JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

Abstract

סרטן השד היא מחלה מורכבת שסווגה למספר תת-סוגים היסטולוגיים ומולקולריים שונים. אורגנואידים של גידולי שד שמקורם במטופל שפותחו במעבדה שלנו מורכבים מתערובת של אוכלוסיות תאים מרובות שמקורן בגידול, ולכן מייצגים קירוב טוב יותר של מגוון תאי הגידול והסביבה מאשר קווי התאים הסרטניים הדו-ממדיים שנקבעו. אורגנואידים משמשים כמודל אידיאלי במבחנה, המאפשר אינטראקציות מטריצה תאית-חוץ-תאית, הידועות כממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות תא-תא ובהתקדמות סרטן. לאורגנואידים שמקורם במטופל יש גם יתרונות על פני מודלים של עכברים מכיוון שהם ממקור אנושי. יתר על כן, הם הוכחו כדי לשחזר את ההטרוגניות הגנומית, transcriptomic כמו גם מטבולית של גידולים החולים; לפיכך, הם מסוגלים לייצג את מורכבות הגידול כמו גם את מגוון המטופלים. כתוצאה מכך, הם ערוכים לספק תובנות מדויקות יותר לגבי גילוי ואימות מטרות ומבחני רגישות לתרופות. בפרוטוקול זה, אנו מספקים הדגמה מפורטת של האופן שבו אורגנואידי שד שמקורם במטופל נקבעים מגידולי שד שנכרתו (אורגנואידים סרטניים) או מרקמת שד רדוקטיבית שמקורה בממופלסטיקה (אורגנואידים רגילים). זה ואחריו תיאור מקיף של תרבית אורגנואידים תלת ממדית, הרחבה, מעבר, הקפאה, כמו גם הפשרה של תרביות אורגנואידים שד שמקורם במטופל.

Introduction

סרטן השד (BC) הוא הממאירות הנפוצה ביותר בקרב נשים, עם 287,850 מקרים חדשים שאובחנו בארצות הברית בשנת 20221. למרות ההתקדמות האחרונה בגילוי מוקדם עם בדיקות סקר שנתיות, טיפולים ממוקדים והבנה טובה יותר של נטייה גנטית, הוא נחשב לגורם השני המוביל למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית, עם >40,000 מקרי מוות המיוחסים לסרטן השד מדי שנה1. סרטן השד מסווג כיום למספר תת-סוגים בהתבסס על הערכה היסטופתולוגית ומולקולרית של הגידול הראשוני. ריבוד טוב יותר של תת-סוג שיפר את תוצאות המטופלים עם אפשרויות טיפול ספציפיות לתת-סוג2. לדוגמה, הזיהוי של HER2 כאב-אונקוגן3 הוביל לפיתוח של Trastuzumab, אשר הפך את תת-הסוג האגרסיבי הזה לניהול ברוב החולים4. מחקר נוסף על הגנטיקה והשעתוק של מחלה מורכבת זו באופן ספציפי למטופל יסייע בפיתוח וחיזוי משטרי טיפול מותאמים אישית ספציפיים למטופלטובים יותר 2,5. אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם מודל חדש ומבטיח להשגת תובנות לגבי סרטן ברמה המולקולרית, זיהוי מטרות חדשות או סמנים ביולוגיים ועיצוב אסטרטגיות טיפול חדשות 6,7,8.

PDOs הם מבנים רב-תאיים, תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בדגימות רקמה ראשוניות 8,9 שזה עתה נותחו. הם גדלים באופן תלת ממדי על ידי היותם מוטמעים במטריצת הידרוג'ל, המורכבת בדרך כלל משילוב של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM), ולכן ניתן להשתמש בהם לחקר אינטראקציות תאי גידול-ECM. PDOs מייצגים את מגוון המטופלים ומחזירים את ההטרוגניות התאית ואת התכונות הגנטיות של הגידול10,11,12. בהיותם מודלים במבחנה, הם מאפשרים מניפולציה גנטית ומסכי תרופות בתפוקה גבוהה13,14,15. יתר על כן, PDOs יכולים לשמש באופן סביר כדי להעריך את רגישות המטופל לתרופות ואסטרטגיות טיפול במקביל למרפאה ולעזור לחזות את תוצאות המטופל16,17,18. מלבד כימותרפיה, מודלים אורגנואידים מסוימים שימשו גם כדי לבחון תגובות של חולים בודדים לכימותרפיה19,20. בהתחשב ביישומם המבטיח של PDOs למחקר ולשימוש קליני, המכון הלאומי לסרטן יזם קונסורציום בינלאומי, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, כדי ליצור ולספק מודלים חדשים אלה של סרטן שמקורם בגידולים. רבים מהמודלים האורגנואידים של סוגי סרטן שונים שפותחו באמצעות HCMI זמינים באמצעות אוסף תרביות הטיפוסים האמריקאי (ATCC)22.

