Un método de imagen basado en teléfonos inteligentes para el ensayo de evitación de césped de C. elegans

Resumen

Este artículo describe un método simple y de bajo costo para registrar el comportamiento de evitación del césped de Caenorhabditis elegans, utilizando elementos fácilmente disponibles, como un teléfono inteligente y una caja de luz de diodo emisor de luz (LED). También proporcionamos un script de Python para procesar el archivo de video en un formato más susceptible de contar.

Resumen

Cuando se expone a bacterias tóxicas o patógenas, el nematodo Caenorhabditis elegans muestra un comportamiento aprendido de evitar el césped, en el que los gusanos abandonan gradualmente su fuente de alimento y prefieren permanecer fuera del césped bacteriano. El ensayo es una manera fácil de probar la capacidad de los gusanos para detectar señales externas o internas para responder adecuadamente a condiciones dañinas. Aunque es un ensayo simple, el conteo lleva mucho tiempo, particularmente con múltiples muestras, y las duraciones de los ensayos que se extienden durante la noche son inconvenientes para los investigadores. Un sistema de imágenes que puede obtener imágenes de muchas placas durante un largo período es útil pero costoso. Aquí, describimos un método de imagen basado en teléfonos inteligentes para registrar la evitación del césped en C. elegans. El método requiere solo un teléfono inteligente y una caja de luz de diodo emisor de luz (LED), para servir como fuente de luz transmitida. Usando aplicaciones de cámara de lapso de tiempo gratuitas, cada teléfono puede obtener imágenes de hasta seis placas, con suficiente nitidez y contraste para contar manualmente los gusanos fuera del césped. Las películas resultantes se procesan en archivos de intercalado de audio y video (AVI) de 10 s para cada punto de tiempo por hora, luego se recortan para mostrar cada placa para que sean más susceptibles de contar. Este método es una forma rentable para aquellos que buscan examinar defectos de evitación y potencialmente puede extenderse a otros ensayos de C. elegans.

Introducción

Entre las muchas ventajas de estudiar C. elegans, su sistema nervioso simple ofrece la oportunidad de estudiar cómo los cambios a nivel genético y celular afectan la función de la red y la producción de comportamiento. A pesar de tener un número limitado de neuronas, C. elegans muestra una amplia gama de comportamientos complejos. Uno de ellos es evitar el césped, en el que el nematodo bacterívoro responde a una fuente de alimento dañina abandonando el césped bacteriano. C. elegans evita céspedes de bacterias patógenas ^1,2,3, céspedes de bacterias que producen toxinas o están enriquecidas con toxinas^1,4, e incluso bacterias que expresan ARNi cuya eliminación del gen objetivo es perjudicial para la salud de los gusanos ^4,5. Los estudios han demostrado que los gusanos responden a señales externas como metabolitos producidos por las bacterias patógenas ^1,6, o señales internas que indican que el alimento los está enfermando ^4,7. Estas señales se procesan a través de vías de señalización conservadas, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la vía del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ), y requieren comunicación entre el intestino y el sistema nervioso 4,6,7,8.

Aunque el ensayo es simple, el comportamiento aprendido se desarrolla durante muchas horas, a menudo durante la noche. Si bien hay mutantes que son incapaces de irse, en cuyo caso la evitación de puntuación en un solo punto de tiempo es suficiente para demostrar el defecto, muchos mutantes se van eventualmente, pero son más lentos para salir. Para estos, el movimiento de los gusanos debe rastrearse cada pocas horas, lo que puede ser difícil de hacer durante la noche. El conteo en sí también lleva tiempo, creando un tiempo de retraso entre las placas y, por lo tanto, limita el número de placas que se pueden probar al mismo tiempo. El uso de una configuración de imágenes para registrar muchas placas simultáneamente durante toda la duración del ensayo sería muy útil, pero el costo de la configuración puede ser prohibitivo, dependiendo de la situación de financiación del laboratorio de investigación.

