예쁜꼬마선충 잔디 회피 분석을 위한 스마트폰 기반 이미징 방법

요약

이 기사에서는 스마트폰 및 발광 다이오드(LED) 라이트 박스와 같이 쉽게 구할 수 있는 품목을 사용하여 예쁜꼬마선충의 잔디 회피 행동을 기록하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 또한 비디오 파일을 계산에 더 적합한 형식으로 처리하는 Python 스크립트를 제공합니다.

초록

독성 또는 병원성 박테리아에 노출되면 선충 Caenorhabditis elegans 는 학습된 잔디 회피 행동을 나타내며, 이 경우 벌레는 점차 먹이원을 떠나 박테리아 잔디 밖에 남아 있는 것을 선호합니다. 이 분석은 유해한 조건에 적절하게 대응하기 위해 외부 또는 내부 신호를 감지하는 웜의 능력을 테스트하는 쉬운 방법입니다. 간단한 분석이지만 계수는 특히 여러 샘플의 경우 시간이 많이 걸리고 밤새 지속되는 분석 기간은 연구자에게 불편합니다. 장기간에 걸쳐 많은 플레이트를 이미징할 수 있는 이미징 시스템은 유용하지만 비용이 많이 듭니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충의 잔디밭 회피를 기록하는 스마트폰 기반 이미징 방법을 설명합니다. 이 방법은 스마트폰과 발광 다이오드(LED) 라이트 박스만 있으면 투과된 광원 역할을 할 수 있습니다. 무료 타임랩스 카메라 애플리케이션을 사용하여 각 전화기는 잔디밭 밖에 있는 벌레를 수동으로 셀 수 있을 만큼 충분한 선명도와 대비로 최대 6개의 플레이트를 이미지화할 수 있습니다. 결과 동영상은 매 시간마다 10초 길이의 오디오 비디오 인터리브(AVI) 파일로 처리된 다음 각 단일 플레이트를 표시하도록 잘라서 계산하기 더 쉽게 만듭니다. 이 방법은 회피 결함을 검사하려는 사람들에게 비용 효율적인 방법이며 잠재적으로 다른 예쁜꼬마선충 분석으로 확장될 수 있습니다.

서문

예쁜꼬마선충 연구의 많은 장점 중 하나는 예쁜꼬마선충의 단순한 신경계가 유전적 및 세포 수준의 변화가 네트워크 기능과 행동 결과에 어떤 영향을 미치는지 연구할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 제한된 수의 뉴런을 가지고 있음에도 불구하고 예쁜꼬마선충은 다양한 복잡한 행동을 보입니다. 그 중 하나는 세균성 선충이 박테리아 잔디를 떠나 유해한 먹이원에 반응하는 잔디 회피입니다. 예쁜꼬마선충은 병원성 박테리아 1,2,3, 독소를 생성하거나 독소 ^1,4로 스파이크된 박테리아 잔디밭, 심지어 표적 유전자 녹다운이 벌레의 건강에 해로운 RNAi 발현 박테리아 ^4,5를 피합니다. 연구에 따르면 벌레는 병원성 박테리아에 의해 생성되는 대사 산물과 같은 외부 신호에 반응합니다 ^1,6, 또는 음식이 그들을 아프게 한다는 것을 나타내는 내부 신호 ^4,7. 이러한 신호는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 경로 및 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 경로와 같은 보존된 신호 전달 경로를 통해 처리되며 장과 신경계^사이의 통신이 필요합니다 4,6,7,8.

분석은 간단하지만 학습된 행동은 여러 시간에 걸쳐, 종종 하룻밤 사이에 발생합니다. 떠날 수 없는 돌연변이가 있지만, 이 경우 한 시점에 회피를 득점하는 것만으로도 결함을 입증하기에 충분하지만 많은 돌연변이는 결국 떠나지만 나오는 속도가 느립니다. 이를 위해 웜의 움직임을 몇 시간마다 추적해야 하며, 이는 하룻밤 사이에 수행하기 어려울 수 있습니다. 계수 자체에도 시간이 걸리고 플레이트 사이에 지연 시간이 발생하므로 동시에 테스트할 수 있는 플레이트의 수가 제한됩니다. 이미징 설정을 사용하여 전체 분석 기간 동안 많은 플레이트를 동시에 기록하는 것은 매우 유용하지만 연구실의 자금 조달 상황에 따라 설정 비용이 엄청날 수 있습니다.

이 문제를 해결하기 위해 우리는 스마트폰을 사용하여 회피 분석을 기록하는 매우 간단한 방법을 고안했습니다. 각 전화기는 최대 6개의 분석 플레이트의 타임랩스 비디오를 녹화할 수 있습니다. 투과광을 제공하기 위해 온라인에서 쉽게 구입할 수 있는 발광 다이오드(LED) 라이트 박스를 사용합니다. 분석 플레이트는 속이 빈 직사각형 터널로 지지되는 높은 플랫폼에 배치되어 들어오는 빛에 초점을 맞춰 대비를 만듭니다. 또한 비디오를 각 시간별 시점의 10초 클립을 보여주는 AVI(오디오 비디오 인터리브) 파일로 변환하는 Python 스크립트를 제공합니다. 그런 다음 비디오를 개별 플레이트로 자르고 수동 계산에 사용할 별도의 파일에 저장합니다.

이 방법은 대부분의 사람들이 쉽게 사용할 수 있는 항목을 사용하여 사용하기 매우 쉬운 저렴한 절차를 제공합니다. 여기에서 우리는 인간 병원체 녹농균(PA14)에 대해 잘 확립된 잔디 회피 분석을 사용하는 방법을 설명하며, 그 프로토콜은 이전에 ^2,9. 마지막으로, 우리는 또한 다른 예쁜꼬마선충 행동 실험에 적용하려는 사람들을 위해 이미징 방법의 고려 사항과 한계를 검토합니다.

프로토콜

1. 이미징 장치 설정(그림 1A-E)

1. 다음과 같은 최소 요구 사항을 충족하는 스마트폰 카메라를 사용할 수 있는지 확인합니다.
   12 메가픽셀 (MP) 카메라
   1080p 해상도 비디오
   5GB의 저장 공간(20분 비디오는 3-4Gb)
   앱 스토어의 타임랩스 비디오 앱(무료 앱 사용 가능)
2. 분석이 수행될 25°C 인큐베이터의 하단 랙에 LED 라이트 박스를 놓습니다.
3. LED 조명 표면의 점선 패턴을 숨기려면 두 장의 티슈를 펴서 LED 상자의 전체 표면을 덮습니다.
4. 상승된 s를 만드십시오.tage 표본을 위해(그림 1A,D). 높은 무대는 속이 빈 직사각형 터널로 지지되는 투명한 플라스틱 시트입니다. 터널은 빛을 집중시키는 콘덴서와 같은 기능을 하여 표본에 더 나은 대비를 제공합니다(그림 1C). 빛의 산란을 최소화하기 위해 터널의 벽이 약간 어두운지 확인하십시오. 이 연구에서는 갈색 종이 상자를 사용했습니다. 터널의 치수는 5.5cm x 17cm x 4.5cm(W x L x H)입니다. LED 라이트 박스는 최대 5개의 터널에 장착할 수 있습니다.
5. 무대 위에 다른 랙을 배치하여 녹음을 위해 전화기를 배치합니다(그림 1B, E). 각 전화기는 3-6개의 플레이트(3개의 플레이트로 구성된 1-2행)를 기록하므로 그에 따라 랙 높이를 조정합니다. 이것은 표본 위의 약 15cm가 될 것입니다(그림 1B).
6. 인큐베이터 내부에 멀티탭을 넣어 야간 녹음 중에 전화기를 연결합니다.

2. 완충액 및 배지 준비

1. 증류된 H2O 1L에 3g의 KH2PO4, 6g의_Na2HPO4및 5g의 NaCl을 첨가하여 M9 완충액을 준비하고,₁₂₁°C에서20분 동안 오토클레이빙하여 살균한다. 완충액을 식힌 다음 1mL의 1M_MgSO4를 추가합니다.
2. 1 L의 H2O에 108.3 g의 KH2PO4 및 35.6 g의_K2HPO4를 첨가하여 1 M_KPO4 완충액을 제조하고, KOH를 첨가하여 pH를 6.0으로 조절한다. 고압 증기 멸균으로 소독하십시오.
3. 표백제 1mL, 1M NaOH 0.4mL 및_H2O2.6mL를 혼합하여 웜 표백 용액을 준비합니다.
4. 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트를 준비합니다.
   1. 3L 플라스크에 NaCl 3g, 박토 펩톤 2.5g, 박토 한천 17g을 넣습니다. 증류수 975mL를 넣고 교반 막대를 넣습니다.
   2. 고압 증기 멸균으로 멸균 한 다음 55 °C로 냉각하고 콜레스테롤 1mL (에탄올 중 5mg / mL), 1M CaCl₂ 1mL, 1M MgSO 4 1mL 및 1M KPO₄ 완충액 25mL (pH 6.0). 잘 섞이도록 저어줍니다. 6cm 접시에 붓습니다. 접시를 최소 2 일 동안 말리십시오.
5. OP50의 하룻밤 배양물을 약 1 mL의 피펫팅하여 OP50 E. coli 로 NGM 한천 플레이트를 시딩하여 박테리아의 잔디를 형성하였다. 사용할 준비가 될 때까지 실온(RT)에 두십시오.

3. 고펩톤 NGM 플레이트 준비(PA14용)

참고: 이 플레이트는 분석 최소 5일 전에 만들어야 합니다.

1. 0.35% 펩톤을 함유한 NGM을 만듭니다. 250mL 삼각 플라스크에 NaCl 0.3g, 박토 펩톤 0.35g, 박토 한천 1.7g을 섞습니다. 증류수 97.5mL를 넣고 교반 막대를 넣습니다.
2. 플라스크의 입구를 알루미늄 호일로 덮고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
3. 55°C로 식히고 콜레스테롤 0.1mL(에탄올 중 5mg/mL), 1M_CaCl2 0.1mL, 1M MgSO₄ 0.1mL 및 1M_KPO4 완충액(pH 6.0) 2.5mL를 추가합니다. 잘 섞이도록 저어줍니다.
4. 고펩톤 NGM을 35mm 페트리 접시에 붓습니다.
5. 적어도 2 일 동안 플레이트를 건조시킵니다.

4. 표백에 의한 웜 동기화

참고: 분석 3일 전에 이 단계를 시작합니다.

1. 중력이 있는 성충이 있는 접시를 가져다가 M9 완충액으로 접시를 세척하여 1.7mL 마이크로튜브에 수집합니다.
2. 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음 표백 용액 400μL를 추가합니다. 성충 벌레 몸이 부서져 알을 낳을 때까지 간헐적 인 소용돌이로 약 4-5 분 정도 기다리십시오.
3. 표백 용액을 희석하기 위해 나머지 마이크로튜브를 채우기 위해 M9 버퍼를 추가합니다. 최대 속도(12,000 - 13,000 x g)로 1-2초 동안 회전합니다. 상층액을 제거하고 M9 완충액으로 세 번 더 세척합니다.
4. M35 버퍼가 들어 있는 빈 9mm 페트리 접시에 계란을 옮깁니다. 알을 20°C에서 밤새 부화시킵니다. 음식이 없으면 부화 한 벌레는 L1 애벌레 단계에서 체포되어 모든 벌레의 발달 단계를 동기화합니다.
   알림: 35mm 페트리 접시에 젤라틴 용액(오토클레이브 물에 0.05% 젤라틴)을 코팅하면 계란이 바닥에 달라붙는 것을 방지하고 계란 손실을 최소화할 수 있습니다.
5. 다음 날, L1 스테이지 웜을 OP50 시드 NGM 플레이트로 옮깁니다.
6. 벌레가 L4 애벌레 단계에 도달할 때까지 20°C에서 53-54시간 동안 벌레를 배양합니다.

5. 박테리아 (녹농균, PA14)의 제조

참고: 분석 4일 전에 이 단계를 시작합니다.

1. 항생제 없이 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트에서 -80°C에서 해동된 박테리아를 줄무늬로 제거하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   알림: 항상 신선한 박테리아를 사용하십시오. 줄무늬 플레이트는 4°C에서 1주일 이상 보관하지 않아야 합니다.
2. 단일 콜로니를 King's 브로스 3mL에 접종하고 37°C 진탕 인큐베이터에서 밤새 성장시킵니다.
3. 다음날, 하룻밤 동안 배양된 7 μL의 고펩톤 NGM 플레이트 상에 시딩하고, 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
4. 시드 플레이트를 RT로 옮기고 사용하기 전에 24시간 더 배양합니다. 준비가 되면 다음 24시간 이내에 플레이트를 사용하십시오.

6. 녹음 준비

알림: 분석 직전에 이 작업을 수행합니다.

1. 스마트폰을 전원 콘센트에 연결된 멀티탭에 꽂습니다. 녹음하는 동안 휴대폰이 잠금 화면으로 돌아가지 않도록 자동 잠금 설정을 비활성화해야 합니다.
2. 타임랩스 카메라 앱을 열고 타임랩스 간격을 2초로 설정합니다. 비디오 품질을 1080fps에서 30p로 설정합니다.
3. 스마트폰을 화면이 위를 향하도록 놓으면 후면 카메라로 녹화할 수 있습니다. 화면을 확인하여 종이 상자 터널이 시야에 맞는지 확인합니다.

7. 잔디 회피 분석

1. 플래티넘 와이어 픽을 사용하여 30개의 동기화된 L4 스테이지 웜(L53에서 54-1시간)을 PA14 플레이트로 전송합니다. 박테리아 잔디밭 한가운데에 벌레를 놓습니다. 이 연구의 각 조건에 대해 두 개의 플레이트를 테스트했습니다(즉, 조건당 60개의 웜).
2. 두 개의 플레이트를 높은 곳에 놓습니다.tage 덮개가 아래를 향하도록 하여 녹음 장치. 한천이 있는 면이 카메라를 향하게 됩니다.
3. 스마트폰 화면에서 플레이트가 있는 위치를 탭하면 카메라가 분석 플레이트에 초점을 맞출 수 있습니다. 카메라가 올바르게 초점을 맞추는 데 사용할 수 있으므로 플레이트에 레이블이나 글씨를 두는 것이 도움이 됩니다.
   알림: 플레이트 바닥에 글을 써도 가장자리를 향하고 있는 한 벌레의 이미징을 방해하지 않습니다. 다행스럽게도 벌레는 떠난 후에도 잔디밭 근처에 머물기 때문에 잔디밭을 둘러싼 바로 옆 지역만 방해받지 않고 볼 수 있습니다.
4. 녹음을 시작합니다.
5. 녹음이 시작되면 스테이지에 플레이트를 더 추가합니다. 피킹을 통해 웜을 옮기는 데 걸리는 시간으로 인해 플레이트 사이에 상당한 지연 시간이 있을 수 있습니다. 각 조건이 시작된 시점에 계산할 수 있도록 나중에 지연 시간을 기록해 둡니다.
6. 스테이지에 놓인 마지막 플레이트 세트에서 20시간 동안 녹화합니다. 최종 타임랩스 비디오에서 20시간 동안 녹화하면 20분 길이의 비디오가 됩니다.
   알림: 분석 후 플레이트에서 직접 웜을 세는 것이 가치가 있을 수 있습니다., 적어도 처음 몇 번은 처음에. 이를 비디오 이미징을 통해 얻은 값과 비교하여 유사한 수치를 얻을 수 있습니다.

8. Python 스크립트를 사용한 비디오 처리

1. 처리를 위해 동영상 파일을 컴퓨터로 전송합니다. 확장자는 MOV(iPhone) 또는 MP4 파일(Android)입니다.
2. Python 코드를 사용하여 비디오를 처리합니다. 코드는 github.com/khyoon201/wormavoid 에서 찾을 수 있습니다.
3. Python 스크립트를 실행하려면 비디오 파일 변환 도구인 ffmpeg(설치 지침은 웹 사이트 ffmpeg.org/download 에서 찾을 수 있음)와 Python 패키지 os, pandas, tkinter 및 ffmpeg-python이 컴퓨터에 사전 설치되어 있는지 확인하십시오.
4. extract_frame.py 스크립트를 사용하여 각 판의 치수와 좌표를 찾습니다.
   1. extract_frame.py 스크립트를 실행합니다. 컴퓨터에 저장된 비디오 파일을 선택하는 창이 나타납니다. 실행이 완료되면 같은 이름의 jpeg 파일이 같은 디렉토리에 나타납니다.
   2. ImageJ(imagej.org)에서 jpeg 파일을 엽니다.
   3. 메뉴에서 Analyze(분석) > Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다. Display Label(레이블 표시 ) 상자가 선택되어 있는지 확인합니다(그림 2A). 창을 닫습니다.
   4. [직선] 도구를 사용하여 플레이트를 가로질러 선을 그린 다음 메뉴에서 [분석] > [측정]을 선택하여 플레이트의 지름을 측정합니다. 동영상이 1080p인 경우 각 플레이트의 너비는 약 480픽셀입니다. 이 정보를 기록하고 결과 창을 닫습니다.
   5. 다점 도구를 사용하여 각 플레이트의 왼쪽 상단에 점을 표시합니다. 이 지점은 잘린 비디오의 왼쪽 위 모서리가 됩니다(그림 2B). 순서가 중요합니다. 플레이트가 시작된 순서대로 표시하십시오. 모든 플레이트에 대한 점을 만든 후 메뉴에서 분석 > 측정을 선택합니다. 포인트의 X 및 Y 좌표를 포함한 측정값이 결과 창에 나타납니다.
   6. 여러 비디오를 처리하려면 ImageJ에서 다른 jpeg 파일과 함께 프로세스를 반복합니다. 모든 X 및 Y 좌표가 동일한 결과 창에 나열됩니다.
   7. 결과 창을 csv 파일에 저장합니다. 파일은 동영상 파일과 동일한 디렉터리에 저장해야 합니다.
5. 각 접시의 시작 시간을 찾으십시오.
   1. 컴퓨터나 휴대폰에서 동영상을 재생하고 카메라 아래에 놓인 각 플레이트 세트의 시작 시간을 기록해 둡니다.
   2. 좌표가 있는 Results.csv 파일을 열고 "시작" 열을 추가합니다. 개별 플레이트에 해당하는 각 행에 대해 "시작" 열 아래에 적절한 시작 시간(초)을 입력합니다(예: 시작 시간이 0:00:08인 경우 8 입력). 구해내다.
      참고: 열 이름은 "start"(소문자, 따옴표 제외)여야 자르기 및 트리밍을 위해 다음 스크립트에서 인식할 수 있습니다.
6. 비디오를 자르고 다듬습니다.
   1. crop_n_trim.py 스크립트를 실행합니다.
   2. 메시지가 표시되면 [Results.csv 파일을 선택합니다.
      참고: 결과.csv 파일과 모든 동영상 파일이 같은 디렉터리에 있는지 확인합니다.
   3. 플레이트 치수를 입력합니다. 앞에서 적어 둔 픽셀 값을 입력합니다.
      참고: 이제 스크립트는 Results.csv 파일의 각 행을 읽어 "레이블" 열의 파일 이름을 읽고 "X" 및 "Y" 열에 표시된 좌표에 따라 올바른 동영상 파일을 찾습니다. 각 플레이트의 시작 시간은 "시작" 열에 표시된 시간에 따라 결정됩니다. 스크립트 실행이 완료되면 동영상과 동일한 이름의 폴더가 나타나고 시작 시간(예: "Movie1_8")이 표시되며, 이 폴더에는 분석의 각 시간별 시점에 해당하는 10초 비디오가 저장됩니다.

9. ImageJ를 사용한 수동 계산

1. ImageJ에서 각 AVI 파일을 엽니다.
2. 잔디밭 밖에서 볼 수있는 벌레를 세십시오. 한 프레임에서 겹쳐진 웜은 일반적으로 올바르게 계산될 수 있도록 다른 프레임에서 분리됩니다.
3. 각 시점의 점유율을 계산합니다.
   점유율 = (총 벌레 - 잔디밭 밖에 있는 벌레 수)/총 벌레
   알림: 웜은 비디오 중에 잔디밭 안팎으로 이동하지만 결과가 크게 변경되지는 않습니다. 평균으로 보이는 숫자 또는 정확한 시간별 시점(비디오에서 5초)의 웜 수를 사용하십시오.

결과

스크립트에 의해 생성된 첫 번째 비디오는 분석 시작 후 1시간입니다. 웜이 잔디밭 내부에서 분석을 시작하므로 0시간 동안의 비디오는 저장되지 않으므로 점유율은 항상 100%입니다.

야생형 N2 웜은 npr-1 돌연변이체와 비교되며, 그의 잔디 회피 결함은 문헌 ^6,10(그림 3A-E)에 잘 확립되어 ?...

토론

직접적인 관찰에 의존하지 않고 동물의 행동을 이미징하는 것은 편리할 뿐만 아니라 시각적 문서를 남길 수 있는 이점도 있습니다. 이를 통해 객관적인 제3자에 의한 블라인드 분석이 가능하거나 이미지 인식 기술을 사용한 자동 분석에도 사용할 수 있습니다. 장점에도 불구하고 일반적으로 제공되는 표준 장비는 비용이 많이 들기 때문에 한 번 구입하면 설정에 전념합니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727