אורגנואידים נורמליים של השד הוכחו כמורכבים מאוכלוסיות שונות של תאי אפיתל הנמצאים בבלוטת החלב 11,23 ולכן משמשים כמודלים נהדרים לחקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים, לניתוח מוטציות מניעות הגורמות לגידולים, ולמחקרי שושלת תאי מוצא סרטניים 6,15 . מודלים אורגנואידים של גידולי שד שימשו לזיהוי מטרות חדשות המעודדות סיכויים לפיתוח טיפולים חדשים, במיוחד עבור גידולים עמידים24,25,26. באמצעות שימוש במודלים מותאמים של קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) ואורגנואיד נגזר PDX (PDxO) תואם של גידולי שד עמידים לטיפול, Guillen et al. הראו כי אורגנואידים הם מודלים רבי עוצמה לרפואה מדויקת, אשר ניתן למנף כדי להעריך תגובות לתרופות והחלטות טיפול ישירות במקביל28. יתר על כן, פיתוח שיטות תרבית משותפת חדשות לגידול PDOs עם תאים חיסוניים שונים27,28,29, פיברובלסטים 30,31 ומיקרובים 32,33 מהווה הזדמנות לחקור את ההשפעה של מיקרו-סביבה סרטנית על התקדמות סרטן. בעוד ששיטות רבות כאלה של תרבית משותפת נקבעות באופן פעיל עבור PDOs שמקורם בגידולים בלבלב או במעי הגס, שיטות תרבית משותפת מבוססות דומות עבור PDO השד דווחו רק עבור תאי הרג טבעיים34 ופיברובלסטים35.

הבנק הביולוגי הראשון של >100 אורגנואידים שמקורם במטופלות המייצגים תת-סוגים שונים של סרטן השד פותח על ידי קבוצת Hans Clevers36,37. כחלק ממאמץ זה, קבוצת Clevers פיתחה גם את מדיום התרבית המורכב הראשון לגידול אורגנואידים של השד, הנמצא כיום בשימוש נרחב36. מחקר המשך סיפק תיאור מקיף של ההקמה והתרבות של PDO שד וקסנוגרפטים אורגנואידים שמקורם במטופלות (PDOXs)38. מעבדת Welm פיתחה אוסף גדול של מודלים של BC PDX ו-PDxOs המתורבתים במדיום גידול פשוט יחסית המכיל נסיוב בקר עוברי (FBS) ופחות גורמי גדילה39,40. פיתחנו ואפיינו באופן עצמאי מערך גדול של מודלים נאיביים של אורגנואידים לסרטן השד שמקורם במטופלות11, והשתתפנו בפיתוח מודלים של BC PDO כחלק מיוזמת HCMI21. כאן, אנו שואפים לספק מדריך מעשי המפרט את המתודולוגיה בה אנו משתמשים ביצירת מערכות מודל אורגנואידים של שד הנגזרים ממטופלות.

Protocol

כריתות גידול מחולות סרטן השד, יחד עם הרקמה הדיסטלית והנורמלית הסמוכה, התקבלו מ- Northwell Health בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הביקורת המוסדית IRB-03-012 ו- IRB 20-0150, ובהסכמה מדעת בכתב של המטופלות.