Para abordar esto, ideamos un método muy simple que utiliza teléfonos inteligentes para registrar los ensayos de evitación. Cada teléfono puede grabar videos de lapso de tiempo de hasta seis placas de ensayo. Para proporcionar luz transmitida, utilizamos una caja de luz de diodo emisor de luz (LED) que se puede comprar fácilmente en línea. Las placas de ensayo se colocan en una plataforma elevada, sostenida por túneles rectangulares huecos, que enfocan la luz entrante, creando contraste. También proporcionamos un script de Python que convierte los videos en archivos de intercalado de audio y video (AVI) que muestran clips de 10 s de cada punto de tiempo por hora. Luego, los videos se recortan en placas individuales y se guardan en archivos separados para usarlos en el conteo manual.

El método proporciona un procedimiento de bajo costo que también es extremadamente fácil de usar, utilizando artículos que están fácilmente disponibles para la mayoría de las personas. Aquí, describimos el método utilizando el ensayo de evitación de césped bien establecido contra el patógeno humano Pseudomonas aeruginosa (PA14), cuyo protocolo ha sido descrito previamente ^2,9. Finalmente, también revisamos las consideraciones y limitaciones del método de imagen para aquellos que desean aplicarlo a otros experimentos de comportamiento de C. elegans.

Protocolo

1. Configuración del aparato de imagen (Figura 1A-E)

1. Asegúrese de que esté disponible una cámara de smartphone con los siguientes requisitos mínimos:
   Cámara de 12 megapíxeles (MP)
   Video con resolución de 1080p
   5 GB de espacio de almacenamiento (20 minutos de vídeo son 3-4 Gb)
   Aplicación de video de lapso de tiempo de la tienda de aplicaciones (aplicaciones gratuitas disponibles)
2. Coloque la caja de luz LED en la rejilla inferior de la incubadora de 25 °C donde se realizará el ensayo.
3. Para ocultar el patrón punteado en la superficie de la luz LED, extienda dos hojas de pañuelos para cubrir toda la superficie de la caja LED.
4. Haga una etapa elevada para la muestra (Figura 1A, D). La etapa elevada es una lámina de plástico transparente sostenida por túneles rectangulares huecos. Los túneles funcionan como un condensador para enfocar la luz, proporcionando un mejor contraste con la muestra (Figura 1C). Asegúrese de que las paredes del túnel estén algo oscuras para minimizar la dispersión de la luz. Este estudio utilizó cajas de papel marrón. La dimensión del túnel es de 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (ancho x largo x alto). La caja de luz LED puede adaptarse hasta cinco túneles.
5. Coloque otro bastidor sobre el escenario para colocar los teléfonos para grabar (Figura 1B, E). Cada teléfono grabará de tres a seis placas (una o dos filas de tres placas), así que ajuste la altura del rack en consecuencia. Esto será aproximadamente 15 cm por encima de la muestra (Figura 1B).
6. Coloque una regleta dentro de la incubadora para enchufar los teléfonos durante la grabación nocturna.

2. Preparación de buffers y medios

1. Preparar el tampón M9 añadiendo 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de_Na2HPO₄ y 5 g de NaCl a 1 L de H₂O destilado. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min. Enfríe el tampón y luego agregue 1 ml de 1 M MgSO₄.
2. Prepare 1 búfer KPO 4 M agregando 108.3 g de KH 2 PO 4 y 35.6 g de K 2 HPO₄ a 1 L de H ₂O. Ajuste el pH a 6.0 agregando KOH. Esterilizar en autoclave.
3. Prepare la solución blanqueadora de lombrices mezclando 1 ml de lejía, 0,4 ml de NaOH 1 M y 2,6 ml de_H2O.
4. Prepare las placas de agar de los medios de crecimiento de nematodos (NGM).
   1. Añadir 3 g de NaCl, 2,5 g de bacto peptona y 17 g de agar bacto en un matraz de 3 L. Agregue 975 ml de agua destilada e inserte una barra de agitación.
   2. Esterilizar en autoclave, luego enfriar a 55 °C y añadir 1 ml de colesterol (5 mg/ml en etanol), 1 ml de 1 M CaCl₂, 1 ml de 1 M_MgSO4 y 25 ml de 1 M KPO₄ tampón (pH 6.0). Revuelva para mezclar bien. Verter en platos de 6 cm. Deje que las placas se sequen durante al menos 2 días.
5. Siembre placas de agar NGM con OP50 E. coli pipeteando aproximadamente 1 ml de un cultivo nocturno de OP50 para formar un césped de bacterias. Dejar a temperatura ambiente (RT) hasta que esté listo para usar.

