Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

Riepilogo

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.

Abstract

Il cancro al seno è una malattia complessa che è stata classificata in diversi sottotipi istologici e molecolari. Gli organoidi del tumore mammario derivati dal paziente sviluppati nel nostro laboratorio consistono in un mix di più popolazioni cellulari derivate dal tumore e rappresentano quindi una migliore approssimazione della diversità e dell'ambiente delle cellule tumorali rispetto alle linee cellulari tumorali 2D stabilite. Gli organoidi fungono da modello ideale in vitro , consentendo interazioni cellula-matrice extracellulare, note per svolgere un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e nella progressione del cancro. Gli organoidi derivati dal paziente hanno anche vantaggi rispetto ai modelli murini in quanto sono di origine umana. Inoltre, hanno dimostrato di ricapitolare l'eterogeneità genomica, trascrittomica e metabolica dei tumori dei pazienti; Pertanto, sono in grado di rappresentare la complessità del tumore e la diversità del paziente. Di conseguenza, sono pronti a fornire informazioni più accurate sulla scoperta e la convalida del target e sui saggi di sensibilità ai farmaci. In questo protocollo, forniamo una dimostrazione dettagliata di come gli organoidi mammari derivati dal paziente sono stabiliti da tumori al seno resecati (organoidi tumorali) o tessuto mammario derivato da mammoplastica riduttiva (organoidi normali). Questo è seguito da un resoconto completo della coltura di organoidi 3D, dell'espansione, del passaggio, del congelamento e dello scongelamento delle colture di organoidi mammari derivate dal paziente.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) è il tumore maligno più comune nelle donne, con 287.850 nuovi casi stimati per essere diagnosticati negli Stati Uniti nel 2022¹. Nonostante i recenti progressi nella diagnosi precoce con screening annuali, terapie mirate e una migliore comprensione della predisposizione genetica, prevale per essere la seconda causa di morte per cancro nelle donne negli Stati Uniti, con > 40.000 decessi attribuiti al cancro al seno ogni anno¹. Il cancro al seno è attualmente classificato in più sottotipi sulla base della valutazione istopatologica e molecolare del tumore primario. Una migliore stratificazione dei so....

Protocollo

Le resezioni tumorali di pazienti con cancro al seno, insieme al tessuto normale distale e adiacente, sono state ottenute da Northwell Health in conformità con i protocolli dell'Institutional Review Board IRB-03-012 e IRB 20-0150 e con il consenso informato scritto delle pazienti.

NOTA: Tutte le procedure menzionate di seguito sono state eseguite in una sala BSL2 per la coltura di tessuti di mammiferi designata per i campioni dei pazienti previa approvazione del comitato di biosicurezza. Tutte le procedure devono essere eseguite seguendo i protocolli di sicurezza che mantengono le condizioni asettiche negli armadi di biosicurezza. Ogni fase....

Risultati

Abbiamo creato una biobanca di organoidi di tumore mammario derivati da pazienti che comprende vari sottotipi¹¹. Inoltre, abbiamo stabilito più linee organoidi mammarie normali derivate da campioni di tessuto di mammoplastica riduttiva o da mammelle normali adiacenti / distali da pazienti BC utilizzando l'approccio descritto nella Figura 1.

Le varie linee organoidi di tumore mammario derivate da pazienti differiscono nella loro morfologia .......

Discussione

Il nostro laboratorio ha impiegato con successo i protocolli di cui sopra per stabilire organoidi da resezioni tumorali naïve o raschiamenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per sviluppare organoidi normali da tessuto mammario ottenuto tramite mammoplastica riduttiva o da tessuto mammario normale adiacente o distale di pazienti oncologici. Circa il 30% -40% dei tumori primari resecati ha portato a colture organoidi tumorali di successo a lungo termine (>passaggio 8). Le linee organoidi tumorali che s.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR	525-1068
175 cm2 tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubes	VWR	525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)	Millipore Sigma	SCGP00525	SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter	Nalgene	566-0020
6-well culture plates	Greiner Cellstar	82050-842
75 cm2 tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-304
96-well opaque plates	Corning	353296	For CTG assay
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B-27 supplement	Life Technologies	12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader	Fisher Scientific (Agilent)		For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)	Thermo Fisher	15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent	Promega	G9683	luminescent cell viability assay
Centrifuge	Eppendorf	5804
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C5138	Type IV
Cryolabels	Amazon	DTCR-1000	Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials	Simport Scientific Inc.	T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher (Gibco)	11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Gibco	14190-144	DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)	Peprotech	AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
FGF-10 (human)	Peprotech	100-26
FGF-7/KGF (human)	Peprotech	100-19
GlutaMax	Life Technologies	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216	For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells	R&D Systems	3710-001-01	Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES	Life Technologies	15630-080
Heregulinβ-1 (human)	Peprotech	100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container	Thermo Fisher	5100-0001
Mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-418
N-acetyl-l-cysteine	Millipore Sigma	A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher	166-0045
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636
Noggin (human)	Peprotech	120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190	Millipore Sigma	S7067
Parafilm			transparent film
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140122
Plasmid1: pRL-SV40P	Addgene	27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash	Addgene	12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash	Addgene	12456
pluriStrainer 200 µm	pluriSelect	43-50200-01
Primocin	Invivogen	ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo Fisher (Gibco)	12648-010	cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer	Millipore Sigma	11814389001
R-spondin conditioned media	In-house or commercial from Peprotech	120-38
Scalpel (No.10)	Sklar Instruments	Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)	Benchmark	H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01	Tocris	2939
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Life Technologies	12605028	cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Millipore Sigma	6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)	Abmole Bioscience	Y-27632
Zeocin	Thermo Fisher	R25001