoureusement de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 5 mL. Pré-enduire la pipette d’une solution de BSA à 0,5 % pour éviter la perte de tissu causée par l’adhérence de l’échantillon à la pipette. Surveillez la dissociation au fil du temps en observant le tube conique au microscope à un grossissement de 5x ou plus.
  8. Une fois le tissu dissocié, centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant, ajouter 10 mL d’Ad-DF+++ et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
  9. Jetez soigneusement le surnageant. Les granulés de tissu peuvent parfois être lâches, alors soyez prudent lorsque vous aspirez. Répétez l’étape une fois de plus.
  10. Si la pastille tissulaire est partiellement rouge, ajouter 2 mL de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. N’incuber pas plus longtemps, car cela réduirait considérablement la viabilité cellulaire.
  11. Ajouter 10 mL d’Ad-DF+++ dans le tube, centrifuger à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 50 à 300 μL de matrice membranaire basale froide non diluée et mélangez en pipetant soigneusement pour éviter de former des bulles.
    REMARQUE : Le volume de la matrice membranaire basale ajoutée dépend de la taille des granulés. En cas de doute, placez un petit dôme de ~10 μL à partir de la pastille remise en suspension et observez la confluence au microscope. Ajustez en ajoutant plus de matrice membranaire basale si nécessaire. Reportez-vous à la figure 3 (image du jour 1) pour connaître la densité de semis de référence.
  12. Plaque de 300 μL de dôme à matrice membranaire basale contenant des organoïdes dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire préchauffée et marquée à 6 puits. Se reporter au tableau 3 pour connaître la matrice de membrane basale recommandée et les volumes moyens si vous utilisez différentes plaques.
    Nombre de puits par plaqueMatrice de membrane basale par dôme (μL)Milieu par puits (μL)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (suspension au lieu de dôme)100

    Tableau 3 : Quantité de matrice membranaire basale et de milieu de croissance recommandée par puits en fonction de la taille de la plaque.
  13. Laisser la plaque intacte dans la hotte pendant 5 minutes, puis placer soigneusement dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min pour que le dôme à matrice membranaire basale se solidifie complètement.
  14. Ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé goutte à goutte dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et placer dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Prenez des images des organoïdes à l’aide d’un objectif 5x sur un microscope à fond clair inversé.
  15. Reconstituer le milieu tous les 4-8 jours en fonction de la croissance des organoïdes. Aspirez soigneusement l’ancien milieu sans déranger le dôme et ajoutez un milieu frais et préchauffé goutte à goutte.
    REMARQUE: Le protocole est le même pour l’établissement d’organoïdes du cancer du sein dérivés de la tumeur réséquée et pour les organoïdes normaux dérivés de tissus mammaires sains réséqués (soit à partir de tissu mammaire adjacent et normal du même patient, soit à partir de tissu mammaire sain obtenu à partir d’une mammoplastie réductrice).

