C. elegans Çim Önleme Testi için Akıllı Telefon Tabanlı Bir Görüntüleme Yöntemi

Özet

Bu makalede, Caenorhabditis elegans'ın çimden kaçınma davranışını, akıllı telefon ve ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu gibi hazır bulunan öğeleri kullanarak kaydetmenin basit, düşük maliyetli bir yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, video dosyasını saymaya daha uygun bir formatta işlemek için bir Python betiği de sağlıyoruz.

Özet

Toksik veya patojenik bakterilere maruz kaldığında, nematod Caenorhabditis elegans , solucanların yavaş yavaş besin kaynaklarını terk ettiği ve bakteriyel çimlerin dışında kalmayı tercih ettiği öğrenilmiş bir çimden kaçınma davranışı sergiler. Tahlil, solucanların zararlı koşullara uygun şekilde yanıt vermek için dış veya iç ipuçlarını algılama yeteneğini test etmenin kolay bir yoludur. Basit bir tahlil olmasına rağmen, özellikle birden fazla numunede sayma zaman alıcıdır ve bir gecede yayılan tahlil süreleri araştırmacılar için elverişsizdir. Uzun bir süre boyunca birçok plakayı görüntüleyebilen bir görüntüleme sistemi kullanışlıdır ancak maliyetlidir. Burada, C. elegans'ta çimlerden kaçınmayı kaydetmek için akıllı telefon tabanlı bir görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Yöntem, iletilen bir ışık kaynağı olarak hizmet etmek için yalnızca bir akıllı telefon ve ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu gerektirir. Boş hızlandırılmış kamera uygulamalarını kullanarak, her telefon çim dışındaki solucanları manuel olarak saymak için yeterli keskinlik ve kontrastla altı plakaya kadar görüntü görüntüleyebilir. Elde edilen filmler, her saatlik zaman noktası için 10 s sesli video ara bırakma (AVI) dosyalarına işlenir, daha sonra saymaya daha uygun hale getirmek için her bir plakayı göstermek üzere kırpılır. Bu yöntem, kaçınma kusurlarını incelemek isteyenler için uygun maliyetli bir yoldur ve potansiyel olarak diğer C. elegans tahlillerine genişletilebilir.

Giriş

C. elegans'ı incelemenin birçok avantajı arasında, basit sinir sistemi, genetik ve hücresel düzeydeki değişikliklerin ağ fonksiyonunu ve davranışsal çıktıyı nasıl etkilediğini inceleme fırsatı sunar. Sınırlı sayıda nörona sahip olmasına rağmen, C. elegans çok çeşitli karmaşık davranışlar sergiler. Bunlardan biri, bakterivor nematodun bakteriyel çimleri terk ederek zararlı bir besin kaynağına tepki verdiği çimlerden kaçınmadır. C. elegans, patojenik bakteri ^1,2,3 çimlerinden, toksin üreten veya^toksinlerle çivilenmiş^{bakteri çimlerinden 1,4} ve hatta hedef gen yıkımı solucanların sağlığına zararlı olan RNAi eksprese eden bakterilerden kaçınır ^4,5. Çalışmalar, solucanların patojenik bakteriler ^1,6 tarafından üretilen metabolitler gibi dış ipuçlarına veya yiyeceğin onları hasta ettiğini gösteren iç ipuçlarına yanıt verdiğini göstermiştir ^4,7. Bu ipuçları, mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu ve dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGFβ) yolu gibi korunmuş sinyal yolları aracılığıyla işlenir ve bağırsak ile sinir sistemi arasında iletişim gerektirir 4,6,7,8.

Tahlil basit olmasına rağmen, öğrenilen davranış genellikle bir gecede saatlerce gelişir. Ayrılamayan mutantlar olsa da, bu durumda sadece bir zaman noktasında kaçınma puanlaması kusuru göstermek için yeterlidir, birçok mutant sonunda ayrılır, ancak ortaya çıkması daha yavaştır. Bunlar için, solucanların hareketinin birkaç saatte bir izlenmesi gerekir, bu da gece boyunca yapılması zor olabilir. Saymanın kendisi de zaman alır, plakalar arasında bir gecikme süresi yaratır ve böylece aynı anda test edilebilecek plaka sayısını sınırlar. Tahlilin tüm süresi boyunca aynı anda birçok plakayı kaydetmek için bir görüntüleme kurulumu kullanmak çok yararlı olacaktır, ancak araştırma laboratuvarının finansman durumuna bağlı olarak kurulum maliyeti engelleyici olabilir.

Bunu ele almak için, kaçınma testlerini kaydetmek için akıllı telefonları kullanan çok basit bir yöntem geliştirdik. Her telefon, altı adede kadar tahlil plakasının hızlandırılmış videolarını kaydedebilir. İletilen ışığı sağlamak için, çevrimiçi olarak kolayca satın alınabilen bir ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu kullanıyoruz. Tahlil plakaları, gelen ışığı odaklayan ve kontrast yaratan içi boş dikdörtgen tünellerle desteklenen yükseltilmiş bir platforma yerleştirilir. Ayrıca, videoları her saatlik zaman noktasının 10 s klibini gösteren sesli video ara bırakma (AVI) dosyalarına dönüştüren bir Python komut dosyası da sağlıyoruz. Videolar daha sonra ayrı ayrı plakalara kırpılır ve manuel sayım için kullanılmak üzere ayrı dosyalara kaydedilir.

Bu yöntem, çoğu insan için hazır olan öğeleri kullanarak, kullanımı da son derece kolay olan düşük maliyetli bir prosedür sağlar. Burada, protokolü daha önce ^2,9 olarak tanımlanan insan patojeni Pseudomonas aeruginosa'ya (PA14) karşı köklü çim önleme testini kullanarak yöntemi açıklıyoruz. Son olarak, görüntüleme yöntemini diğer C. elegans davranış deneylerine uygulamak isteyenler için dikkat edilmesi gereken hususları ve sınırlamaları da gözden geçiriyoruz.

Protokol

1. Görüntüleme cihazının kurulması (Şekil 1A-E)

1. Aşağıdaki minimum gereksinimlere sahip bir akıllı telefon kamerasının mevcut olduğundan emin olun:
   12 megapiksel (MP) kamera
   1080p çözünürlüklü video
   5 GB depolama alanı (20 dakikalık video, 3-4 Gb'dir)
   Uygulama mağazasından hızlandırılmış video uygulaması (ücretsiz uygulamalar mevcuttur)
2. LED ışık kutusunu, tahlilin yapılacağı 25 ° C inkübatörün alt rafına yerleştirin.
3. LED ışık yüzeyindeki noktalı deseni gizlemek için, LED kutusunun tüm yüzeyini kaplayacak şekilde iki doku tabakası yayın.
4. Numune için yükseltilmiş bir aşama yapın (Şekil 1A,D). Yükseltilmiş aşama, içi boş dikdörtgen tünellerle desteklenen şeffaf bir plastik levhadır. Tüneller, ışığı odaklamak için bir kondenser gibi işlev görür ve numuneye daha iyi kontrast sağlar (Şekil 1C). Işık saçılımını en aza indirmek için tünelin duvarlarının biraz karanlık olduğundan emin olun. Bu çalışmada kahverengi kağıt kutular kullanılmıştır. Tünelin boyutu 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm'dir (G x L x Y). LED ışık kutusu beş tünele kadar sığabilir.
5. Telefonları kayıt için yerleştirmek üzere sahne alanının üzerine başka bir raf yerleştirin (Şekil 1B,E). Her telefon üç ila altı plaka (üç plakadan oluşan bir ila iki sıra) kaydeder, bu nedenle raf yüksekliğini buna göre ayarlayın. Bu, numunenin yaklaşık 15 cm üzerinde olacaktır (Şekil 1B).
6. Gece kaydı sırasında telefonları takmak için inkübatörün içine bir elektrik kablosu yerleştirin.

2. Tamponların ve ortamların hazırlanması

1. 1 L damıtılmış_H2O'ya 3 g KH2 PO 4, 6 g Na₂HPO₄ ve 5 g NaCl ekleyerek M9 tamponunu hazırlayın 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayarak sterilize edin. Arabelleği soğutun ve ardından 1 mL'lik 1 M MgSO₄ ekleyin.
2. 108,3 g KH 2 PO 4 ve 35,6 g K 2 HPO 4 ila 1L H₂O ekleyerek 1 M KPO ₄ tamponu hazırlayın. Otoklavlama ile sterilize edin.
3. 1 mL ağartıcı, 0.4 mL 1 M NaOH ve 2.6 mL_H2O karıştırarak solucan ağartma çözeltisi hazırlayın.
4. Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları hazırlayın.
   1. 3 L'lik bir şişeye 3 g NaCl, 2.5 g bacto pepton ve 17 g bacto agar ekleyin. 975 mL damıtılmış su ekleyin ve bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
   2. Otoklavlama ile sterilize edin, ardından 55 ° C'ye soğutun ve 1 mL kolesterol (etanolde 5 mg / mL), 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO 4 ve 25 mL 1 M KPO₄ tampon (pH 6.0) ekleyin. İyice karıştırmak için karıştırın. 6 cm'lik plakalara dökün. Plakaları en az 2 gün kurumaya bırakın.
5. Bir bakteri çimi oluşturmak için OP50 E. coli gece boyunca OP50 kültürünün yaklaşık 1 mL'sini pipetleyerek OP50 E. coli ile NGM agar plakalarını tohumlayın. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında (RT) bekletin.

3. Yüksek peptonlu NGM plakalarının hazırlanması (PA14 için)

NOT: Bu plakalar tahlilden en az 5 gün önce yapılmalıdır.

1. NGM'yi %0.35 pepton içeren yapım. 0.3 g NaCl, 0.35 g bacto pepton ve 1.7 g bacto agar'ı 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde karıştırın. 97,5 mL damıtılmış su ekleyin ve bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
2. Şişenin ağzını alüminyum folyo ve otoklav ile 121 °C'de 20 dakika boyunca örtün.
3. 55 ° C'ye kadar soğutun ve 0,1 mL kolesterol (etanolde 5 mg / mL), 0,1 mL 1 M CaCl 2, 0,1 mL 1 M MgSO 4 ve_2,5 mL 1 M KPO₄ tampon (pH 6,0) ekleyin. İyice karıştırmak için karıştırın.
4. Yüksek pepton NGM'yi 35 mm Petri kaplarına dökün.
5. Plakaları en az 2 gün kurutun.

4. Solucanları ağartma ile senkronize etme

NOT: Bu adımı tahlilden 3 gün önce başlatın.

1. Gravid yetişkin solucanları olan plakaları alın ve plakaları M9 tamponu ile yıkayarak 1.7 mL'lik bir mikrotüp halinde toplayın.
2. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın, ardından 400 μL ağartma çözeltisi ekleyin. Aralıklı vorteks ile yaklaşık 4-5 dakika bekleyin, yetişkin solucan gövdeleri kırılana ve yumurtaları serbest bırakana kadar.
3. Ağartma çözeltisini seyreltmek için mikrotüpün geri kalanını doldurmak için M9 tamponu ekleyin. 1-2 s boyunca maksimum hızda (12.000 ila 13.000 x g) döndürün. Süpernatantı çıkarın ve M9 tamponu ile üç kez daha yıkayın.
4. Yumurtaları M9 tamponu içeren boş bir 35 mm Petri kabına aktarın. Yumurtaların gece boyunca 20 ° C'de yumurtadan çıkmasına izin verin. Yiyecek yokluğunda, yumurtadan çıkan solucanlar L1 larva aşamasında durur ve tüm solucanların gelişim aşamasını senkronize eder.
   NOT: 35 mm'lik Petri kabının jelatin çözeltisi (otoklavlanmış suda% 0.05 jelatin) ile kaplanması, yumurtaların tabana yapışmasını önleyebilir ve yumurta kaybını en aza indirebilir.
5. Ertesi gün, L1 aşama solucanlarını OP50 tohumlu NGM plakalarına aktarın.
6. Solucanlar L4 larva aşamasına ulaşana kadar solucanları 20 ° C'de 53-54 saat boyunca inkübe edin.

5. Bakterilerin hazırlanması ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)

NOT: Bu adımı tahlilden 4 gün önce başlatın.

1. Luria Bertani (LB) agar plakasında -80 ° C'den çözülmüş bakterileri herhangi bir antibiyotik olmadan çizin ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
   NOT: Her zaman taze bakteri kullanın. Çizgili plakalar 4 °C'de en fazla 1 hafta saklanmalıdır.
2. Tek bir koloniyi 3 mL King's et suyuna aşılayın ve 37 ° C'lik bir sallama inkübatöründe gece boyunca büyütün.
3. Ertesi gün, gece kültürünün 7 μL'sini yüksek peptonlu NGM plakalarına tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Tohumlanmış plakaları RT'ye taşıyın ve kullanmadan önce 24 saat daha inkübe edin. Hazır olduktan sonra, plakayı sonraki 24 saat içinde kullanın.

6. Kayda hazırlanma

NOT: Bunu tahlilden hemen önce yapın.

1. Akıllı telefonu, elektrik prizine bağlı elektrik prizine takın. Kayıt sırasında telefonun kilit ekranına dönmesini önlemek için otomatik kilitleme ayarını devre dışı bıraktığınızdan emin olun.
2. Hızlandırılmış kamera uygulamasını açın ve hızlandırılmış çekim aralığını 2 s olarak ayarlayın. Video kalitesini 30 fps'de 1080p'ye ayarlayın.
3. Akıllı telefonu, arkaya bakan kamerayla kayıt yapmak için ekranı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Kağıt kutusu tünellerinin görüş alanına sığdığından emin olmak için ekranı kontrol edin.

7. Çim kaçınma testi

1. Platin tel çekme kullanarak, 30 senkronize L4 aşamalı solucanı (L1'den 53-54 saat) PA14 plakasına aktarın. Solucanları bakteri çimlerinin ortasına yerleştirin. Bu çalışmadaki her koşul için iki plaka test edildi (yani, koşul başına 60 solucan).
2. İki plakayı, kapağı aşağı bakacak şekilde kayıt cihazının yükseltilmiş aşamasına yerleştirin. Agarın bulunduğu taraf kameraya doğru bakacaktır.
3. Akıllı telefon ekranında, plakanın bulunduğu yere dokunun, böylece kamera tahlil plakalarına odaklanabilir. Kamera doğru odaklamak için kullanabileceği için plakaya bir etiket veya yazı yazılmasına yardımcı olur.
   NOT: Plakaların altına yazmak, kenara doğru olduğu sürece solucanların görüntülenmesini engellemez. Neyse ki, solucanlar ayrıldıktan sonra bile çimlerin yakınında kalırlar, bu nedenle sadece çimleri çevreleyen yakın alanın engelsiz bir görünümüne ihtiyaç vardır.
4. Kaydı başlatın.
5. Kayıt başladıktan sonra sahne alanına daha fazla plaka ekleyin. Solucanların toplayarak aktarılması için gereken süre nedeniyle plakalar arasında önemli bir gecikme süresi olabilir. Daha sonra gecikme süresini not edin, böylece her koşul başladığı anda sayılabilir.
6. Sahneye yerleştirilen son plaka setinden 20 saat boyunca kayıt. Son hızlandırılmış videoda, 20 saatlik kayıt, 20 dakika uzunluğunda bir videoyla sonuçlanır.
   NOT: Solucanları tahlilden sonra doğrudan plakalardan saymak, en azından ilk birkaç kez başlangıçta faydalı olabilir. Bu, benzer sayılar vermelerini sağlamak için video görüntüleme yoluyla elde edilen değerlerle karşılaştırılabilir.

