JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь приведен подробный протокол для определения органоидов молочной железы человека из резекций опухоли молочной железы пациента или нормальной ткани молочной железы. Протокол содержит исчерпывающие пошаговые инструкции по культивированию, замораживанию и размораживанию органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Аннотация

Рак молочной железы является сложным заболеванием, которое было классифицировано на несколько различных гистологических и молекулярных подтипов. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, разработанные в нашей лаборатории, состоят из смеси нескольких популяций клеток, полученных из опухоли, и, таким образом, представляют собой лучшее приближение к разнообразию опухолевых клеток и среде, чем установленные 2D-линии раковых клеток. Органоиды служат идеальной моделью in vitro , позволяющей взаимодействовать между клетками и внеклеточным матриксом, которые, как известно, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и прогрессировании рака. Органоиды, полученные от пациентов, также имеют преимущества перед мышиными моделями, поскольку они имеют человеческое происхождение. Кроме того, было показано, что они повторяют геномную, транскриптомную, а также метаболическую гетерогенность опухолей пациентов; Таким образом, они способны представлять сложность опухоли, а также разнообразие пациентов. В результате они готовы предоставить более точную информацию об обнаружении и проверке мишеней, а также анализах чувствительности к лекарственным средствам. В этом протоколе мы предоставляем подробную демонстрацию того, как органоиды молочной железы, полученные от пациента, создаются из резецированных опухолей молочной железы (раковых органоидов) или ткани молочной железы, полученной из редуктивной маммопластики (нормальные органоиды). Затем следует всесторонний отчет о 3D-культуре органоидов, расширении, прохождении, замораживании, а также размораживании культур органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин: по оценкам, в 2022 году в Соединенных Штатах будет диагностировано 287 850 новых случаев1. Несмотря на недавние достижения в области раннего выявления с ежегодными скринингами, таргетной терапией и лучшим пониманием генетической предрасположенности, он является второй по значимости причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах, с > 40 000 смертей ежегодно от рака молочной железы1. Рак молочной железы в настоящее время классифицируется на несколько подтипов на основе гистопатологической и молекулярной оценки первичной опухоли. Лучшая стратификация подтипов улучшила результаты лечения пациентов с вариантами лечения для конкретных подтипов2. Например, идентификация HER2 как протоонкогена3 привела к разработке трастузумаба, который сделал этот высокоагрессивный подтип управляемым у большинства пациентов4. Дальнейшие исследования генетики и транскриптомики этого сложного заболевания с учетом специфики пациента помогут в разработке и прогнозировании более эффективных персонализированных схем лечения для конкретного пациента 2,5. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающей новой моделью для получения информации о раке на молекулярном уровне, выявления новых мишеней или биомаркеров и разработки новых стратегий лечения 6,7,8.

PDO представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) структуры, полученные из недавно резецированных первичных образцов тканей 8,9. Они выращиваются трехмерно, будучи встроенными в гидрогелевую матрицу, обычно состоящую из комбинации белков внеклеточного матрикса (ECM), и, следовательно, могут использоваться для изучения взаимодействий опухолевой клетки с ECM. PDO представляют разнообразие пациентов и повторяют клеточную гетерогенность и генетические особенности опухоли10,11,12. Будучи моделями in vitro, они позволяют проводить генетические манипуляции и высокопроизводительные скрининги лекарств13,14,15. Кроме того, PDO могут быть правдоподобно использованы для оценки чувствительности пациента к лекарственным средствам и стратегий лечения параллельно с клиникой и помогают прогнозировать результаты лечения пациентов16,17,18. Помимо химиотерапии, некоторые органоидные модели также использовались для изучения индивидуальных реакций пациентов на химиолучевую терапию19,20. Учитывая многообещающую применимость PDO для исследований и клинического использования, Национальный институт рака инициировал международный консорциум The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21 для создания и предоставления этих новых моделей рака, полученных из опухолей. Многие из органоидных моделей различных типов рака, разработанных с помощью HCMI, доступны через Американскую коллекцию типовых культур (ATCC)22.