3. Preparación de placas NGM con alto contenido de peptona (para PA14)

NOTA: Estas placas deben hacerse al menos 5 días antes del ensayo.

1. Hacer NGM que contenga 0.35% de peptona. Mezclar 0,3 g de NaCl, 0,35 g de bacto peptona y 1,7 g de agar bacto en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Agregue 97.5 ml de agua destilada e inserte una barra de agitación.
2. Cubrir la boca del matraz con papel de aluminio y autoclave a 121 °C durante 20 min.
3. Enfriar a 55 °C y añadir 0,1 ml de colesterol (5 mg/ml en etanol), 0,1 ml de 1 M CaCl 2, 0,1 ml de 1 M_MgSO4 y_2,5 ml de 1 M KPO₄ tampón (pH 6,0). Revuelva para mezclar bien.
4. Vierta NGM de alta peptona en placas de Petri de 35 mm.
5. Seque las placas durante al menos 2 días.

4. Sincronización de gusanos por blanqueo

NOTA: Inicie este paso 3 días antes del ensayo.

1. Tome placas con gusanos adultos grávidos y recójalas en un microtubo de 1,7 ml lavando las placas con tampón M9.
2. Retire la mayor cantidad de líquido posible, luego agregue 400 μL de solución blanqueadora. Espere unos 4-5 minutos con vórtice intermitente, hasta que los cuerpos de gusanos adultos se rompan, liberando los huevos.
3. Agregue tampón M9 para llenar el resto del microtubo para diluir la solución blanqueadora. Girar a velocidad máxima (12.000 a 13.000 x g) durante 1-2 s. Retire el sobrenadante y lávese tres veces más con el tampón M9.
4. Transfiera los huevos a una placa de Petri vacía de 35 mm que contenga tampón M9. Deje que los huevos eclosionen durante la noche a 20 °C. En ausencia de alimentos, los gusanos eclosionados se detendrán en la etapa larvaria L1, sincronizando la etapa de desarrollo de todos los gusanos.
   NOTA: Cubrir la placa de Petri de 35 mm con solución de gelatina (0,05% de gelatina en agua esterilizada en autoclave) puede evitar que los huevos se peguen al fondo y minimizar la pérdida de huevos.
5. Al día siguiente, transfiera los gusanos de la etapa L1 a las placas NGM sembradas OP50.
6. Incubar los gusanos a 20 °C durante 53-54 h hasta que los gusanos alcancen la etapa larvaria L4.

5. Preparación de bacterias ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)

NOTA: Inicie este paso 4 días antes del ensayo.

1. Rayar bacterias descongeladas de -80 °C en una placa de agar Luria Bertani (LB) sin ningún antibiótico e incubar durante la noche a 37 °C.
   NOTA: Siempre use bacterias frescas. Las placas rayadas deben almacenarse a 4 °C durante no más de 1 semana.
2. Inocular una sola colonia en 3 ml de caldo de rey y cultivar durante la noche en una incubadora de agitación a 37 °C.
3. Al día siguiente, sembrar 7 μL del cultivo nocturno en las placas NGM con alto contenido de peptona e incubar a 37 °C durante 24 h.
4. Mueva las placas sembradas a RT e incube durante otras 24 h antes de usarlas. Una vez listo, utilizar el plato dentro de las siguientes 24 h.

6. Preparación para grabar

NOTA: Haga esto justo antes del ensayo.

1. Conecte el smartphone a la regleta conectada a una toma de corriente. Asegúrese de desactivar la configuración de bloqueo automático para evitar que el teléfono vuelva a la pantalla de bloqueo mientras graba.
2. Abra la aplicación de cámara de lapso de tiempo y establezca el intervalo de lapso de tiempo en 2 s. Establezca la calidad de video en 1080p a 30 fps.
3. Coloque el teléfono inteligente con la pantalla hacia arriba para grabar con la cámara trasera. Revise la pantalla para asegurarse de que los túneles de la caja de papel encajan dentro del campo de visión.

7. Ensayo para evitar el césped

1. Usando un pico de alambre de platino, transfiera 30 tornillos sin fin sincronizados de la etapa L4 (53-54 h desde L1) a la placa PA14. Coloque los gusanos en el medio del césped de las bacterias. Para cada condición en este estudio, se probaron dos placas (es decir, 60 gusanos por condición).
2. Coloque las dos placas en la platina elevada del aparato de grabación con la tapa hacia abajo. El lado con el agar estará mirando hacia la cámara.
3. En la pantalla del smartphone, toque dónde está la placa para que la cámara pueda enfocar las placas de ensayo. Ayuda tener una etiqueta o escritura en el plato, ya que la cámara puede usarla para enfocar correctamente.
   NOTA: La escritura en la parte inferior de las placas no interfiere con la imagen de los gusanos siempre que esté hacia el borde. Afortunadamente, los gusanos permanecen cerca del césped incluso después de irse, por lo que solo se necesita una vista sin obstáculos del área inmediata que rodea el césped.
4. Inicie la grabación.
5. Una vez que la grabación haya comenzado, agregue más placas al escenario. Puede haber un tiempo de retraso significativo entre las placas debido al tiempo que lleva transferir los gusanos mediante la recolección. Tenga en cuenta el tiempo de retraso posterior para que cada condición se pueda contar en el momento en que comenzó.
6. Graba durante 20 h desde el último juego de placas colocadas en el escenario. En el video de lapso de tiempo final, 20 h de grabación darán como resultado un video de 20 minutos de duración.
   NOTA: Puede valer la pena contar los gusanos directamente de las placas después del ensayo, al menos al principio durante las primeras ocasiones. Esto se puede comparar con los valores obtenidos a través de imágenes de video para garantizar que produzcan números similares.

8. Procesamiento de video usando script Python

1. Transfiera el archivo de película a un equipo para su procesamiento. La extensión será un archivo MOV (iPhone) o MP4 (Android).
2. Use un código Python para procesar los videos. El código se puede encontrar en github.com/khyoon201/wormavoid.
3. Para ejecutar los scripts de Python, asegúrese de que lo siguiente esté preinstalado en la computadora: ffmpeg, una herramienta para convertir archivos de video (las instrucciones para la instalación se pueden encontrar en su sitio web, ffmpeg.org/download), y los paquetes de Python os, pandas, tkinter y ffmpeg-python.
4. Encuentra las dimensiones y coordenadas de cada placa usando el guión extract_frame.py .
   1. Ejecute el script extract_frame.py . Aparecerá una ventana para seleccionar el archivo de video almacenado en la computadora. Una vez completada la ejecución, aparecerá un archivo jpeg con el mismo nombre en el mismo directorio.
   2. Abra el archivo jpeg en ImageJ (imagej.org).
   3. En el menú, elija Analizar > Establecer medidas. Asegúrese de que la casilla Mostrar etiqueta esté marcada (Figura 2A). Cierre la ventana.
   4. Con la herramienta Línea recta , mida el diámetro de una placa dibujando una línea a través de ella y, a continuación, seleccionando Analizar > medir en el menú. Si el video está en 1080p, cada placa tendrá aproximadamente 480 píxeles de ancho. Anote esta información y cierre la ventana Resultados .
   5. Con la herramienta Multipunto , marque los puntos en la parte superior izquierda de cada placa. Estos puntos se convertirán en la esquina superior izquierda de los videos recortados (Figura 2B). El orden importa; marcar en orden de cuando se iniciaron las placas. Después de crear un punto para todas las placas, elija Analizar > medir en el menú. Las mediciones, incluidas las coordenadas X e Y de los puntos, aparecerán en la ventana Resultados.
   6. Para procesar varios vídeos, repita el proceso en ImageJ con otros archivos jpeg. Todas las coordenadas X e Y se enumerarán en la misma ventana Resultados .
   7. Guarde la ventana Resultados en un archivo csv. El archivo debe guardarse en el mismo directorio que los archivos de película.
5. Encuentra la hora de inicio de cada plato.
   1. Reproduzca la película, ya sea en la computadora o en el teléfono, y tome nota de las horas de inicio de cada juego de placas colocadas debajo de la cámara.
   2. Abra el archivo Resultados.csv con las coordenadas y agregue una columna "inicio". Para cada fila correspondiente a placas individuales, introduzca la hora de inicio adecuada, en segundos, en la columna "inicio" (por ejemplo, si la hora de inicio es 0:00:08, introduzca 8). Salvar.
      NOTA: El nombre de la columna debe ser "inicio" (en minúsculas, sin comillas) para ser reconocido por la siguiente secuencia de comandos para recortar y recortar.
6. Recorta y recorta los videos.
   1. Ejecute el script crop_n_trim.py .
   2. Cuando se le solicite, elija el archivo Results.csv .
      Nota : asegúrese de que el archivo Results.csv y todos los archivos de película están en el mismo directorio.
   3. Introduzca las dimensiones de la placa. Introduzca el valor de píxel indicado anteriormente.
      NOTA: El script ahora leerá cada fila del archivo Results.csv para encontrar el archivo de película correcto leyendo el nombre del archivo en la columna "etiqueta" y recortar de acuerdo con las coordenadas indicadas en las columnas "X" e "Y". La hora de inicio de cada placa estará determinada por la hora indicada en la columna "inicio". Después de que el script termine de ejecutarse, aparecerá una carpeta con el mismo nombre que la película, seguida de la hora de inicio (por ejemplo, "Movie1_8"), en la que se guardarán los videos de 10 s correspondientes a cada punto de tiempo horario del ensayo.

9. Conteo manual usando ImageJ

1. Abra cada archivo AVI en ImageJ.
2. Cuente los gusanos que son visibles fuera del césped. Los gusanos que se superponen en un fotograma suelen separarse en otro fotograma para que puedan contarse correctamente.
3. Calcula la tasa de ocupación para cada punto de tiempo:
   Tasa de ocupación = (gusanos totales - número de gusanos fuera del césped)/gusanos totales
   NOTA: Los gusanos entrarán y saldrán del césped durante el video, pero esto no alterará significativamente los resultados. Trate de ir con el número que parece ser el promedio, o el número de gusanos en el punto de tiempo exacto por hora (5 s en el video).

Resultados

El primer video producido por el guión es de 1 h desde el inicio del ensayo. El video durante 0 h no se guarda, ya que los gusanos comienzan el ensayo dentro del césped, por lo que la tasa de ocupación siempre es del 100%.

Los gusanos N2 de tipo salvaje se comparan con los mutantes npr-1, cuyo defecto de evitación del césped está bien establecido en la literatura ^6,10 (Figura 3A-E

Discusión

Obtener imágenes del comportamiento animal, en lugar de depender de la observación directa, no solo es conveniente, sino que también tiene la ventaja de dejar documentación visual. Esto permite el análisis ciego por una tercera persona objetiva, o incluso podría usarse para el análisis automatizado utilizando técnicas de reconocimiento de imágenes. A pesar de las ventajas, el equipo estándar que generalmente se ofrece es de alto costo, por lo que uno está comprometido con la configuración una vez comprado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727