שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

Summary

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וזולה לתיעוד התנהגות הימנעות מדשאה של Caenorhabditis elegans, באמצעות פריטים זמינים כגון טלפון חכם וקופסת אור פולטת אור (LED). אנו מספקים גם סקריפט Python לעיבוד קובץ הווידאו לפורמט נוח יותר לספירה.

Abstract

כאשר היא נחשפת לחיידקים רעילים או פתוגניים, הנמטודה Caenorhabditis elegans מפגינה התנהגות נלמדת של הימנעות מדשאה, שבה התולעים עוזבות בהדרגה את מקור המזון שלהן ומעדיפות להישאר מחוץ למדשאת החיידקים. הבדיקה היא דרך קלה לבחון את יכולתן של התולעים לחוש רמזים חיצוניים או פנימיים כדי להגיב כראוי לתנאים מזיקים. למרות שמדובר בבדיקה פשוטה, הספירה גוזלת זמן, במיוחד עם דגימות מרובות, ומשכי הבדיקה הנמשכים לילה אינם נוחים לחוקרים. מערכת הדמיה שיכולה לצלם לוחות רבים לאורך תקופה ארוכה היא שימושית אך יקרה. כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לתיעוד הימנעות מדשאה ב- C. elegans. השיטה דורשת רק טלפון חכם וקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED), שישמשו כמקור אור משודר. באמצעות יישומי מצלמה ללא קיטועי זמן, כל טלפון יכול לצלם עד שש לוחות, עם חדות וניגודיות מספיקות כדי לספור תולעים באופן ידני מחוץ לדשא. הסרטים המתקבלים מעובדים לקבצי 10 s audio video interleave (AVI) עבור כל נקודת זמן של שעה, ולאחר מכן נחתכים כדי להציג כל צלחת בודדת כדי להפוך אותם לנוחים יותר לספירה. שיטה זו היא דרך חסכונית עבור אלה המעוניינים לבחון פגמים הימנעות וניתן להרחיב אותה לבדיקות C. elegans אחרות.

Introduction

בין היתרונות הרבים של חקר C. elegans, מערכת העצבים הפשוטה שלה מציעה הזדמנות לחקור כיצד שינויים ברמה הגנטית והתאית משפיעים על תפקוד הרשת ועל התפוקה ההתנהגותית. למרות שיש להם מספר מוגבל של נוירונים, C. elegans מציגים מגוון רחב של התנהגויות מורכבות. אחד מהם הוא הימנעות מדשאה, שבה הנמטודה החיידקית מגיבה למקור מזון מזיק על ידי עזיבת הדשא החיידקי. C. elegans נמנעים ממדשאות של חיידקים פתוגניים ^1,2,3, מדשאות של חיידקים המייצרים רעלים או מתובלים ברעלים^1,4, ואפילו חיידקים מבטאי RNAi שהשמדת גן המטרה שלהם מזיקה לבריאות התולעים ^4,5. מחקרים הראו כי תולעים מגיבות לרמזים חיצוניים כגון מטבוליטים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ^1,6, או רמזים פנימיים המצביעים על כך שהמזון גורם להם לחלות ^4,7. רמזים אלה מעובדים באמצעות מסלולי איתות שמורים, כגון מסלול חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) ומסלול בטא גורם גדילה משתנה (TGFβ), ודורשים תקשורת בין המעי למערכת העצבים 4,6,7,8.

למרות שהבדיקה פשוטה, ההתנהגות הנלמדת מתפתחת במשך שעות רבות, לעתים קרובות בן לילה. בעוד שישנם מוטנטים שאינם מסוגלים לעזוב, ובמקרה זה די בניקוד הימנעות בנקודת זמן אחת בלבד כדי להדגים את הפגם, מוטנטים רבים אכן עוזבים בסופו של דבר אך הם איטיים יותר לצאת. עבור אלה, התנועה של התולעים צריך להיות מעקב כל כמה שעות, אשר יכול להיות קשה לעשות בן לילה. גם הספירה עצמה לוקחת זמן, מה שיוצר זמן השהיה בין הלוחות, ובכך מגביל את מספר הצלחות שניתן לבדוק בו זמנית. שימוש במערך הדמיה כדי להקליט לוחות רבים בו זמנית למשך כל תקופת הבדיקה יהיה שימושי מאוד, אך עלות ההתקנה יכולה להיות אסורה, בהתאם למצב המימון של מעבדת המחקר.

כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה פשוטה מאוד המשתמשת בסמארטפונים כדי להקליט מבחני הימנעות. כל טלפון יכול להקליט סרטוני קיטועי זמן של עד שש לוחיות בדיקה. כדי לספק אור משודר, אנו משתמשים בקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED) שניתן לרכוש בקלות באינטרנט. לוחות Assay ממוקמים על פלטפורמה מוגבהת, הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות, הממקדות את האור הנכנס ויוצרות ניגודיות. אנו מספקים גם סקריפט Python הממיר את הסרטונים לקבצי Audio Video interleave (AVI) המציגים קליפים של 10 שניות של כל נקודת זמן לשעה. לאחר מכן הסרטונים נחתכים ללוחות נפרדים ונשמרים בקבצים נפרדים לשימוש לספירה ידנית.

השיטה מספקת הליך בעלות נמוכה כי הוא גם קל מאוד לשימוש, באמצעות פריטים זמינים עבור רוב האנשים. כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות בדיקת הימנעות דשא מבוססת היטב נגד הפתוגן האנושי Pseudomonas aeruginosa (PA14), שהפרוטוקול שלו תואר בעבר ^2,9. לבסוף, אנו סוקרים גם את השיקולים והמגבלות של שיטת ההדמיה עבור אלה שרוצים ליישם אותה בניסויי התנהגות אחרים של C. elegans.

Protocol

1. הגדרת מכשיר הדימות (איור 1A-E)

1. ודא שמצלמת טלפון חכם עם דרישות המינימום הבאות זמינה:
   12 מגה פיקסל (MP) מצלמה
   וידאו ברזולוציית 1080p
   שטח אחסון של 5 GB (וידאו של 20 דקות הוא 3-4 Gb)
   אפליקציית וידאו עם קיטועי זמן מחנות האפליקציות (אפליקציות זמינות בחינם)
2. מקם את תיבת תאורת ה- LED על המדף התחתון של האינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס שבו תתבצע הבדיקה.
3. כדי להסתיר את התבנית המנוקדת על משטח תאורת ה-LED, פרשו שתי יריעות של רקמות כדי לכסות את כל פני השטח של קופסת ה-LED.
4. צרו שלב מוגבה עבור הדגימה (איור 1A,D). השלב המוגבה הוא יריעת פלסטיק שקופה הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות. מנהרות מתפקדות כמו מעבה כדי למקד אור, ומספקות ניגודיות טובה יותר לדגימה (איור 1C). ודאו שדפנות המנהרה חשוכות במקצת כדי למזער את פיזור האור. במחקר זה נעשה שימוש בקופסאות נייר חומות. מידות המנהרה 5.5 ס"מ x 17 ס"מ x 4.5 ס"מ (רוחב x אורך x גובה). תיבת תאורת הלד יכולה להכיל עד חמש מנהרות.
5. מקם מדף נוסף מעל הבמה כדי למקם את הטלפונים להקלטה (איור 1B,E). כל טלפון יקליט שלוש עד שש צלחות (שורה אחת עד שתיים של שלוש צלחות), לכן התאם את גובה ארון התקשורת בהתאם. זה יהיה בערך 15 ס"מ מעל הדגימה (איור 1B).
6. שים מפצל חשמל בתוך האינקובטור כדי לחבר את הטלפונים במהלך הקלטת הלילה.

2. הכנת מאגרים ומדיה

1. הכינו את מאגר M9 על ידי הוספת 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של Na 2 HPO₄ ו-5 גרם של NaCl ל-1 ליטר של H₂O מזוקק. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ב-121°C למשך 20 דקות. מצננים את המאגר ולאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל של 1 M MgSO₄.
2. הכן מאגר KPO 4 של 1 M על ידי הוספת 108.3 גרם של KH 2 PO 4 ו- 35.6 גרם של K 2 HPO₄ עד 1 L של H ₂O. התאם את ה- pH ל- 6.0 על ידי הוספת KOH. לעקר על ידי autoclaving.
3. הכינו תמיסת הלבנת תולעים על ידי ערבוב 1 מ"ל אקונומיקה, 0.4 מ"ל של 1 מ"ל NaOH ו-2.6 מ"ל של H₂O.
4. הכינו צלחות אגר של מדיה לגידול נמטודות (NGM).
   1. הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של פפטון bacto, ו 17 גרם של אגר bacto בבקבוק 3 L. מוסיפים 975 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.
   2. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג, ואז לקרר ל-55°C ולהוסיף 1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 1 מ"ל של 1 M CaCl₂, 1 מ"ל של 1 M MgSO 4 ו-25 מ"ל של 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב. יוצקים לצלחות בקוטר 6 ס"מ. תנו לצלחות להתייבש לפחות יומיים.
5. זרע צלחות אגר NGM עם OP50 E. coli על ידי pipeting כ 1 מ"ל של תרבית לילה של OP50 כדי ליצור דשא של חיידקים. יש להשאיר בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש מוכן.

3. הכנת לוחות NGM עתירי פפטון (עבור PA14)

הערה: לוחות אלה צריכים להיעשות לפחות 5 ימים לפני הבדיקה.

1. מייצרים גז טבעי טבעי המכיל 0.35% פפטון. מערבבים 0.3 גרם של NaCl, 0.35 גרם של בקטו פפטון, ו 1.7 גרם של אגר bacto בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל. מוסיפים 97.5 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.
2. מכסים את הפה של בקבוק עם רדיד אלומיניום autoclave ב 121 ° C במשך 20 דקות.
3. יש לקרר עד 55°C ולהוסיף 0.1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 0.1 מ"ל של 1 M CaCl 2, 0.1 מ"ל של 1 M MgSO 4,_ו-2.5 מ"ל של 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב.
4. מוזגים גז טבעי עתיר פפטון לצלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ.
5. יבש את הצלחות לפחות 2 ימים.

4. סנכרון תולעים על ידי הלבנה

הערה: התחל שלב זה 3 ימים לפני הבדיקה.

1. קח צלחות עם תולעים בוגרות gravid ולאסוף אותם לתוך microtube 1.7 מ"ל על ידי שטיפת הצלחות עם חיץ M9.
2. מוציאים כמה שיותר נוזלים, ואז מוסיפים 400 מיקרוליטר של תמיסת הלבנה. ממתינים כ-4-5 דקות עם מערבולות לסירוגין, עד שגופי התולעים הבוגרות נשברים ומשחררים את הביצים.
3. הוסף חיץ M9 כדי למלא את שאר המיקרו-צינורית כדי לדלל את תמיסת ההלבנה. סחרור במהירות מרבית (12,000 עד 13,000 x גרם) למשך 1-2 שניות. הסירו את הסופרנאטנט ושטפו שלוש פעמים נוספות עם חיץ M9.
4. מעבירים את הביצים לצלחת פטרי ריקה בקוטר 35 מ"מ המכילה חיץ M9. תן את הביצים לבקוע לילה ב 20 °C (75 °F). בהיעדר מזון, התולעים שבקעו יעצרו בשלב הזחל L1, ויסנכרנו את השלב ההתפתחותי של כל התולעים.
   הערה: ציפוי צלחת פטרי 35 מ"מ בתמיסת ג'לטין (0.05% ג'לטין במים אוטוקלאביים) יכול למנוע מהביצים להידבק לתחתית ולמזער את אובדן הביצים.
5. למחרת, העבירו תולעים בשלב L1 לצלחות NGM עם זרעי OP50.
6. דוגרים על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 53-54 שעות עד שהתולעים מגיעות לשלב הזחל L4.

5. הכנת חיידקים (Pseudomonas aeruginosa, PA14)

הערה: התחל שלב זה 4 ימים לפני הבדיקה.

1. פסים חיידקים מופשרים מ -80 ° C על צלחת אגר לוריא ברטאני (LB) ללא כל אנטיביוטיקה לדגור לילה ב 37 ° C.
   הערה: יש להשתמש תמיד בחיידקים טריים. צלחות פסים יש לאחסן ב 4 ° C במשך לא יותר מ 1 שבוע.
2. לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק המלך ולגדל לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
3. למחרת, זרעו 7 מיקרוליטר של תרבית הלילה על צלחות NGM עתירות פפטון ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 24 שעות.
4. העבירו את צלחות הזרעים ל-RT ודגרו עוד 24 שעות לפני השימוש. ברגע שאתה מוכן, השתמש בצלחת תוך 24 שעות.

6. הכנה להקלטה

הערה: בצע פעולה זו ממש לפני הבדיקה.

1. חבר את הטלפון החכם למפצל החשמל המחובר לשקע חשמל. הקפד להשבית את הגדרת הנעילה האוטומטית כדי למנוע מהטלפון לחזור למסך הנעילה בזמן ההקלטה.
2. פתח את אפליקציית המצלמה עם קיטועי הזמן והגדר את מרווח הזמן של קיטועי הזמן ל- 2 שניות. הגדר את איכות הווידאו ל- 1080p ב- 30 fps.
3. מקם את הטלפון החכם כשהמסך פונה כלפי מעלה כדי להקליט באמצעות המצלמה הפונה לאחור. בדוק את המסך כדי לוודא שתעלות קופסת הנייר מתאימות לשדה הראייה.

7. בדיקת הימנעות מדשאה

1. באמצעות פיק חוטי פלטינה, מעבירים 30 תולעי שלב L4 מסונכרנות (53-54 שעות מ-L1) לצלחת PA14. הניחו את התולעים במרכז מדשאת החיידקים. עבור כל מצב במחקר זה, נבדקו שתי לוחיות (כלומר, 60 תולעים לכל מצב).
2. הניחו את שתי הצלחות על השלב המוגבה של מכשיר ההקלטה כשהמכסה פונה כלפי מטה. הצד עם האגר יפנה כלפי מעלה לכיוון המצלמה.
3. במסך הטלפון החכם, הקש במקום שבו נמצאת הצלחת, כך שהמצלמה תוכל להתמקד בלוחות הבדיקה. זה עוזר שיש תווית או כיתוב על הצלחת כמו המצלמה יכולה להשתמש בזה כדי להתמקד כראוי.
   הערה: כתיבה בתחתית הלוחות אינה מפריעה להדמיה של תולעים כל עוד היא בכיוון הקצה. למרבה המזל, תולעים נשארות ליד המדשאה גם לאחר שהן עוזבות, כך שיש צורך בתצפית ללא הפרעה רק על האזור המיידי המקיף את המדשאה.
4. התחל את ההקלטה.
5. לאחר תחילת ההקלטה, הוסף צלחות נוספות לבמה. ייתכן שיש זמן פיגור משמעותי בין הצלחות בגלל הזמן שלוקח להעביר תולעים על ידי קטיף. שים לב לזמן ההשהיה לאחר מכן, כך שניתן יהיה לספור כל תנאי בזמן שהוא התחיל.
6. הקלט במשך 20 שעות מהסט האחרון של צלחות שהונחו על הבמה. בסרטון האחרון בהילוך מהיר, 20 שעות של הקלטה יובילו לסרטון באורך 20 דקות.
   הערה: ייתכן שכדאי לספור את התולעים ישירות מהלוחות לאחר הבדיקה, לפחות בהתחלה בהזדמנויות הראשונות. ניתן להשוות זאת לערכים המתקבלים באמצעות הדמיית וידאו כדי להבטיח שהם מניבים מספרים דומים.