8. Python betiği kullanarak videonun işlenmesi

1. Film dosyasını işlenmek üzere bir bilgisayara aktarın. Uzantı bir MOV (iPhone) veya MP4 dosyası (Android) olacaktır.
2. Videoları işlemek için bir Python kodu kullanın. Kod github.com/khyoon201/wormavoid bulunabilir.
3. Python betiklerini çalıştırmak için, aşağıdakilerin bilgisayara önceden yüklendiğinden emin olun: ffmpeg, video dosyalarını dönüştürmek için bir araç (kurulum talimatları web sitesinde bulunabilir, ffmpeg.org/download) ve Python paketleri os, pandas, tkinter ve ffmpeg-python.
4. extract_frame.py komut dosyasını kullanarak her plakanın boyutlarını ve koordinatlarını bulun.
   1. extract_frame.py komut dosyasını çalıştırın. Bilgisayarda depolanan video dosyasını seçmek için bir pencere açılacaktır. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, aynı dizinde aynı ada sahip bir jpeg dosyası görünecektir.
   2. jpeg dosyasını ImageJ (imagej.org) içinde açın.
   3. Menüden Ölçümleri Analiz Et > Ayarla'yı seçin. Görüntü Etiketi kutusunun işaretli olduğundan emin olun (Şekil 2A). Pencereyi kapatın.
   4. Düz Çizgi aracını kullanarak, üzerine bir çizgi çizerek plakanın çapını ölçün, ardından menüden Analiz > Ölçüle'yi seçin. Video 1080p çözünürlükteyse, her plaka yaklaşık 480 piksel genişliğinde olacaktır. Bu bilgileri bir yere yazın ve Sonuçlar penceresini kapatın.
   5. Çok noktalı aracı kullanarak, her plakanın sol üst tarafındaki noktaları işaretleyin. Bu noktalar, kırpılan videoların sol üst köşesi olacaktır (Şekil 2B). Düzen önemlidir; plakaların ne zaman başlatıldığına göre işaretleyin. Tüm plakalar için bir nokta oluşturduktan sonra, menüden Analiz > Ölç'ü seçin. Noktaların X ve Y koordinatları da dahil olmak üzere ölçümler Sonuçlar penceresinde görünür.
   6. Birden fazla videoyu işlemek için, işlemi ImageJ'de diğer jpeg dosyalarıyla tekrarlayın. Tüm X ve Y koordinatları aynı Sonuçlar penceresinde listelenir.
   7. Sonuçlar penceresini bir csv dosyasına kaydedin. Dosya, film dosyalarıyla aynı dizine kaydedilmelidir.
5. Her plaka için başlangıç saatini bulun.
   1. Filmi bilgisayarda veya telefonda oynatın ve kameranın altına yerleştirilen her plaka setinin başlangıç saatlerini not edin.
   2. Koordinatları içeren Sonuçlar.csv dosyasını açın ve bir "başlangıç" sütunu ekleyin. Tek tek plakalara karşılık gelen her satır için, "başlangıç" sütununun altına saniye cinsinden uygun başlangıç zamanını girin (örneğin, başlangıç saati 0:00:08 ise, 8 girin). Kurtarmak.
      NOT: Kırpma ve kırpma için bir sonraki komut dosyası tarafından tanınmak üzere sütun adının "start" (küçük harfle, tırnak işaretleri olmadan) olması gerekir.
6. Videoları kırpın ve kırpın.
   1. crop_n_trim.py komut dosyasını çalıştırın.
   2. İstendiğinde, Sonuçlar.csv dosyasını seçin.
      NOT: Sonuçlar.csv dosyasının ve tüm film dosyalarının aynı dizinde olduğundan emin olun.
   3. Plaka boyutlarını girin. Daha önce not edilen piksel değerini girin.
      NOT: Komut dosyası artık "etiket" sütunundaki dosya adını okuyarak doğru film dosyasını bulmak için Sonuçlar.csv dosyasının her satırını okuyacak ve "X" ve "Y" sütunlarında belirtilen koordinatlara göre kırpacaktır. Her plakanın başlangıç zamanı, "başlangıç" sütununda belirtilen zamana göre belirlenecektir. Komut dosyası çalışmayı bitirdikten sonra, filmle aynı ada sahip bir klasör görünecek ve ardından testin her saatlik zaman noktasına karşılık gelen 10 saniyelik videoların kaydedileceği başlangıç zamanı (örneğin, "Movie1_8") gelecektir.

9. ImageJ kullanarak manuel sayma

1. Her AVI dosyasını ImageJ'de açın.
2. Çimlerin dışında görülebilen solucanları sayın. Bir çerçevede üst üste binen solucanlar genellikle başka bir çerçevede birbirinden ayrılır, böylece doğru şekilde sayılabilirler.
3. Her zaman noktası için doluluk oranını hesaplayın:
   Doluluk oranı = (toplam solucanlar - çim dışındaki solucanların sayısı)/toplam solucanlar
   NOT: Solucanlar video sırasında çimlerin içine ve dışına doğru hareket eder, ancak bu sonuçları önemli ölçüde değiştirmez. Ortalama gibi görünen sayıyla veya tam saatlik zaman noktasındaki solucan sayısıyla (videoya 5 sn) gitmeye çalışın.

Sonuçlar

Senaryo tarafından üretilen ilk video, tahlilin başlangıcından itibaren 1 saattir. Solucanlar tahlili çim içinde başlattığından 0 saat boyunca video kaydedilmez, bu nedenle doluluk oranı her zaman% 100'dür.

Vahşi tip N2 solucanları, çimden kaçınma kusuru literatürde iyi bilinen npr-1 mutantları ile karşılaştırılmıştır ^6,10 (Şekil 3A-E)...

Tartışmalar

Doğrudan gözleme dayanmak yerine hayvan davranışlarını görüntülemek, sadece uygun değil, aynı zamanda görsel dokümantasyon bırakma avantajına da sahiptir. Bu, objektif bir üçüncü kişi tarafından kör analize izin verir veya görüntü tanıma tekniklerini kullanarak otomatik analiz için bile kullanılabilir. Avantajlara rağmen, genellikle sunulan standart ekipmanın maliyeti yüksektir, bu nedenle satın alındıktan sonra kuruluma bağlı kalınır.

Basit C. elegans...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727