הערה: כל ההליכים המוזכרים להלן בוצעו בחדר תרבית רקמת יונקים BSL2 המיועד לדגימות חולים באישור ועדת הבטיחות הביולוגית. כל ההליכים צריכים להתבצע בהתאם לפרוטוקולי בטיחות השומרים על תנאים אספטיים בארונות בטיחות ביולוגית. כל שלב בצנטריפוגה מתבצע בטמפרטורת החדר (RT) אלא אם צוין אחרת. רקמות / אורגנואידים ומלאי מטריצת קרום מרתף מונחים תמיד על קרח אלא אם כן צוין אחרת. צלחות חדשות מודגרות במשך הלילה לחימום מוקדם. ציפוי כיפות על לוחות שחוממו מראש מבטיח את התוצאות הטובות ביותר לקבלת כיפות מעוגלות שאינן משתטחות בזמן הציפוי או מתרוממות מאוחר יותר משטח הצלחת.

1. הכנה בינונית ומתכונים

  1. הכינו מדיה מותנית R-spondin1 כמתואר להלן (לחילופין ניתן לרכוש באופן מסחרי).
    1. הכינו שתי מצעי גידול נפרדים המורכבים ממדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM), 10% FBS, 5% פניצילין-סטרפטומיצין, ועם או בלי תוספת זאוצין של 300 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. הפשיר בקבוקון של תאי HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (המתקבל ממעבדתו של קלווין קאו באוניברסיטת סטנפורד וזמין גם מסחרית) בבקבוק תרביתרקמה בגודל 75 ס"מ עם 15 מ"ל מדיום.
    3. לפצל את התאים ל 2 x 175 ס"מ2 צלוחיות תרבית, כל אחד עם 35 מ"ל של מדיום המכיל zeocin.
    4. עברו שוב את התאים כדי לקבל כמה שיותר צלוחיות הדרושות ליצירת האצווה הרצויה של התווך המותנה R-spondin1. השתמש במדיום גידול ללא זאוצין.
    5. כאשר הצלוחיות המכילות מדיום ללא זאוצין נפגשות, הסר והחלף את מצע הגידול ב- Ad-DF+++ (שלב 1.2; טבלה 1). מקם את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שבוע אחד.
    6. סובב את המדיום כלפי מטה ב- 400 x גרם למשך 5 דקות כדי להסיר תאים שאינם מחוברים. סנן את המדיום דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. הפוך 25 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (ניתן לאחסן עד 6 חודשים).
    7. באמצעות תאי HEK293T, בצע בדיקת TOPFLASH41,42 של לוציפראז כפול באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי של DNA ביחס מגיב 4.8:1 ל- DNA עם DMEM מדלל (גלוקוז גבוה, פירובט). הוסף 100 μL של מדיום מותנה R-spondin1 (או מדיום בסיסי עבור הבקרה השלילית) ל 100 μL של תאים נגועים. לאחר מכן, בצע את בדיקת הלוציפראז הכפול בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי לאמת את פעילות Wnt של התווך המותנה R-spondin1.
      הערה: הבדיקה משתמשת בפלסמיד TOP עם קריאת פעילות Firefly luciferase, ופלסמיד FOP משמש כבקרה שלילית.
  2. הכינו מדיום בסיסי (מדיום Ad-DF+++, כפי שפורסם בעבר על ידי Sachs et al.36).
    מגיבריכוז מלאיריכוז סופי
    DMEM/F12 מתקדם1x1x
    גלוטמקספי 1001x
    HEPES1 מטר10 מ"מ
    פניצילין-סטרפטומיצין10,000 U/mL; 10,000 מיקרוגרם/מ"ל100 U/מ"ל; 100 מיקרוגרם/מ"ל