3. Passage et expansion des organoïdes mammaires dérivés de patientes en culture

  1. Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C.
  2. Soulevez le dôme de matrice membranaire du socle dans le milieu du puits à l’aide d’un racleur de cellule ou d’une pointe de pipette de 1 mL.
  3. Pré-enduire l’extrémité de la pipette avec une solution de BSA à 0,5%, puis transférer le dôme flottant des organoïdes avec un tube conique de 15 ml ou 50 ml, selon le nombre de puits récoltés. Pour plus de deux puits contenant 300 μL de dômes matriciels à membrane basale, utilisez un tube conique de 50 mL. Ajouter 1x DPBS pour augmenter le volume à au moins 5 mL.
  4. Faire tourner les tubes à 400 x g pendant 5 min. La matrice membranaire basale avec organoïdes forme une couche au fond. Aspirer soigneusement pour enlever le surnageant.
  5. Ajouter 5 à 20 ml de 1x DPBS, selon le nombre de puits regroupés dans un tube. Pré-enduire une pipette jetable stérile de 0,5% de BSA et mélanger uniformément la pastille de matrice membranaire basale organoïde dans DPBS en pipetant de haut en bas.
  6. Faire tourner les tubes à 400 x g pendant 5 min. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant.
  7. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire à trois fois le volume de la matrice membranaire basale au tube. À l’aide d’une pointe de pipette recouverte de BSA à 0,5 %, remettre en suspension les organoïdes dans le réactif de dissociation cellulaire.
  8. Placer le tube sur un agitateur orbital à 37 °C à 140 tr/min pendant 8 à 15 min en position inclinée. Surveillez le tube en l’observant au microscope toutes les 5 minutes pour vous assurer que les organoïdes sont décomposés en grappes plus petites.
  9. Ajouter un milieu basal (c.-à-d. Ad-DF+++) à un volume égal ou supérieur au réactif de dissociation cellulaire et une pipette pour mélanger les organoïdes. Faire tourner à 400 x g pendant 5 min à TA pour obtenir une pastille organoïde.
  10. Si la pastille contient des organoïdes encore incorporés dans la matrice membranaire basale non dissoute, répétez les étapes 3.7-3.9 pendant 5-8 minutes supplémentaires de trypsinisation.
  11. Une fois qu’une pastille organoïde blanche sans matrice membranaire basale non dissoute est obtenue, jeter le surnageant et ajouter 1 mL d’Ad-DF+++ pour remettre la pastille en suspension par pipetage. Ajoutez ensuite plus d’Ad-DF+++ jusqu’à 10 mL.
  12. Faire tourner à 400 x g pendant 5 min à TA pour l’étape de lavage. Aspirer et jeter le surnageant.
  13. Ajouter la quantité requise de matrice membranaire basale aux organoïdes digérés en fonction du rapport de division approprié (cela variera considérablement pour chaque lignée organoïde en fonction du taux de croissance). Reportez-vous à la figure 3 (image du jour 1) pour un exemple de densité de semis. Mélanger en pipitant doucement de haut en bas pour éviter de créer des bulles. Placer immédiatement sur la glace.
  14. Ouvrez et étiquetez une plaque préchauffée à 6 puits. Il est recommandé de plaquer un dôme de 10 à 20 μL dans le coin d’un puits pour observer la confluence au microscope. Si les organoïdes sont confluents, plus de matrice membranaire basale peut être ajoutée pour augmenter le rapport de division.
  15. Dômes de 300 μL d’organoïdes remis en suspension dans la matrice membranaire basale. Assurez-vous de garder le tube sur la glace tout en plaquant plusieurs puits afin que la matrice de membrane basale reste en solution.
  16. Laisser la plaque intacte dans la hotte pendant 5 min, puis placer délicatement dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2 sans déranger les dômes.
  17. Après 20-30 min, les dômes se solidifient. Ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé à chaque puits et remettre la plaque dans l’incubateur. Ajouter le milieu complet frais tous les 5-7 jours. Effectuer des tests de routine des cultures pour détecter la contamination par les mycoplasmes.
    REMARQUE: Le protocole pour la culture des tumeurs du sein et des organoïdes normaux est le même. Cependant, selon notre expérience, les organoïdes normaux ont tendance à bien croître jusqu’au passage 6-8 avant de ralentir. Il est conseillé de constituer autant de stocks de passage précoce que possible pour les recherches futures.

4. Congélation d’organoïdes mammaires dérivés de patientes

  1. Passage des puits confluents d’organoïdes pour éliminer toute matrice membranaire basale, comme indiqué aux étapes 3.1-3.12.
  2. Resuspendre la pastille d’organoïdes dans un milieu de congélation cellulaire (décongelée pendant une nuit à 4 ºC) avec 1 mL de milieu par 200-300 μL de volume de matrice membranaire basale avant passage. Effectuez un comptage de cellules avant de geler pour référence. Aliquote un petit volume (au moins 100 μL) de cellules pour subir une trypsinisation supplémentaire, si nécessaire, pour obtenir des cellules individuelles, puis les compter à l’aide d’une machine de compteur de cellules.
  3. Transférer 1 mL de cellules dans des cryoviales de 2 mL marquées avec le numéro de ligne organoïde, la date et le numéro de passage. Assurez-vous d’étiqueter les tubes avec un marqueur permanent ou d’utiliser des cryoétiquettes.
  4. Déplacer les flacons dans un récipient de congélation cellulaire et transférer le contenant dans un congélateur à -80 °C. Après l’incubation pendant la nuit, les flacons sont prêts à être déplacés vers un congélateur de stockage d’azote liquide pour un stockage à long terme.

5. Décongélation des organoïdes mammaires dérivés de patientes

  1. Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C. Préchauffer Ad-DF+++ à 37 °C. Aliquote 9 mL de milieu préchauffé dans des tubes coniques de 15 mL pour chaque flacon congelé.
  2. Décongeler rapidement le flacon congelé d’organoïdes en le plaçant dans un bain de perles à 37 °C. Pulvériser de l’éthanol à 70% et transférer le tube dans l’enceinte de biosécurité.
  3. Rincer l’embout de la pipette avec une solution de BSA à 0,5 % pour éviter la perte d’organoïdes. Mélanger doucement les organoïdes décongelés en pipetant de haut en bas pour mélanger les organoïdes déposés dans le tube.
  4. Transférer doucement 1 mL d’organoïdes congelés à 9 mL d’Ad-DF+++ préchauffé goutte à goutte. Faites tourner les cellules à 400 x g pendant 5 minutes, puis jetez soigneusement le surnageant.
  5. Lavez la pastille en ajoutant 10 ml d’Ad-DF+++ frais préchauffé à la pastille organoïde et mélangez doucement avec une pipette pré-enduite de BSA à 0,5 % pour remettre la pastille en suspension. Faites tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min et jetez soigneusement le surnageant.
  6. Placez la pastille organoïde sur de la glace et retirez soigneusement tout Ad-DF+++ restant à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit volume. Resuspendre la pastille dans 300 μL de matrice membranaire basale et plaque dans une plaque préchauffée à 6 puits. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2.
    NOTE: Il est recommandé de plaquer un petit dôme de 10 μL de la pastille remise en suspension dans un coin du puits pour discerner la confluence au microscope. Si les organoïdes semblent confluents, diluer en ajoutant 300 μL de matrice membranaire basale à la plaque dans deux puits d’une plaque de 6 puits.
  7. Après une incubation de 20 à 30 minutes, ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé au dôme solidifié.

Résultats

Nous avons établi une biobanque d’organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patientes comprenant divers sous-types11. De plus, nous avons établi plusieurs lignées organoïdes mammaires normales dérivées d’échantillons de tissus de mammoplastie réductrice ou de seins normaux adjacents/distaux de patientes de la Colombie-Britannique en utilisant l’approche décrite à la figure 1.

Les différentes lignées organoïdes de tumeur...

Discussion

Notre laboratoire a utilisé avec succès les protocoles ci-dessus pour établir des organoïdes à partir de résections ou de raclages de tumeurs naïves. Nous avons également utilisé ce protocole pour développer des organoïdes normaux à partir de tissu mammaire obtenu par mammomoplasties réductrices ou à partir du tissu mammaire normal adjacent ou distal des patientes cancéreuses. Environ 30% à 40% des tumeurs primaires réséquées ont abouti à des cultures organoïdes tumorales réussies à long t...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Spector pour les discussions critiques tout au long de ce travail. Nous remercions Norman Sachs et Hans Clevers (Hubrecht Institute, Pays-Bas) de nous avoir initialement fourni leur protocole de culture organoïde. Nous remercions les ressources partagées en histologie et microscopie du CSHL Cancer Center pour leurs services et leur expertise technique (NCI 2P3OCA45508). Nous remercions le Dr Qing Gao pour son aide dans la préparation des échantillons histologiques. Nous sommes reconnaissants du soutien de la Dre Karen Kostroff (Northwell Health) pour avoir fourni des échantillons de tumeurs aux patients. Nous apprécions également les efforts de l’équipe de Northwell Health Biobanking pour l’acquisition d’échantillons, et nous remercions les patients et leurs familles d’avoir fait don de tissus pour la recherche. Cette recherche a été financée par CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) et Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson et D.L.S).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubesVWR525-1068
175 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubesVWR525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well culture plates Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-304
96-well opaque platesCorning353296For CTG assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent cell viability assay
Centrifuge Eppendorf5804
Collagenase from Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (human)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (human)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216 For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellsR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (human)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)Corning356231Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing ContainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detection kitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteineMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (human)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparent film
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010cell freezing medium
Red Blood Cell lysis bufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin conditioned mediaIn-house or commercial from Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redLife Technologies12605028cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

Références

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
  22. . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

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