Было показано, что нормальные органоиды молочной железы состоят из различных популяций эпителиальных клеток, присутствующих в молочной железе 11,23, и, таким образом, служат отличными моделями для изучения основных биологических процессов, анализа мутаций-драйверов, вызывающих онкогенез, и для исследований происхождения раковых клеток 6,15 . Органоидные модели опухолей молочной железы были использованы для идентификации новых мишеней, которые обнадеживают перспективы для разработки новых методов лечения, особенно для резистентных опухолей24,25,26. Используя ксенотрансплантат пациента (PDX) и соответствующие модели органоидов, полученных из PDX (PDxO) резистентных к лечению опухолей молочной железы, Guillen et al. показали, что органоиды являются мощными моделями для точной медицины, которые могут быть использованы для параллельной оценки реакции на лекарства и принятия решений о прямой терапии28. Кроме того, разработка новых методов совместного культивирования ЗОП с различными иммунными клетками27,28,29, фибробластами 30,31 и микробами 32,33 дает возможность изучить влияние микроокружения опухоли на прогрессирование рака. В то время как многие такие методы совместного культивирования активно внедряются для PDO, полученных из опухолей поджелудочной железы или колоректальных опухолей, аналогичные установленные методы совместного культивирования PDO молочной железы были зарегистрированы только для естественных клеток-киллеров34 и фибробластов35.

Первый биобанк из >100 органоидов, полученных от пациентов, представляющих различные подтипы рака молочной железы, был разработан группой Ханса Клеверса36,37. В рамках этих усилий группа Clevers также разработала первую сложную питательную среду для роста органоидов молочной железы, которая в настоящее время широко используется36. Последующее исследование предоставило всесторонний отчет о создании и культивировании PDO молочной железы и органоидных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDOX)38. Лаборатория Welm разработала большую коллекцию моделей BC PDX и PDxO, которые культивируются в сравнительно более простой питательной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и меньшее количество факторов роста39,40. Мы независимо разработали и охарактеризовали большой массив наивных моделей органоидов рака молочной железы11 и участвовали в разработке моделей BC PDO в рамках инициативыHCMI 21. Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство с подробным описанием методологии, используемой нами при создании систем моделей органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

протокол

Резекции опухолей у пациентов с раком молочной железы вместе с дистальными и прилегающими нормальными тканями были получены от Northwell Health в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета IRB-03-012 и IRB 20-0150 и с письменного информированного согласия пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, упомянутые ниже, были выполнены в комнате культуры тканей млекопитающих BSL2, предназначенной для образцов пациентов, после одобрения комитета по биобезопасности. Все процедуры должны выполняться в соответствии с протоколами безопасности, поддерживающими асептические условия в шкафах биобезопасности. Каждая стадия центрифугирования выполняется при комнатной температуре (RT), если не указано иное. Ткани / органоиды и матричные запасы базальной мембраны всегда помещаются на лед, если не указано иное. Новые тарелки инкубируют в течение ночи для предварительного разогрева. Нанесение куполов на предварительно разогретые плиты обеспечивает наилучшие результаты для получения округлых куполов, которые не сплющиваются при нанесении покрытия или не отрываются позже от поверхности плиты.