    טבלה 1: הרכב בינוני בסיסי Ad-DF+++.
  3. הכינו מדיום שלם לאורגנואידי שד שמקורם במטופל כפי שפורסם בעבר על ידי Sachs et al.36.
    מגיבריכוז מלאיריכוז סופי
    מדיום Ad-DF+++1x1x
    R-spondin בתוך הבית100%10%
    תוספת B-27פי 501x
    ניקוטינאמיד1 מטר5 מ"מ
    NAC500 מ"מ1.25 מ"מ
    פרימוצין50 מ"ג/מ"ל50 מיקרוגרם/מ"ל
    נוגין100 מיקרוגרם/מ"ל100 נ"ג/מ"ל
    EGF אנושי5 מיקרוגרם/מ"ל5 נ"ג/מ"ל
    הרגולין אנושי β1/Neuregulin175 מיקרוגרם/מ"ל37.5 ננוגרם/מ"ל
    Y-27632 דיהידרוכלוריד (רו-קינאז)100 מ"מ5 מיקרומטר
    א83-015 מ"מ500 נאנומטר
    FGF-7 אנושי100 מיקרוגרם/מ"ל5 נ"ג/מ"ל
    FGF-10 אנושי1 מ"ג/מ"ל20 נ"ג/מ"ל
    עמ' 38i30 מ"מ498 נאנומטר

    טבלה 2: הרכב בינוני מלא עבור אורגנואידי שד שמקורם במטופל.
  4. הכינו תמיסת קולגנאז IV במינון 2 מ"ג/מ"ל על ידי שקילת הכמות הנדרשת של אבקת collagenase IV ומסיסותה בתווך בסיסי Ad-DF+++. יש לסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  5. הכינו תמיסת אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) מתמיסת מלאי של 7.5% תוך שימוש במי מלח חוצצים פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco כמדלל. יש לסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.

2. קביעת גידול בשד/אורגנואידים נורמליים מרקמה שנכרתה (איור 1)

  1. יש להעביר גידול שד שנכרת בניתוח / דגימת רקמה רגילה למעבדה בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל Ad-DF+++. אחסנו את הצינור על קרח עד תחילת הבידוד.
  2. הפשירו בקבוק מטריצת קרום מרתף על קרח או למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  3. מעבירים את הרקמה המנותחת לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ. בדוק את הרקמה באופן מקרוסקופי ורשום אם היא נראית שומנית מורפולוגית, כלי דם או נמק. בנוסף, רשום את גודל וצורת הרקמה. באופן אידיאלי, צלמו תמונה של הרקמה עם סרגל במבט (איור 2).
  4. טחנו את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד (~ 1 מ"מ3) עם אזמל סטרילי מס '10, והעבירו אותו לצינור חרוטי 50 מ"ל.
  5. הוסף 10 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל תמיסת collagenase IV ואטם את הצינור עם סרט שקוף. הניחו את הצינור על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37°C ב-140 סל"ד למשך 30-90 דקות במצב זוויתי (~ 30° זווית).
  6. במהלך הדגירה, מניחים aliquot של מדיום מלא עד חם מראש באמבט חרוז / מים 37 ° C.
  7. כל 15 דקות, להשהות מחדש את הרקמה על ידי ערבוב למעלה ולמטה במרץ באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 5 מ"ל. צפו מראש את הפיפטה בתמיסת BSA של 0.5% כדי למנוע אובדן רקמות הנגרם על ידי הדגימה שנדבקה לפיפטה. עקוב אחר דיסוציאציה לאורך זמן על ידי התבוננות בצינור החרוטי מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 5 ומעלה.
  8. לאחר ניתוק הרקמה, צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נטנט, הוסיפו 10 מ"ל של Ad-DF+++ וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות.
  9. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות. כדורי רקמה יכולים להיות רופפים מדי פעם, לכן היזהר בעת שאיפה. חזור על השלב פעם נוספת.
  10. אם גלולת הרקמה אדומה חלקית, יש להוסיף 2 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. אין לדגור למשך זמן רב יותר, מכיוון שזה יפחית באופן משמעותי את כדאיות התא.
  11. הוסף 10 מ"ל של Ad-DF+++ לצינור, צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות, והשליך את supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב 50-300 μL של מטריצת קרום מרתף קר ולא מדולל וערבב על ידי pipeting בזהירות כדי למנוע היווצרות בועות.
    הערה: נפח מטריצת קרום המרתף שנוספה תלוי בגודל הכדור. אם אינכם בטוחים, צלחו כיפה קטנה של ~10 μL מהגלולה המרחפת מחדש והתבוננו במפגש מתחת למיקרוסקופ. התאם על ידי הוספת מטריצת קרום מרתף נוספת במידת הצורך. עיינו באיור 3 (תמונת יום 1) לקבלת צפיפות זריעה ייחוסית.
  12. צלחת 300 μL של כיפת מטריצת קרום מרתף המכילה אורגנואידים בכל באר של צלחת תרבית רקמה מחוממת מראש, מסומנת, 6 בארות. עיין בטבלה 3 לקבלת מטריצת קרום מרתף מומלצת ונפחים בינוניים אם משתמשים בלוחות שונים.
    מספר בארות לצלחתממברנת מרתף מטריצה לכיפה (μL)בינוני לכל באר (μL)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (מתלה במקום כיפה)100

    טבלה 3: כמות מטריצת קרום המרתף ומדיום הגידול המומלצת לכל באר בהתבסס על גודל הצלחת.
  13. השאירו את הצלחת ללא הפרעה במכסה המנוע למשך 5 דקות ולאחר מכן הניחו בזהירות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי שכיפת מטריצת קרום המרתף תתמצק במלואה.
  14. הוסף 3 מ"ל של טיפה בינונית שלמה שחוממה מראש לכל באר של צלחת 6 בארות ומניחים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. צלם תמונות של האורגנואידים באמצעות מטרה פי 5 במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.
  15. לחדש את המדיום כל 4-8 ימים על בסיס הצמיחה של אורגנואידים. שאפו בזהירות את המדיום הישן מבלי להפריע לכיפה, והוסיפו מדיום טרי שחומם מראש טיפה.
    הערה: הפרוטוקול זהה לקביעת אורגנואידים של סרטן השד שמקורם בגידול המנותח ולאורגנואידים רגילים שמקורם ברקמת שד בריאה שנכרתה (מרקמת שד סמוכה ותקינה של אותה מטופלת או מרקמת שד בריאה המתקבלת מניתוח ממופלסטיקה רדוקטיבית).

3. מעבר והרחבה של אורגנואידי שד שמקורם במטופל בתרבית

  1. הפשירו בקבוק מטריצת קרום מרתף על קרח או למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  2. הרימו את כיפת מטריצת קרום המרתף לתוך המדיום בבאר באמצעות מגרד תאים או קצה פיפטה 1 מ"ל.
  3. מצפים מראש את קצה פיפטה עם תמיסת BSA 0.5% ולאחר מכן מעבירים את הכיפה הצפה של האורגנואידים עם צינור חרוטי בינוני עד 15 מ"ל או 50 מ"ל, בהתאם למספר הבארות שנקצרות. עבור יותר משתי בארות המכילות 300 μL של כיפות מטריצת קרום מרתף, השתמש בצינור חרוטי 50 מ"ל. הוסף DPBS אחד כדי להגדיל את עוצמת הקול ל- 5 מ"ל לפחות.
  4. סובב את הצינורות ב 400 x גרם במשך 5 דקות. מטריצת קרום המרתף עם אורגנואידים יוצרת שכבה בתחתית. בזהירות לשאוף להסיר את supernatant.
  5. הוסף 5-20 מ"ל של 1x DPBS, בהתאם למספר הבארות המאוגדות בצינור. מצפים מראש פיפטה חד פעמית סטרילית עם 0.5% BSA ומערבבים את גלולת מטריצת הממברנה האורגנואידית-מרתף ב- DPBS באופן אחיד על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.
  6. סובב את הצינורות ב 400 x גרם במשך 5 דקות. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant.
  7. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים בנפח גדול פי שלושה מנפח מטריצת קרום המרתף לצינור. באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA 0.5%, להשהות מחדש את האורגנואידים בריאגנט דיסוציאציה התא.
  8. הניחו את הצינור על שייקר מסלול בטמפרטורה של 37°C ב-140 סל"ד למשך 8-15 דקות במצב זוויתי. עקוב אחר הצינור על ידי התבוננות בו תחת המיקרוסקופ כל 5 דקות כדי להבטיח שהאורגנואידים מפורקים לצבירים קטנים יותר.
  9. הוסף תווך בסיסי (כלומר, Ad-DF+++) בנפח שווה או גדול יותר מגיב הדיסוציאציה של התא, ופיפטה כדי לערבב את האורגנואידים. סובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT כדי לקבל גלולה אורגנואידים.