8. עיבוד וידאו באמצעות סקריפט Python

1. העבר את קובץ הסרט למחשב לצורך עיבוד. התוסף יהיה קובץ MOV (iPhone) או MP4 (Android).
2. השתמש בקוד Python כדי לעבד את הסרטונים. ניתן למצוא את הקוד בכתובת github.com/khyoon201/wormavoid.
3. כדי להפעיל את הסקריפטים של Python, ודא שהפריטים הבאים מותקנים מראש במחשב: ffmpeg, כלי להמרת קבצי וידאו (הוראות להתקנה ניתן למצוא באתר האינטרנט שלו, ffmpeg.org/download), ואת חבילות Python os, pandas, tkinter ו- ffmpeg-python.
4. מצא את המידות והקואורדינטות של כל לוח באמצעות סקריפט extract_frame.py .
   1. הפעל את קובץ ה- Script של extract_frame.py . יופיע חלון לבחירת קובץ הווידאו המאוחסן במחשב. לאחר השלמת ההפעלה, קובץ jpeg עם אותו שם יופיע באותה ספרייה.
   2. פתח את קובץ ה- jpeg ב- ImageJ (imagej.org).
   3. מהתפריט, בחרו ' נתח' >'קבע מדידות'. ודא שהתיבה תווית תצוגה מסומנת (איור 2A). סגור את החלון.
   4. בעזרת הכלי קו ישר , מדדו את קוטר הלוח באמצעות ציור קו לרוחבו, ולאחר מכן בחרו באפשרות 'נתח > מדידה' מהתפריט. אם הסרטון הוא ברזולוציה של 1080p, רוחבו של כל לוח יהיה כ-480 פיקסלים. רשום מידע זה וסגור את החלון תוצאות .
   5. בעזרת הכלי ריבוי נקודות, סמנו נקודות בצד שמאל העליון של כל לוח. הנקודות האלה יהפכו לפינה השמאלית העליונה של הסרטונים החתוכים (איור 2B). הסדר חשוב; סמן לפי סדר התחלת הצלחות. לאחר יצירת נקודה לכל הלוחות, בחרו ' נתח > מדידה' מהתפריט. מדידות, כולל קואורדינטות X ו- Y של הנקודות, יופיעו בחלון תוצאות.
   6. כדי לעבד סרטונים מרובים, חזור על התהליך ב- ImageJ עם קובצי jpeg אחרים. כל הקואורדינטות X ו- Y יופיעו באותו חלון תוצאות .
   7. שמור את החלון תוצאות בקובץ csv. יש לשמור את הקובץ באותה ספרייה כמו קובצי הסרט.
5. מצא את זמן ההתחלה עבור כל צלחת.
   1. הפעל את הסרט, במחשב או בטלפון, ושים לב לזמני ההתחלה של כל סט צלחות המונחות מתחת למצלמה.
   2. פתח את הקובץ תוצאות.csv עם הקואורדינטות והוסף עמודת "התחל". עבור כל שורה המתאימה ללוחות בודדים, הזן את שעת ההתחלה המתאימה, תוך שניות, תחת העמודה "התחל" (לדוגמה, אם שעת ההתחלה היא 0:00:08, הזן 8). שמר.
      הערה: שם העמודה חייב להיות "התחל" (באותיות קטנות, ללא מרכאות) כדי להיות מזוהה על-ידי הסקריפט הבא עבור חיתוך וחיתוך.
6. חתוך וחתוך את הסרטונים.
   1. הפעל את קובץ ה- Script של crop_n_trim.py .
   2. כשתתבקש, בחר את הקובץ תוצאות.csv .
      הערה: ודא שהקובץ תוצאות.csv וכל קבצי הסרט נמצאים באותה ספרייה.
   3. הזן את מידות הצלחת. הזן את ערך הפיקסל שצוין קודם לכן.
      הערה: הסקריפט יקרא כעת כל שורה בקובץ Results.csv כדי למצוא את קובץ הסרט הנכון על-ידי קריאת שם הקובץ בעמודה "label", ויחתוך בהתאם לקואורדינטות המצוינות בעמודות "X" ו- "Y". זמן ההתחלה של כל צלחת ייקבע לפי הזמן המצוין בעמודה "התחלה". לאחר שהתסריט יסיים לפעול, תופיע תיקייה עם אותו שם כמו הסרט, ואחריה שעת ההתחלה (למשל, "Movie1_8"), שבה יישמרו סרטונים של 10 שניות המתאימים לכל נקודת זמן של שעה בבדיקה.

9. ספירה ידנית באמצעות ImageJ

1. פתח כל קובץ AVI ב- ImageJ.
2. ספרו את התולעים שנראות מחוץ לדשא. תולעים החופפות במסגרת אחת בדרך כלל מתרחקות זו מזו במסגרת אחרת כדי שניתן יהיה לספור אותן כראוי.
3. חישוב שיעור התפוסה עבור כל נקודת זמן:
   שיעור תפוסה = (סה"כ תולעים - מספר התולעים מחוץ לדשא)/סה"כ תולעים
   הערה: התולעים ינועו פנימה והחוצה מהדשא במהלך הסרטון, אך הדבר לא ישנה באופן משמעותי את התוצאות. נסו ללכת עם המספר שנראה כמו הממוצע, או מספר התולעים בנקודת הזמן השעתית המדויקת (5 שניות לתוך הסרטון).

תוצאות

הסרטון הראשון שהופק על ידי התסריט הוא 1 שעה מתחילת הבדיקה. הווידאו במשך 0 שעות אינו נשמר, כמו תולעים להתחיל את הבדיקה בתוך הדשא, ולכן שיעור התפוסה הוא תמיד 100%.

תולעי N2 מסוג פרא מושוות למוטנטים מסוג npr-1, שפגם בהימנעות מדשאה שלהם מבוסס היטב בספרות

Discussion

הדמיה של התנהגות בעלי חיים, במקום להסתמך על תצפית ישירה, היא לא רק נוחה אלא גם בעלת יתרון של השארת תיעוד חזותי. זה מאפשר ניתוח עיוור על ידי אדם שלישי אובייקטיבי, או אפילו יכול לשמש לניתוח אוטומטי באמצעות טכניקות זיהוי תמונה. למרות היתרונות, הציוד הסטנדרטי המוצע בדרך כלל הוא בעלות גבוהה, ולכן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727