Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo semplice e a basso costo per registrare il comportamento di evitamento del prato di Caenorhabditis elegans, utilizzando elementi prontamente disponibili come uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED). Forniamo anche uno script Python per elaborare il file video in un formato più adatto al conteggio.

Abstract

Quando esposto a batteri tossici o patogeni, il nematode Caenorhabditis elegans mostra un comportamento appreso di evitare il prato, in cui i vermi lasciano gradualmente la loro fonte di cibo e preferiscono rimanere fuori dal prato batterico. Il test è un modo semplice per testare la capacità dei vermi di percepire segnali esterni o interni per rispondere correttamente a condizioni dannose. Sebbene si tratti di un test semplice, il conteggio richiede molto tempo, in particolare con campioni multipli, e le durate dei test che si estendono durante la notte sono scomode per i ricercatori. Un sistema di imaging in grado di visualizzare molte lastre per un lungo periodo è utile ma costoso. Qui, descriviamo un metodo di imaging basato su smartphone per registrare l'evitamento del prato in C. elegans. Il metodo richiede solo uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED), per fungere da sorgente luminosa trasmessa. Utilizzando applicazioni fotografiche time-lapse gratuite, ogni telefono può visualizzare fino a sei lastre, con nitidezza e contrasto sufficienti per contare manualmente i vermi al di fuori del prato. I filmati risultanti vengono elaborati in file AVI (Audio Video Interleave) di 10 s per ogni punto temporale orario, quindi ritagliati per mostrare ogni singola lastra per renderli più suscettibili di conteggio. Questo metodo è un modo economico per coloro che cercano di esaminare i difetti di evitamento e può potenzialmente essere esteso ad altri saggi di C. elegans.

Introduzione

Tra i molti vantaggi dello studio di C. elegans, il suo semplice sistema nervoso offre l'opportunità di studiare come i cambiamenti a livello genetico e cellulare influenzano la funzione della rete e la produzione comportamentale. Nonostante abbia un numero limitato di neuroni, C. elegans mostra una vasta gamma di comportamenti complessi. Uno di questi è l'evitamento del prato, in cui il nematode batterivoro risponde a una fonte di cibo dannosa lasciando il prato batterico. C. elegans evita prati di batteri patogeni ^1,2,3, prati di batteri che producono tossine o sono arricchiti con tossine^1,4 e persino batteri che esprimono RNAi il cui knockdown del gene bersaglio è dannoso per la salute dei vermi ^4,5. Gli studi hanno dimostrato che i vermi rispondono a segnali esterni come i metaboliti prodotti dai batteri patogeni^1,6, o segnali interni che indicano che il cibo li sta facendo ammalare ^4,7. Questi segnali vengono elaborati attraverso vie di segnalazione conservate, come la via della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) e la via del fattore di crescita trasformante beta (TGFβ) e richiedono la comunicazione tra l'intestino e il sistema nervoso 4,6,7,8.

Sebbene il test sia semplice, il comportamento appreso si sviluppa nel corso di molte ore, spesso durante la notte. Mentre ci sono mutanti che non sono in grado di andarsene, nel qual caso l'evitamento del punteggio in un solo punto temporale è sufficiente per dimostrare il difetto, molti mutanti alla fine se ne vanno, ma sono più lenti a uscire. Per questi, il movimento dei vermi deve essere monitorato ogni poche ore, il che può essere difficile da fare durante la notte. Anche il conteggio richiede tempo, creando un tempo di ritardo tra le piastre, e quindi limita il numero di piastre che possono essere testate contemporaneamente. L'utilizzo di una configurazione di imaging per registrare molte lastre contemporaneamente per l'intera durata del test sarebbe molto utile, ma il costo della configurazione può essere proibitivo, a seconda della situazione di finanziamento del laboratorio di ricerca.

Per risolvere questo problema, abbiamo ideato un metodo molto semplice che utilizza gli smartphone per registrare i test di evitamento. Ogni telefono può registrare video time-lapse di un massimo di sei lastre di analisi. Per fornire luce trasmessa, utilizziamo una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED) che può essere facilmente acquistata online. Le lastre di analisi sono posizionate su una piattaforma sopraelevata, sostenuta da tunnel rettangolari cavi, che focalizzano la luce in entrata, creando contrasto. Forniamo anche uno script Python che converte i video in file AVI (Audio Video Interleave) che mostrano clip di 10 s di ogni punto orario orario. I video vengono quindi ritagliati su singole lastre e salvati in file separati da utilizzare per il conteggio manuale.

Il metodo fornisce una procedura a basso costo che è anche estremamente facile da usare, utilizzando articoli che sono prontamente disponibili per la maggior parte delle persone. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il ben noto saggio di prevenzione del prato contro il patogeno umano Pseudomonas aeruginosa (PA14), il cui protocollo è stato precedentemente descritto ^2,9. Infine, esaminiamo anche le considerazioni e i limiti del metodo di imaging per coloro che vogliono applicarlo ad altri esperimenti comportamentali di C. elegans.

Protocollo

1. Configurazione dell'apparato di imaging (Figura 1A-E)

1. Assicurati che sia disponibile una fotocamera per smartphone con i seguenti requisiti minimi:
   Fotocamera da 12 megapixel (MP)
   Video con risoluzione 1080p
   5 GB di spazio di archiviazione (20 minuti di video sono 3-4 Gb)
   App video time-lapse dall'app store (applicazioni gratuite disponibili)
2. Posizionare la scatola luminosa a LED sul rack inferiore dell'incubatore a 25 °C dove verrà eseguito il test.
3. Per nascondere il motivo tratteggiato sulla superficie luminosa del LED, stendere due fogli di tessuto per coprire l'intera superficie della scatola LED.
4. Creare uno stadio elevato per il campione (Figura 1A,D). Il palcoscenico sopraelevato è un foglio di plastica trasparente sostenuto da tunnel rettangolari cavi. I tunnel funzionano come un condensatore per focalizzare la luce, fornendo un migliore contrasto con il campione (Figura 1C). Assicurati che le pareti del tunnel siano un po 'scure per ridurre al minimo la dispersione della luce. Questo studio ha utilizzato scatole di carta marrone. La dimensione del tunnel è 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (L x L x A). La scatola luminosa a LED può contenere fino a cinque tunnel.
5. Posizionare un altro rack sopra il palco per posizionare i telefoni per la registrazione (Figura 1B,E). Ogni telefono registrerà da tre a sei piastre (da una a due file di tre piastre), quindi regola l'altezza del rack di conseguenza. Questo sarà circa 15 cm sopra il campione (Figura 1B).
6. Inserire una ciabatta all'interno dell'incubatore per collegare i telefoni durante la registrazione notturna.

2. Preparazione di buffer e supporti

1. Preparare il tampone M9 aggiungendo 3 g di KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO₄ e 5 g di NaCl a 1 L di H₂O distillato. Sterilizzare in autoclave a 121°C per 20 min. Raffreddare il tampone e quindi aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄.
2. Preparare 1 M tampone KPO 4 aggiungendo 108,3 g di KH 2 PO 4 e 35,6 g di K 2 HPO₄ a 1 L di H ₂O. Regolare il pH a 6,0 aggiungendo KOH. Sterilizzare in autoclave.
3. Preparare la soluzione sbiancante per vermi mescolando 1 mL di candeggina, 0,4 mL di 1 M NaOH e 2,6 mL di H₂O.
4. Preparare le piastre di agar dei terreni di crescita dei nematodi (NGM).
   1. Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di bacto peptone e 17 g di bacto agar in un matraccio da 3 litri. Aggiungere 975 ml di acqua distillata e inserire un mescolatore.
   2. Sterilizzare in autoclave, quindi raffreddare a 55 °C e aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO 4 e 25 mL di tampone 1 M KPO₄ (pH 6,0). Mescolare per amalgamare bene. Versare in piatti da 6 cm. Lasciare asciugare i piatti per almeno 2 giorni.
5. Seme NGM piastre di agar con OP50 E. coli mediante pipettaggio di circa 1 mL di una coltura notturna di OP50 per formare un prato di batteri. Lasciare a temperatura ambiente (RT) fino al momento dell'uso.

3. Preparazione di piastre NGM ad alto peptone (per PA14)

NOTA: Queste piastre devono essere fatte almeno 5 giorni prima del test.

1. Produrre NGM contenente lo 0,35% di peptone. Mescolare 0,3 g di NaCl, 0,35 g di bacto peptone e 1,7 g di bacto agar in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml. Aggiungere 97,5 ml di acqua distillata e inserire un agitatore.
2. Coprire la bocca del matraccio con un foglio di alluminio e autoclave a 121 °C per 20 min.
3. Raffreddare a 55 °C e aggiungere 0,1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 0,1 mL di 1 M CaCl 2, 0,1 mL di 1 M MgSO 4 e_2,5 mL di tampone 1 M KPO₄ (pH 6,0). Mescolare per amalgamare bene.
4. Versare NGM ad alto peptone in piastre di Petri da 35 mm.
5. Asciugare i piatti per almeno 2 giorni.

4. Sincronizzazione dei vermi mediante sbiancamento

NOTA: iniziare questo passaggio 3 giorni prima del test.

1. Prendi le piastre con vermi adulti gravidi e raccoglile in un microtubo da 1,7 mL lavando le piastre con tampone M9.
2. Rimuovere quanto più liquido possibile, quindi aggiungere 400 μL di soluzione sbiancante. Attendere circa 4-5 minuti con vortice intermittente, fino a quando i corpi dei vermi adulti si rompono, rilasciando le uova.
3. Aggiungere tampone M9 per riempire il resto del microtubo per diluire la soluzione sbiancante. Girare alla massima velocità (da 12.000 a 13.000 x g) per 1-2 s. Rimuovere il surnatante e lavare altre tre volte con tampone M9.
4. Trasferire le uova in una capsula di Petri vuota da 35 mm contenente tampone M9. Lasciare che le uova si schiudano per una notte a 20 °C. In assenza di cibo, i vermi nati si arresteranno allo stadio larvale L1, sincronizzando lo stadio di sviluppo di tutti i vermi.
   NOTA: Rivestire la capsula di Petri da 35 mm con una soluzione di gelatina (gelatina allo 0,05% in acqua autoclavata) può impedire alle uova di attaccarsi al fondo e ridurre al minimo la perdita di uova.
5. Il giorno successivo, trasferire i vermi dello stadio L1 in piastre NGM seminate OP50.
6. Incubare i vermi a 20 °C per 53-54 ore fino a quando i vermi raggiungono lo stadio larvale L4.

5. Preparazione di batteri ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)

NOTA: iniziare questo passaggio 4 giorni prima del test.

1. Striscia i batteri scongelati da -80 °C su una piastra di agar Luria Bertani (LB) senza alcun antibiotico e incubare per una notte a 37 °C.
   NOTA: Utilizzare sempre batteri freschi. Le piastre striate devono essere conservate a 4 °C per non più di 1 settimana.
2. Inoculare una singola colonia in 3 ml di brodo del re e crescere per una notte in un'incubatrice a 37 °C.
3. Il giorno successivo, seminare 7 μL della coltura notturna sulle piastre NGM ad alto peptone e incubare a 37 °C per 24 ore.
4. Spostare le piastre seminate in RT e incubare per altre 24 ore prima dell'uso. Una volta pronto, utilizzare la piastra entro le successive 24 ore.

6. Preparazione alla registrazione

NOTA: eseguire questa operazione subito prima del test.

1. Collegare lo smartphone alla ciabatta collegata a una presa di corrente. Assicurati di disabilitare l'impostazione di blocco automatico per evitare che il telefono ritorni alla schermata di blocco durante la registrazione.
2. Apri l'app della fotocamera time-lapse e imposta l'intervallo time-lapse su 2 s. Imposta la qualità video su 1080p a 30 fps.
3. Posizionare lo smartphone con lo schermo rivolto verso l'alto per registrare con la fotocamera posteriore. Controllare lo schermo per assicurarsi che i tunnel della scatola di carta si adattino al campo visivo.

7. Saggio di evitamento del prato

1. Utilizzando un plettro di filo di platino, trasferire 30 vite senza fine sincronizzate L4 (53-54 h da L1) alla piastra PA14. Posiziona i vermi nel mezzo del prato dei batteri. Per ogni condizione in questo studio, sono state testate due piastre (cioè 60 vermi per condizione).
2. Posizionare le due piastre sul palco sopraelevato dell'apparecchio di registrazione con il coperchio rivolto verso il basso. Il lato con l'agar sarà rivolto verso l'alto verso la fotocamera.
3. Sullo schermo dello smartphone, toccare il punto in cui si trova la piastra, in modo che la fotocamera possa mettere a fuoco le lastre di analisi. È utile avere un'etichetta o una scritta sulla lastra in quanto la fotocamera può usarla per mettere a fuoco correttamente.
   NOTA: la scrittura sul fondo delle lastre non interferisce con l'imaging dei vermi purché sia verso il bordo. Fortunatamente, i vermi rimangono vicino al prato anche dopo che se ne sono andati, quindi è necessaria una vista libera solo dell'area circostante il prato.
4. Avviare la registrazione.
5. Una volta iniziata la registrazione, aggiungi altre lastre al palco. Potrebbe esserci un tempo di ritardo significativo tra le piastre a causa del tempo necessario per trasferire i vermi mediante prelievo. Notare il tempo di ritardo in seguito in modo che ogni condizione possa essere contata nel momento in cui è iniziata.
6. Registra per 20 ore dall'ultima serie di piatti posizionati sul palco. Nel video time-lapse finale, 20 ore di registrazione si tradurranno in un video di 20 minuti.
   NOTA: Può essere utile contare i vermi direttamente dalle piastre dopo il test, almeno all'inizio per le prime occasioni. Questo può essere confrontato con i valori ottenuti attraverso l'imaging video per garantire che producano numeri simili.

8. Elaborazione di video utilizzando script Python

1. Trasferire il file del filmato su un computer per l'elaborazione. L'estensione sarà un file MOV (iPhone) o MP4 (Android).
2. Usa un codice Python per elaborare i video. Il codice può essere trovato su github.com/khyoon201/wormavoid.
3. Per eseguire gli script Python, assicurarsi che sul computer siano preinstallati i seguenti: ffmpeg, uno strumento per la conversione di file video (le istruzioni per l'installazione possono essere trovate sul suo sito Web, ffmpeg.org/download) e i pacchetti Python os, pandas, tkinter e ffmpeg-python.
4. Trova le dimensioni e le coordinate di ogni lastra usando il extract_frame.py script.
   1. Eseguire lo script extract_frame.py . Apparirà una finestra per selezionare il file video memorizzato sul computer. Al termine dell'esecuzione, nella stessa directory verrà visualizzato un file jpeg con lo stesso nome.
   2. Aprire il file jpeg in ImageJ (imagej.org).
   3. Dal menu, scegliere Analizza > Imposta misurazioni. Assicurarsi che la casella Visualizza etichetta sia selezionata (Figura 2A). Chiudere la finestra.
   4. Con lo strumento linea retta , misurate il diametro di una lastra disegnando una linea su di essa, quindi scegliete Analizza > Misura dal menu. Se il video è in 1080p, ogni piastra sarà larga circa 480 pixel. Annotare queste informazioni e chiudere la finestra Risultati .
   5. Con lo strumento Multipunto , contrassegnate i punti sul lato superiore sinistro di ogni piastra. Questi punti diventeranno l'angolo in alto a sinistra dei video ritagliati (Figura 2B). L'ordine è importante; segnare in ordine di quando sono state avviate le piastre. Dopo aver creato un punto per tutte le piastre, scegliete Analizza > misura (Analyze Measure ) dal menu. Le misurazioni, incluse le coordinate X e Y dei punti, verranno visualizzate nella finestra Risultati.
   6. Per elaborare più video, ripetete il processo in ImageJ con altri file jpeg. Tutte le coordinate X e Y verranno elencate nella stessa finestra Risultati .
   7. Salvare la finestra Risultati in un file CSV. Il file deve essere salvato nella stessa directory dei file del filmato.
5. Trova l'ora di inizio per ogni piatto.
   1. Riproduci il filmato, sul computer o sul telefono, e prendi nota degli orari di inizio di ogni set di lastre posizionate sotto la fotocamera.
   2. Apri il file Results.csv con le coordinate e aggiungi una colonna "start". Per ogni riga corrispondente alle singole targhe, inserisci l'ora di inizio appropriata, in secondi, sotto la colonna "start" (ad esempio, se l'ora di inizio è 0:00:08, inserisci 8). Salvare.
      Nota : il nome della colonna deve essere "start" (in minuscolo, senza virgolette) per essere riconosciuto dallo script successivo per il ritaglio e il taglio.
6. Ritaglia e taglia i video.
   1. Eseguire lo script crop_n_trim.py .
   2. Quando richiesto, scegliere il file Results.csv .
      NOTA: assicurarsi che il file Results.csv e tutti i file del filmato si trovino nella stessa directory.
   3. Immettete le quote della piastra. Immettete il valore in pixel indicato in precedenza.
      NOTA: lo script leggerà ora ogni riga del file Results.csv per trovare il file del filmato corretto leggendo il nome del file nella colonna "etichetta" e ritaglierà in base alle coordinate indicate nelle colonne "X" e "Y". L'ora di inizio di ogni piastra sarà determinata dall'ora indicata nella colonna "start". Al termine dell'esecuzione dello script, verrà visualizzata una cartella con lo stesso nome del filmato, seguita dall'ora di inizio (ad esempio, "Movie1_8"), in cui verranno salvati i video di 10 s corrispondenti a ciascun punto orario del test.

9. Conteggio manuale con ImageJ

1. Aprire ogni file AVI in ImageJ.
2. Conta i vermi visibili all'esterno del prato. I worm sovrapposti in un fotogramma di solito si allontanano in un altro fotogramma in modo che possano essere contati correttamente.
3. Calcola il tasso di occupazione per ogni punto temporale:
   Tasso di occupazione = (vermi totali - numero di vermi al di fuori del prato)/vermi totali
   NOTA: i vermi si muoveranno dentro e fuori dal prato durante il video, ma ciò non altererà in modo significativo i risultati. Prova ad andare con il numero che sembra essere la media, o il numero di worm al punto orario esatto (5 s nel video).

Risultati

Il primo video prodotto dalla sceneggiatura è di 1 ora dall'inizio del test. Il video per 0 h non viene salvato, poiché i vermi iniziano il test all'interno del prato, quindi il tasso di occupazione è sempre del 100%.

I vermi N2 wild-type sono confrontati con i mutanti npr-1, il cui difetto di prevenzione del prato è ben stabilito nella letteratura ^6,10 (Figura 3A-E

Discussione

Immaginare il comportamento animale, piuttosto che basarsi sull'osservazione diretta, non è solo conveniente, ma ha anche il vantaggio di lasciare documentazione visiva. Ciò consente l'analisi cieca da parte di una terza persona oggettiva o potrebbe anche essere utilizzato per l'analisi automatizzata utilizzando tecniche di riconoscimento delle immagini. Nonostante i vantaggi, l'attrezzatura standard solitamente offerta è ad alto costo, quindi ci si impegna nella configurazione una volta acquistata.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727