  10. אם הגלולה מכילה אורגנואידים שעדיין מוטמעים בתוך מטריצת קרום המרתף הבלתי מומס, חזור על שלבים 3.7-3.9 למשך 5-8 דקות נוספות של טריפסיניזציה.
  11. לאחר קבלת גלולת אורגנואיד לבנה ללא מטריצת קרום מרתף בלתי מומסת, יש להשליך את הסופרנטנט ולהוסיף 1 מ"ל של Ad-DF+++ כדי להשהות מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג. לאחר מכן הוסף עוד Ad-DF+++ עד 10 מ"ל.
  12. סובב ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT לשלב הכביסה. לשאוף ולהשליך את הסופר-נאנט.
  13. הוסף את הכמות הנדרשת של מטריצת קרום מרתף לאורגנואידים המעוכלים בהתבסס על יחס הפיצול המתאים (זה ישתנה במידה רבה עבור כל קו אורגנואידים בהתבסס על קצב הצמיחה). עיינו באיור 3 (תמונת יום 1) כדוגמה לצפיפות הזריעה. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה כדי למנוע יצירת בועות. מניחים מיד על קרח.
  14. פותחים ומתייגים צלחת שחוממה מראש עם 6 בארות. מומלץ לצלחת כיפה של 10-20 μL בפינת באר כדי לצפות במפגש מתחת למיקרוסקופ. אם האורגנואידים נפגשים, ניתן להוסיף עוד מטריצת קרום מרתף כדי להגדיל את יחס הפיצול.
  15. צלחת 300 μL כיפות של אורגנואידים תלויים מחדש במטריצת קרום מרתף. הקפד לשמור את הצינור על קרח תוך ציפוי בארות מרובות כך שמטריצת קרום המרתף תישאר בתמיסה.
  16. השאירו את הצלחת ללא הפרעה במכסה המנוע למשך 5 דקות ולאחר מכן הניחו בזהירות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 מבלי להפריע לכיפות.
  17. לאחר 20-30 דקות, הכיפות מתמצקות. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש לכל באר ומחזירים את הצלחת לאינקובטור. מוסיפים מדיום מלא טרי כל 5-7 ימים. בצע בדיקות שגרתיות של התרביות לאיתור זיהום מיקופלסמה.
    הערה: הפרוטוקול לתרבית גידולי שד ואורגנואידים רגילים זהה. עם זאת, מניסיוננו, אורגנואידים רגילים נוטים לגדול היטב עד מעבר 6-8 לפני האטה. רצוי להכין כמה שיותר מניות מעבר מוקדם למחקר עתידי.

4. הקפאת אורגנואידי שד שמקורם במטופל

  1. מעבר בארות של אורגנואידים להסרת כל מטריצת קרום מרתף, כאמור בשלבים 3.1-3.12.
  2. יש להשהות מחדש את כדורית האורגנואידים בתווך הקפאת תאים (מופשר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס) עם 1 מ"ל בינוני לכל 200-300 מיקרוליטר נפח מטריצת קרום מרתף לפני המעבר. בצע ספירת תאים לפני הקפאה לצורך הפניה. Aliquot נפח קטן (לפחות 100 μL) של תאים לעבור טריפסיניזציה נוספת, במידת הצורך, כדי לקבל תאים בודדים, ולאחר מכן לספור אותם באמצעות מכונת מונה תאים.
  3. העבר 1 מ"ל של תאים לתוך 2 מ"ל cryovials מסומן עם מספר קו אורגנואידים, תאריך, ומספר מעבר. הקפד לתייג את הצינורות בטוש קבוע או להשתמש בתוויות קריו.
  4. העבירו את הבקבוקונים למיכל הקפאת תאים והעבירו את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C. לאחר הדגירה במשך הלילה, הבקבוקונים מוכנים להעברה למקפיא אחסון חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