1. Средняя подготовка и рецепты

  1. Подготовьте кондиционированную среду R-спондин1, как описано ниже (в качестве альтернативы можно купить в продаже).
    1. Приготовьте две отдельные питательные среды, состоящие из модифицированной среды орла (DMEM) Дульбекко, 10% FBS, 5% пенициллина-стрептомицина и с добавлением цеоцина 300 мкг / мл или без него.
    2. Разморозьте флакон с клетками HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (полученными в лаборатории Кельвина Куо в Стэнфордском университете, а также коммерчески доступными) в колбе для культуры тканей размером 75 см2 с 15 мл среды.
    3. Разделите клетки на 2 колбы для культивированияразмером 2 x 175 см, каждая из которых содержит 35 мл среды, содержащей цеоцин.
    4. Снова пройдите через ячейки, чтобы получить столько колб, сколько необходимо для получения желаемой партии кондиционированной среды R-спондина1. Используйте питательную среду без зеоцина.
    5. Когда колбы, содержащие среду без зеоцина, сливаются, удалите и замените питательную среду Ad-DF+++ (этап 1.2; Таблица 1). Поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C с 5%CO2 на 1 неделю.
    6. Открутите среду до 400 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Отфильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм. Сделайте аликвоты объемом 25 мл и храните их при температуре -20 °C (можно хранить до 6 месяцев).
    7. Используя клетки HEK293T, проведите двойной анализ люциферазы TOPFLASH41,42 с использованием коммерческого реагента для трансфекции ДНК с соотношением реагента к ДНК 4,8: 1 с разбавителем DMEM (высокое содержание глюкозы, пируват). Добавьте 100 мкл кондиционированной среды R-спондина1 (или базальной среды для отрицательного контроля) к 100 мкл трансфицированных клеток. Затем выполните двойной анализ люциферазы в соответствии с протоколом производителя, чтобы проверить активность Wnt кондиционированной среды R-спондин1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе используется плазмида TOP со считыванием активности люциферазы Firefly, а плазмида FOP используется в качестве отрицательного контроля.
  2. Подготовьте базальную среду (среда Ad-DF+++, как ранее было опубликовано Sachs et al.36).
    РеагентКонцентрация запасовОкончательная концентрация
    Усовершенствованный DMEM/F121x1x
    ГлутаМаксВ 100 раз1x
    ХЕПЕС1 м10 мМ
    Пенициллин-стрептомицин10 000 ЕД/мл; 10 000 мкг/мл100 ЕД/мл; 100 мкг/мл

    Таблица 1: Базальный состав среды Ad-DF+++.
  3. Подготовьте полную среду для органоидов молочной железы, полученных от пациента, как ранее было опубликовано Sachs et al.36.
    РеагентКонцентрация запасовОкончательная концентрация
    Среда Ad-DF+++1x1x
    Р-спондин на собственном производстве100%10%
    Дополнение B-27В 50 раз1x
    Никотинамид1 м5 мМ
    НАК500 мМ1,25 мМ
    Примоцин50 мг/мл50 мкг/мл
    Башка100 мкг/мл100 нг/мл
    ЭФР человека5 мкг/мл5 нг/мл
    Герегулин человека β1/Неврегулин175 мкг/мл37,5 нг/мл
    Y-27632 дигидрохлорид (Rho-киназа)100 мМ5 мкМ
    А83-015 мМ500 нМ
    Человеческий FGF-7100 мкг/мл5 нг/мл
    Человеческий FGF-101 мг/мл20 нг/мл
    П38И30 мМ498 нМ

    Таблица 2: Полный состав среды для органоидов молочной железы пациента.
  4. Приготовьте 2 мг/мл раствора коллагеназы внутривенно, взвесив необходимое количество порошка коллагеназы IV и солюбилизировав его в базальной среде Ad-DF+++. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.
  5. Приготовьте 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) из 7,5% исходного раствора, используя 1x фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS) в качестве разбавителя. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.

2. Определение опухоли молочной железы / нормальных органоидов из резецированной ткани (рис. 1)

  1. Транспортируйте хирургически резецированный образец опухоли молочной железы / нормальной ткани в лабораторию в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей Ad-DF+++. Храните пробирку на льду до начала изоляции.
  2. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
  3. Перенесите резецированную ткань в стерильную чашку Петри диаметром 10 см. Осмотрите ткань макроскопически и отметьте, кажется ли она морфологически жирной, васкуляризированной или некротической. Дополнительно запишите размер и форму ткани. В идеале сфотографируйте ткань с линейкой в поле зрения (рисунок 2).
  4. Измельчите ткань на очень мелкие кусочки (~ 1 мм3) стерильным скальпелем No 10 и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл.
  5. Добавьте 10 мл 2 мг / мл раствора коллагеназы для внутривенного введения и запечатайте пробирку прозрачной пленкой. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 30-90 мин под углом (угол ~30°).
  6. Во время инкубации поместите аликвоту полной среды для предварительного нагрева на водяной бане с температурой 37 °C.
  7. Каждые 15 минут ресуспендируйте ткань, энергично перемешивая вверх и вниз стерильной серологической пипеткой объемом 5 мл. Предварительно покройте пипетку 0,5% раствором BSA, чтобы предотвратить потерю ткани, вызванную прилипанием образца к пипетке. Отслеживайте диссоциацию с течением времени, наблюдая за конической трубкой под микроскопом при 5-кратном или более увеличении.
  8. После диссоциации ткани центрифугу при 400 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте 10 мл Ad-DF+++ и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин.
  9. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость. Гранулы ткани иногда могут быть рыхлыми, поэтому будьте осторожны при аспирации. Повторите этот шаг еще раз.
  10. Если тканевая гранула частично красная, добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Не стоит инкубировать дольше, так как это значительно снизит жизнеспособность клеток.
  11. Добавьте 10 мл Ad-DF+++ в пробирку, центрифугу при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулы в 50-300 мкл неразбавленной холодной матрицы базальной мембраны и тщательно перемешайте пипеткой, чтобы избежать образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемой матрицы базальной мембраны зависит от размера гранул. Если вы не уверены, поместите небольшой купол ~ 10 мкл из ресуспендированной гранулы и наблюдайте за слиянием под микроскопом. Отрегулируйте, добавив больше матрицы базальной мембраны, если это необходимо. На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведена эталонная плотность посева.
  12. Пластина 300 мкл матричного купола базальной мембраны, содержащего органоиды в каждой лунке предварительно разогретой, меченой, 6-луночной пластины для культивирования тканей. В таблице 3 приведены рекомендуемые матрицы базальной мембраны и средние объемы при использовании разных пластин.
    Количество лунок на плитуМатрица базальной мембраны на купол (мкл)Среда на лунку (мкл)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (подвеска вместо купола)100

    Таблица 3: Рекомендуемое количество матрицы базальной мембраны и питательной среды на скважину в зависимости от размера пластины.
  13. Оставьте пластину нетронутой в колпаке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 20-30 минут, чтобы купол матрицы базальной мембраны полностью затвердел.
  14. Добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды по каплям в каждую лунку 6-луночной пластины и поместите в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO2. Сделайте снимки органоидов с помощью 5-кратного объектива на инвертированном светлопольном микроскопе.
  15. Пополняют среду каждые 4-8 дней исходя из роста органоидов. Тщательно аспирируйте старую среду, не нарушая купола, и добавьте свежую, предварительно разогретую среду по каплям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол одинаков для установления органоидов рака молочной железы, полученных из резецированной опухоли, и для нормальных органоидов, полученных из резецированной здоровой ткани молочной железы (либо из соседней и нормальной ткани молочной железы той же пациентки, либо из здоровой ткани молочной железы, полученной в результате операции редукционной маммопластики).

3. Пассирование и расширение органоидов молочной железы, полученных от пациентов, в культуре

  1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
  2. Поднимите матричный купол базальной мембраны в среду в лунке с помощью клеточного скребка или наконечника пипетки объемом 1 мл.
  3. Предварительно покройте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, а затем перенесите плавающий купол органоидов со средой в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл, в зависимости от количества собираемых лунок. Для более чем двух скважин, содержащих 300 мкл матричных куполов базальной мембраны, используйте коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1x DPBS, чтобы увеличить объем как минимум до 5 мл.
  4. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Матрикс базальной мембраны с органоидами образует слой на дне. Тщательно аспирируйте, чтобы удалить надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 5-20 мл 1x DPBS, в зависимости от количества лунок, объединенных в пробирку. Предварительно покройте стерильную одноразовую пипетку 0,5% BSA и равномерно перемешайте гранулы матрицы органоидно-базальной мембраны в DPBS путем пипетки вверх и вниз.
  6. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Добавьте в пробирку реагент для диссоциации клеток, в три раза превышающий объем матрицы базальной мембраны. Используя наконечник пипетки, покрытый 0,5% BSA, ресуспендируйте органоиды в реагенте для диссоциации клеток.
  8. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 8-15 мин в угловом положении. Контролируйте пробирку, наблюдая за ней под микроскопом каждые 5 минут, чтобы убедиться, что органоиды разбиты на более мелкие кластеры.
  9. Добавьте базальную среду (т.е. Ad-DF+++) в объеме, равном или превышающем реагент для диссоциации клеток, и пипетку смешайте органоиды. Отжим при 400 x g в течение 5 мин при RT для получения органоидной гранулы.
  10. Если гранула содержит органоиды, все еще встроенные в нерастворенную матрицу базальной мембраны, повторите шаги 3,7-3,9 для дополнительных 5-8 минут трипсинизации.
  11. Как только будет получена белая органоидная гранула без нерастворенной матрицы базальной мембраны, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл Ad-DF+++, чтобы ресуспендировать гранулу путем пипетирования. Затем добавьте больше Ad-DF+++ до 10 мл.
  12. Отжим при 400 x g в течение 5 минут при RT для этапа стирки. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  13. Добавьте необходимое количество матрицы базальной мембраны к расщепленным органоидам на основе соответствующего коэффициента расщепления (это будет широко варьироваться для каждой линии органоидов в зависимости от скорости роста). На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведен пример плотности посева. Перемешайте, аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Сразу же выложите на лед.
  14. Откройте и пометьте предварительно разогретую 6-луночную тарелку. Рекомендуется установить купол объемом 10-20 мкл в углу лунки, чтобы наблюдать слияние под микроскопом. Если органоиды сливаются, можно добавить больше матрицы базальной мембраны, чтобы увеличить коэффициент расщепления.
  15. Пластинчатые купола органоидов объемом 300 мкл, ресуспендированные в матрице базальной мембраны. Убедитесь, что трубка остается на льду при обшивке нескольких лунок, чтобы матрица базальной мембраны оставалась в растворе.
  16. Оставьте тарелку нетронутой в вытяжке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 , не нарушая купола.
  17. Через 20-30 мин купола затвердевают. Добавьте по 3 мл предварительно подогретой полной среды в каждую лунку и поместите тарелку обратно в инкубатор. Добавляйте свежую полноценную среду каждые 5-7 дней. Проведите рутинное тестирование культур на предмет выявления микоплазменного загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол культивирования опухолей молочной железы и нормальных органоидов одинаков. Однако, по нашему опыту, нормальные органоиды, как правило, хорошо растут до прохода 6-8, прежде чем замедлиться. Желательно сделать как можно больше запасов раннего прохода для будущих исследований.

4. Замораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

  1. Проход сливающихся лунок органоидов для удаления любой базальной мембраны матрицы, как указано в шагах 3.1-3.12.
  2. Ресуспендируют гранулы органоидов в среде для замораживания клеток (размороженной в течение ночи при 4 ºC) с 1 мл среды на 200-300 мкл объема матрикса базальной мембраны перед пассажем. Выполните подсчет ячеек перед замораживанием для справки. Аликвотируйте небольшой объем (не менее 100 мкл) клеток для дальнейшей трипсинизации, если это необходимо, чтобы получить единичные клетки, а затем подсчитайте их с помощью счетчика клеток.
  3. Перенесите 1 мл клеток в криовиалы объемом 2 мл, помеченные номером органоидной линии, датой и номером прохода. Обязательно пометьте пробирки перманентным маркером или используйте криометки.
  4. Переместите флаконы в контейнер для замораживания клеток и перенесите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C. После инкубации в течение ночи флаконы готовы к перемещению в морозильную камеру для хранения жидкого азота для длительного хранения.

5. Размораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

  1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C. Предварительно разогрейте среду Ad-DF+++ при температуре 37 °C. Аликвот 9 мл предварительно подогретой среды в конические пробирки по 15 мл для каждого замороженного флакона.
  2. Быстро разморозьте замороженный флакон с органоидами, поместив его в ванну с шариками при температуре 37 °C. Распылите 70% этанол и перенесите трубку в шкаф биобезопасности.
  3. Промойте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов. Аккуратно перемешайте размороженные органоиды, пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать все осевшие органоиды в пробирке.
  4. Аккуратно перенесите 1 мл замороженных органоидов в 9 мл предварительно подогретого Ad-DF+++ по каплям. Отжимайте клетки при 400 x g в течение 5 мин, а затем осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Вымойте гранулы, добавив 10 мл свежего предварительно подогретого Ad-DF+++ в органоидную гранулу, и аккуратно перемешайте пипеткой, предварительно покрытой 0,5% BSA, чтобы ресуспендировать гранулы. Закрутите клетки при 400 х г в течение 5 мин и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Поместите органоидную гранулу на лед и осторожно удалите остатки Ad-DF+++, используя наконечник пипетки меньшего объема. Ресуспендировать гранулу в 300 мкл матрицы базальной мембраны и пластины в предварительно разогретой 6-луночной пластине. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется поместить небольшой купол объемом 10 мкл из ресуспендированной гранулы в углу лунки, чтобы различить слияние под микроскопом. Если органоиды выглядят сливающимися, разбавьте, добавив 300 мкл матрицы базальной мембраны на пластину в две лунки 6-луночной пластины.
  7. После 20-30-минутной инкубации добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды в затвердевший купол.

Результаты

Мы создали биобанк органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов, включающий различные подтипы11. Кроме того, мы установили несколько нормальных органоидных линий молочной железы, полученных из образцов тканей редуктивной маммопластики или смежной/дисталь...

Обсуждение

Наша лаборатория успешно использовала вышеуказанные протоколы для создания органоидов из наивных опухолевых резекций или соскобов. Мы также использовали этот протокол для разработки нормальных органоидов из ткани молочной железы, полученной с помощью восстановительной маммоп?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Спектора за критические дискуссии на протяжении всей этой работы. Мы благодарим Нормана Сакса и Ханса Клеверса (Hans Clevers) из Института Хубрехта, Нидерланды за то, что они изначально предоставили нам свой протокол культивирования органоидов. Мы выражаем признательность Совместным ресурсам по гистологии и микроскопии Онкологического центра CSHL за услуги и техническую экспертизу (NCI 2P3OCA45508). Мы благодарим доктора Цин Гао за помощь в подготовке гистологического образца. Мы благодарны за поддержку доктору Карен Кострофф (Northwell Health) за предоставление пациентам образцов опухолей. Мы также высоко ценим усилия команды Northwell Health Biobanking по сбору образцов и благодарим пациентов и их семьи за пожертвование тканей для исследований. Это исследование было поддержано CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) и Leidos Biomedical HHSN26100008 (Дэвид Тувесон и D.L.S.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubesVWR525-1068
175 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubesVWR525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well culture plates Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-304
96-well opaque platesCorning353296For CTG assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent cell viability assay
Centrifuge Eppendorf5804
Collagenase from Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (human)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (human)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216 For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellsR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (human)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)Corning356231Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing ContainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detection kitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteineMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (human)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparent film
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010cell freezing medium
Red Blood Cell lysis bufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin conditioned mediaIn-house or commercial from Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redLife Technologies12605028cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
  22. . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены