Метод визуализации на основе смартфона для анализа избегания газонов C. elegans

В этой статье описывается простой и недорогой метод записи поведения Caenorhabditis elegans при избегании газона с использованием легкодоступных предметов, таких как смартфон и световой короб со светодиодами (LED). Мы также предоставляем скрипт Python для обработки видеофайла в формате, более удобном для подсчета.

Аннотация

При контакте с токсичными или патогенными бактериями нематода Caenorhabditis elegans демонстрирует выученное поведение избегания газона, при котором черви постепенно покидают свой источник пищи и предпочитают оставаться за пределами бактериального газона. Анализ — это простой способ проверить способность червей воспринимать внешние или внутренние сигналы, чтобы правильно реагировать на вредные условия. Несмотря на то, что это простой анализ, подсчет занимает много времени, особенно с несколькими образцами, а продолжительность анализа, охватывающая ночь, неудобна для исследователей. Система визуализации, которая может визуализировать множество пластин в течение длительного периода времени, полезна, но дорогостояща. Здесь мы описываем метод визуализации на основе смартфона для записи избегания газонов у C. elegans. Для этого метода требуется только смартфон и световой короб со светодиодом (LED), который будет служить источником пропускаемого света. Используя бесплатные приложения для покадровой съемки, каждый телефон может отображать до шести пластин с достаточной резкостью и контрастностью, чтобы вручную подсчитывать червей за пределами газона. Полученные фильмы обрабатываются в 10-секундные файлы с чередованием аудио-видео (AVI) для каждого часового момента времени, а затем обрезаются, чтобы показать каждую отдельную пластину, чтобы сделать их более удобными для подсчета. Этот метод является экономически эффективным способом для тех, кто хочет изучить дефекты избегания, и потенциально может быть распространен на другие анализы C. elegans.

Введение

Среди многих преимуществ изучения C. elegans его простая нервная система дает возможность изучить, как изменения на генетическом и клеточном уровне влияют на функцию сети и поведенческие результаты. Несмотря на ограниченное количество нейронов, C. elegans демонстрируют широкий спектр сложного поведения. Одним из них является избегание газона, при котором бактериоядная нематода реагирует на вредный источник пищи, покидая бактериальный газон. C. elegans избегают газонов патогенных бактерий ^1,2,3, газонов бактерий, которые продуцируют токсины или содержат токсины^1,4, и даже РНКi-экспрессирующих бактерии, чей целевой ген наносит ущерб здоровью червей ^4,5. Исследования показали, что черви реагируют на внешние сигналы, такие как метаболиты, продуцируемые патогенными бактериями ^1,6, или внутренние сигналы, которые указывают на то, что пища вызывает у них заболевание ^4,7. Эти сигналы обрабатываются через консервативные сигнальные пути, такие как путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и путь трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), и требуют связи между кишечником и нервной системой 4,6,7,8.

Хотя анализ прост, усвоенное поведение развивается в течение многих часов, часто в течение ночи. В то время как есть мутанты, которые не способны уйти, и в этом случае для демонстрации дефекта достаточно уклонения от оценки только в один момент времени, многие мутанты в конечном итоге уходят, но выходят медленнее. Для этого необходимо отслеживать движение червей каждые несколько часов, что может быть трудно сделать за ночь. Сам подсчет также требует времени, создавая время задержки между пластинами и, таким образом, ограничивает количество пластин, которые могут быть протестированы одновременно. Использование установки визуализации для одновременной записи многих планшетов в течение всего времени анализа было бы очень полезным, но стоимость установки может быть непомерно высокой, в зависимости от ситуации с финансированием исследовательской лаборатории.

Чтобы решить эту проблему, мы разработали очень простой метод, который использует смартфоны для записи анализов избегания. Каждый телефон может записывать покадровые видеоролики до шести пробирных пластин. Для обеспечения проходящего света мы используем светоизлучающий диодный (LED) световой короб, который можно легко приобрести в Интернете. Пробирные пластины размещаются на возвышенной платформе, поддерживаемой полыми прямоугольными туннелями, которые фокусируют поступающий свет, создавая контраст. Мы также предоставляем скрипт Python, который преобразует видео в файлы с чередованием аудио-видео (AVI), показывающие 10-секундные клипы каждого часового момента времени. Затем видео обрезаются до отдельных пластин и сохраняются в отдельных файлах для ручного подсчета.

Этот метод обеспечивает недорогую процедуру, которая также чрезвычайно проста в использовании, используя предметы, которые легко доступны для большинства людей. Здесь мы описываем метод с использованием хорошо зарекомендовавшего себя анализа избегания газонов против патогена человека Pseudomonas aeruginosa (PA14), протокол которого был описан ранее ^2,9. Наконец, мы также рассматриваем соображения и ограничения метода визуализации для тех, кто хочет применить его к другим экспериментам по поведению C. elegans.

протокол

1. Настройка аппарата визуализации (рис. 1A-E)

Убедитесь, что доступна камера смартфона со следующими минимальными требованиями:
12-мегапиксельная (МП) камера
Видео с разрешением 1080p
5 ГБ дискового пространства (20-минутное видео составляет 3-4 ГБ)
Приложение для покадровой видеосъемки из магазина приложений (доступны бесплатные приложения)
Поместите светодиодный световой короб на нижнюю полку инкубатора с температурой 25 °C, где будет проводиться анализ.
Чтобы скрыть точечный узор на поверхности светодиодной подсветки, расстелите два листа салфеток, чтобы покрыть всю поверхность светодиодной коробки.
Сделайте приподнятую ступень для образца (рис. 1A, D). Надземная ступень представляет собой прозрачный пластиковый лист, поддерживаемый полыми прямоугольными туннелями. Туннели функционируют как конденсатор для фокусировки света, обеспечивая лучший контраст с образцом (рис. 1C). Убедитесь, что стены туннеля несколько темные, чтобы свести к минимуму рассеивание света. В этом исследовании использовались коричневые бумажные коробки. Размеры туннеля составляют 5,5 см х 17 см х 4,5 см (Ш х Д х В). Светодиодный световой короб может вместить до пяти туннелей.
Установите еще одну стойку над сценой, чтобы разместить телефоны для записи (рис. 1B, E). Каждый телефон будет записывать от трех до шести пластин (от одного до двух рядов по три пластины), поэтому отрегулируйте высоту стойки соответствующим образом. Это будет примерно на 15 см выше образца (рис. 1B).
Поместите удлинитель внутрь инкубатора, чтобы подключить телефоны во время ночной записи.

2. Подготовка буферов и сред

Приготовьте буфер M9, добавив 3 г KH 2 PO 4, 6 г Na 2 HPO₄ и 5 г NaCl к 1 л дистиллированного H ₂O. Стерилизовать автоклавированием при 121 ° C втечение 20 мин. Охладите буфер, а затем добавьте 1 мл 1 М MgSO₄.
Приготовьте 1 М буфера КПО 4, добавив 108,3 г KH 2 PO 4 и 35,6 г K 2 HPO₄ к 1 л H₂O. Отрегулируйте pH до 6,0, добавив KOH. Стерилизовать автоклавированием.
Приготовьте раствор для червячного отбеливания, смешав 1 мл отбеливателя, 0,4 мл 1 М NaOH и 2,6 мл H₂O.
Подготовьте агаровые пластины для питательных сред нематод (NGM).
1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептона и 17 г агара в колбу объемом 3 л. Добавьте 975 мл дистиллированной воды и вставьте мешалку.
2. Стерилизовать автоклавированием, затем охладить до 55 °C и добавить 1 мл холестерина (5 мг/мл этанола), 1 мл 1 М CaCl₂, 1 мл 1 М MgSO₄ и 25 мл 1 М буфера КПО₄ (рН 6,0). Перемешайте, чтобы хорошо перемешать. Разлить по 6-сантиметровым тарелкам. Дайте пластинам высохнуть не менее 2 дней.
Засейте агаровые пластины NGM с OP50 E. coli путем пипетки примерно 1 мл ночной культуры OP50 для формирования газона из бактерий. Оставьте при комнатной температуре (RT) до готовности.

3. Подготовка высокопептонных пластин NGM (для PA14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти планшеты должны быть изготовлены не менее чем за 5 дней до анализа.

Сделайте NGM, содержащий 0,35% пептона. Смешайте 0,3 г NaCl, 0,35 г пептона бакто и 1,7 г агара в колбе Эрленмейера объемом 250 мл. Добавьте 97,5 мл дистиллированной воды и вставьте мешалку.
Горлышко колбы накройте алюминиевой фольгой и автоклавом при температуре 121 °C на 20 мин.
Охладите до 55 °C и добавьте 0,1 мл холестерина (5 мг/мл в этаноле), 0,1 мл 1 М CaCl2, 0,1 мл 1 М MgSO 4 и 2,5 мл 1 М буфера КПО₄ (рН_6,0). Перемешайте, чтобы хорошо перемешать.
Налейте высокопептонный NGM в чашки Петри диаметром 35 мм.
Сушите пластины не менее 2 дней.

4. Синхронизация червей путем отбеливания

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните этот шаг за 3 дня до анализа.

Возьмите планшеты с гравидными взрослыми червями и соберите их в микропробирку объемом 1,7 мл, промыв пластины буфером М9.
Удалите как можно больше жидкости, затем добавьте 400 мкл отбеливающего раствора. Подождите около 4-5 минут при прерывистом вихре, пока тела взрослых червей не сломаются, выпустив яйца.
Добавьте буфер M9, чтобы заполнить оставшуюся часть микротрубки, чтобы разбавить отбеливающий раствор. Отжим на максимальной скорости (от 12 000 до 13 000 x g) в течение 1-2 с. Удалите надосадочную жидкость и промойте еще три раза буфером М9.
Переложите яйца в пустую чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую буфер M9. Дайте яйцам вылупиться в течение ночи при температуре 20 °C. При отсутствии пищи вылупившиеся черви останавливаются на личиночной стадии L1, синхронизируя стадию развития всех червей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие 35-миллиметровой чашки Петри раствором желатина (0,05% желатина в автоклавной воде) может предотвратить прилипание яиц ко дну и свести к минимуму потерю яиц.
На следующий день перенесите червей стадии L1 на засеянные OP50 пластины NGM.
Инкубируйте червей при 20 ° C в течение 53-54 часов, пока черви не достигнут личиночной стадии L4.

5. Подготовка бактерий (Pseudomonas aeruginosa, PA14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните этот шаг за 4 дня до анализа.

Разморозьте размороженные бактерии при температуре -80 °C на агаровой пластине Luria Bertani (LB) без антибиотика и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежие бактерии. Пластины с прожилками следует хранить при температуре 4 °C не более 1 недели.
Инокулируйте одну колонию в 3 мл королевского бульона и выращивайте в течение ночи в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 ° C.
На следующий день высевают 7 мкл ночной культуры на высокопептонные пластины NGM и инкубируют при 37 ° C в течение 24 часов.
Переложите посеянные пластины в RT и выдержите еще 24 часа перед использованием. Когда все будет готово, используйте тарелку в течение следующих 24 часов.

6. Подготовка к записи

ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте это прямо перед анализом.

Подключите смартфон к удлинителю, подключенному к розетке. Обязательно отключите настройку автоматической блокировки, чтобы телефон не возвращался на экран блокировки во время записи.
Откройте приложение покадровой камеры и установите интервал покадровой съемки равным 2 с. Установите качество видео 1080p со скоростью 30 кадров в секунду.
Поместите смартфон экраном вверх для записи с помощью задней камеры. Проверьте экран, чтобы убедиться, что туннели бумажной коробки вписываются в поле зрения.

7. Анализ избегания газонов

Используя медиатор из платиновой проволоки, перенесите 30 синхронизированных червяков ступени L4 (53-54 ч от L1) на пластину PA14. Поместите червей в середину бактериального газона. Для каждого состояния в этом исследовании были протестированы две пластины (т.е. 60 червей на условие).
Поместите две пластины на приподнятую ступень записывающего устройства крышкой вниз. Сторона с агаром будет обращена вверх к камере.
На экране смартфона коснитесь того места, где находится пластина, чтобы камера могла сфокусироваться на пробирных пластинах. Полезно иметь этикетку или надпись на табличке, так как камера может использовать это для правильной фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надписи на дне пластин не мешают изображению червей, если они находятся ближе к краю. К счастью, черви остаются рядом с газоном даже после того, как они уходят, поэтому беспрепятственный обзор нужен только на ближайшую территорию, окружающую газон.
Начните запись.
Как только запись начнется, добавьте на сцену еще несколько пластинок. Между пластинами может быть значительное время задержки из-за времени, необходимого для переноса червей путем сбора. Обратите внимание на время задержки после этого, чтобы каждое условие можно было подсчитать в момент его начала.
Запись за 20 ч с последнего набора тарелок, размещенных на сцене. В финальном замедленном видео 20 часов записи приведут к 20-минутному видео.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, стоит подсчитывать червей непосредственно с пластин после анализа, по крайней мере, в начале в первых нескольких случаях. Это можно сравнить со значениями, полученными с помощью видеоизображений, чтобы убедиться, что они дают одинаковые числа.

8. Обработка видео с помощью скрипта Python

Перенесите файл фильма на компьютер для обработки. Расширение будет представлять собой файл MOV (iPhone) или MP4 (Android).
Используйте код Python для обработки видео. Код можно найти по адресу github.com/khyoon201/wormavoid.
Для запуска скриптов Python убедитесь, что на компьютере предустановлены: ffmpeg, инструмент для преобразования видеофайлов (инструкции по установке можно найти на его веб-сайте, ffmpeg.org/download), и пакеты Python os, pandas, tkinter и ffmpeg-python.
Найдите размеры и координаты каждой пластины с помощью extract_frame.py скрипта.
1. Запустите сценарий extract_frame.py . Появится окно для выбора видеофайла, хранящегося на компьютере. После завершения запуска в том же каталоге появится jpeg-файл с таким же именем.
2. Откройте файл jpeg в ImageJ (imagej.org).
3. В меню выберите «Анализировать» > «Задать измерения». Убедитесь, что установлен флажок Display Label (рисунок 2A). Закройте окно.
4. С помощью инструмента « Прямая линия » измерьте диаметр пластины, проведя по ней линию, а затем выбрав в меню пункт « Анализировать» > «Измерить ». Если видео в формате 1080p, каждая пластина будет иметь ширину около 480 пикселей. Запишите эту информацию и закройте окно Результаты .
5. С помощью инструмента « Многоточечный » отметьте точки в верхнем левом углу каждой пластины. Эти точки станут верхним левым углом обрезанных видео (рис. 2B). Порядок имеет значение; отметьте в том порядке, когда были запущены пластины. Создав точку для всех пластин, выберите в меню пункт «Анализировать» > «Измерить ». Измерения, включая координаты точек по осям X и Y, появятся в окне «Результаты».
6. Чтобы обработать несколько видео, повторите процесс в ImageJ с другими файлами jpeg. Все координаты X и Y будут перечислены в одном окне результатов .
7. Сохраните окно «Результаты » в CSV-файле. Файл должен быть сохранен в том же каталоге, что и файлы фильмов.
Найдите время начала для каждой тарелки.
1. Воспроизведите фильм на компьютере или телефоне и запишите время начала каждого набора пластин, помещенных под камеру.
2. Откройте файл Results.csv с координатами и добавьте столбец «старт». Для каждой строки, соответствующей отдельным табличкам, введите соответствующее время начала в секундах в столбце «старт» (например, если время начала 0:00:08, введите 8). Спасать.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Имя столбца должно быть "start" (в нижнем регистре, без кавычек), чтобы быть распознанным следующим скриптом для обрезки и обрезки.
Обрезайте и обрезайте видео.
1. Запустите сценарий crop_n_trim.py .
2. При появлении запроса выберите файл Results.csv .
  ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что файл Results.csv и все файлы фильмов находятся в одном каталоге.
3. Введите размеры пластины. Введите значение в пикселях, указанное ранее.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь сценарий будет читать каждую строку файла Results.csv , чтобы найти правильный файл фильма, прочитав имя файла в столбце «метка», и обрезать в соответствии с координатами, указанными в столбцах «X» и «Y». Время старта каждой таблички будет определяться временем, указанным в столбце «старт». После того, как сценарий завершит работу, появится папка с тем же именем, что и фильм, за которым следует время начала (например, «Movie1_8»), в котором будут сохранены 10-секундные видеоролики, соответствующие каждому часовому моменту времени анализа.

9. Ручной подсчет с помощью ImageJ

Откройте каждый файл AVI в ImageJ.
Посчитайте червей, которые видны за пределами газона. Черви, которые перекрываются в одном кадре, обычно раздвигаются в другом кадре, чтобы их можно было правильно посчитать.
Рассчитайте заполняемость для каждого момента времени:
Коэффициент занятости = (общее количество червей - количество червей за пределами газона)/общее количество червей
ПРИМЕЧАНИЕ: Черви будут входить и выходить из газона во время видео, но это существенно не изменит результаты. Попробуйте использовать число, которое кажется средним, или количество червей в точный часовой момент времени (5 секунд в видео).

Результаты

Первое видео, созданное по сценарию, происходит через 1 час после начала анализа. Видео за 0 ч не сохраняется, так как черви начинают пробу внутри газона, поэтому заполняемость всегда 100%.

Черви N2 дикого типа сравниваются с мутантами npr-1, чей дефект избегания газонов хор...

Обсуждение

Визуализация поведения животных, вместо того, чтобы полагаться на прямое наблюдение, не только удобна, но и имеет то преимущество, что оставляет визуальную документацию. Это позволяет проводить слепой анализ объективным третьим лицом или даже может быть использовано для автоматическо...

Раскрытие информации

Конфликты интересов не заявлены.

Благодарности

Мы благодарим Дока Джунга Ли за критическое прочтение рукописи и тестирование кода Python. Это исследование было спонсировано Национальным исследовательским фондом Кореи 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) и 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl₂	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K₂HPO₄)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO₄	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH₂PO₄)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na₂HPO₄)	YAKURI	#31727