5. הפשרת אורגנואידי שד שמקורם במטופלת

  1. הפשירו בקבוק מטריצת קרום מרתף על קרח או למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. טרום חום Ad-DF+++ בינוני ב-37°C. Aliquot 9 מ"ל של מדיום מחומם מראש לתוך 15 מ"ל צינורות חרוטי עבור כל בקבוקון קפוא.
  2. הפשיר במהירות את בקבוקון האורגנואידים הקפוא על ידי הצבתו באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. רססו 70% אתנול והעבירו את הצינור לארון הבטיחות הביולוגית.
  3. שטפו את קצה הפיפטה בתמיסת BSA של 0.5% כדי למנוע אובדן אורגנואידים. ערבבו את האורגנואידים המופשרים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לערבב אורגנואידים מיושבים.
  4. העבירו בעדינות 1 מ"ל אורגנואידים קפואים ל-9 מ"ל של Ad-DF+++ שחומם מראש בצורה טיפתית. סובבו את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant.
  5. שטפו את הגלולה על ידי הוספת 10 מ"ל של Ad-DF+++ טרי שחומם מראש לכדורית האורגנואידים, וערבבו בעדינות עם פיפטה מצופה מראש ב-0.5% BSA כדי להשהות מחדש את הכדורית. סובבו את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות בזהירות להשליך את supernatant.
  6. הניחו את כדורית האורגנואיד על קרח והסירו בזהירות את שאריות ה-Ad-DF+++ בעזרת קצה פיפטה בנפח קטן יותר. להשהות מחדש את הגלולה ב 300 μL של מטריצת קרום מרתף צלחת צלחת 6 באר שחוממה מראש. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    הערה: מומלץ לצלחת כיפה קטנה של 10 μL מהגלולה המרחפת בפינת הבאר כדי להבחין במפגש מתחת למיקרוסקופ. אם האורגנואידים נראים חופפים, יש לדלל על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף לצלחת לשתי בארות של צלחת בעלת 6 בארות.
  7. לאחר דגירה של 20-30 דקות, מוסיפים 3 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש לכיפה המוצקה.

תוצאות

הקמנו בנק ביולוגי של אורגנואידים של גידולי שד שמקורם במטופלות הכוללים תת-סוגים שונים11. בנוסף, ביססנו מספר קווי אורגנואידים נורמליים של השד שמקורם בדגימות רקמת ממופלסטיקה רדוקטיבית או שד נורמלי סמוך/דיסטלי ממטופלות BC באמצעות הגישה המתוארת באיור 1.

Discussion

המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בפרוטוקולים הנ"ל כדי לבסס אורגנואידים מכריתות או שריטות גידולים נאיביות. השתמשנו בפרוטוקול זה גם כדי לפתח אורגנואידים נורמליים מרקמת השד המתקבלים באמצעות ממופלסטיקה רדוקטיבית או מרקמת שד רגילה סמוכה או דיסטלית של חולות סרטן. כ-30%-40% מהגידולים הראשוניים שנו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לחברי מעבדת ספקטור על דיונים ביקורתיים לאורך עבודה זו. אנו מודים לנורמן זקס ולהנס קלברס (מכון הוברכט, הולנד) על שסיפקו לנו בתחילה את פרוטוקול תרבית האורגנואידים שלהם. אנו מכירים במרכז הסרטן CSHL היסטולוגיה ומיקרוסקופ משאבים משותפים עבור שירותים ומומחיות טכנית (NCI 2P3OCA45508). אנו מודים לד"ר צ'ינג גאו על הסיוע בהכנת דגימות היסטולוגיות. אנו אסירי תודה על תמיכתה של ד"ר קארן קוסטרוף (Northwell Health) על מתן דגימות גידול למטופלים. אנו מעריכים גם את המאמצים של צוות Northwell Health Biobanking לרכישת דגימות, ומודים לחולים ולבני משפחותיהם על תרומת רקמות למחקר. מחקר זה נתמך על ידי CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), ו-Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubesVWR525-1068
175 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubesVWR525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well culture plates Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-304
96-well opaque platesCorning353296For CTG assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent cell viability assay
Centrifuge Eppendorf5804
Collagenase from Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (human)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (human)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216 For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellsR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (human)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)Corning356231Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing ContainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detection kitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteineMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (human)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparent film
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010cell freezing medium
Red Blood Cell lysis bufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin conditioned mediaIn-house or commercial from Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redLife Technologies12605028cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
  22. . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved