Establecimiento y confirmación de un modelo de ratón de sobrecarga de volumen del ventrículo derecho postnatal

Resumen

Este protocolo presenta el establecimiento y la confirmación de un modelo de sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho postnatal en ratones con fístula arteriovenosa abdominal (FAV), que puede aplicarse para investigar cómo la VO contribuye al desarrollo cardíaco postnatal.

Resumen

La sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho (VD) es común en niños con cardiopatías congénitas. En vista de las distintas etapas de desarrollo, el miocardio del VD puede responder de manera diferente a la VO en los niños en comparación con los adultos. El presente estudio tiene como objetivo establecer un modelo postnatal de VO RV en ratones utilizando una fístula arteriovenosa abdominal modificada. Para confirmar la creación de VO y los siguientes cambios morfológicos y hemodinámicos del VD, se realizó ecografía abdominal, ecocardiografía y tinción histoquímica durante 3 meses. Como resultado, el procedimiento en ratones postnatales mostró una supervivencia aceptable y una tasa de éxito de la fístula. En ratones VO, la cavidad del VD se agrandó con una pared libre engrosada y el volumen sistólico aumentó entre un 30% y un 40% dentro de los 2 meses posteriores a la cirugía. A partir de entonces, la presión sistólica del VD aumentó, se observó la correspondiente regurgitación de la válvula pulmonar y apareció una pequeña remodelación de la arteria pulmonar. En conclusión, la cirugía de fístula arteriovenosa modificada (FAV) es factible para establecer el modelo VO del VD en ratones postnatales. Teniendo en cuenta la probabilidad de cierre de la fístula y la resistencia elevada de la arteria pulmonar, se debe realizar una ecografía abdominal y una ecocardiografía para confirmar el estado del modelo antes de la aplicación.

Introducción

La sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho (VD) es frecuente en niños con cardiopatías congénitas (CC), lo que conduce a un remodelado miocárdico patológico y a un mal pronóstico a largo plazo ^1,2,3. Es esencial una comprensión profunda de la remodelación del VD y las intervenciones tempranas dirigidas relacionadas para obtener un buen resultado en los niños con cardiopatía coronaria. Existen varias diferencias en las estructuras moleculares, las funciones fisiológicas y las respuestas a los estímulos en el corazón de adultos y niños 1,4,5,6. Por ejemplo, bajo la influencia de la sobrecarga de presión, la proliferación de cardiomiocitos es la principal respuesta en los corazones neonatos, mientras que la fibrosis ocurre en los corazones adultos ^5,6. Además, muchos fármacos eficaces en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en adultos no tienen ningún efecto terapéutico sobre la insuficiencia cardíaca en niños, e incluso pueden causar más daños ^7,8. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de los animales adultos no pueden aplicarse directamente a los animales jóvenes.

El modelo de fístula arteriovenosa (FAV) se ha utilizado durante décadas para inducir VO cardíaca crónica y la disfunción cardíaca correspondiente en animales adultos de diferentes especies 9,10,11,12,13. Sin embargo, se sabe poco sobre el modelo en ratones postnatales. En nuestros estudios previos, se generó con éxito un modelo de ratón postnatal VO mediante la creación de una FAV abdominal. También se demostró la alteración de la trayectoria evolutiva del VD en el corazón postnatal^14,15,16,17.

Para explorar el proceso quirúrgico modificado subyacente y las características del presente modelo, se presenta un protocolo detallado; El modelo se evalúa durante 3 meses en este estudio.

Protocolo

Todos los procedimientos presentados aquí se ajustaron a los principios descritos en la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal y Estudios Humanos del Centro Médico Infantil de Shanghái (SCMC-LAWEC-2023-003). Para el presente estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6 (P7, machos, 3-4 g). Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón y sus madres lactantes (crías:madres = 6:1 en una sola jaula) se mantuvieron en condiciones de laboratorio libres de patógenos específicos bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 h a 22 ± 2 °C con libre acceso al agua y una dieta nutritiva. Los cachorros fueron asignados aleatoriamente en dos grupos: un grupo VO y un grupo operado de forma simulada (simulado).

1. Preparación de equipos e instrumentos quirúrgicos

NOTA: Los detalles comerciales de todos los materiales/equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Asegúrese de que los siguientes tipos de equipos estén listos y funcionen correctamente: mesa de operaciones (panel de espuma plástica), máquina de anestesia inhalatoria, microscopio con iluminación vertical y cámara incorporada, dispositivo de ultrasonido con transductor de 24 MHz y plataforma de calentamiento termostático.
2. Esterilice los instrumentos quirúrgicos (es decir, un soporte para microagujas, pinzas de punta fina y tijeras de resorte Vannas de mango redondo).
3. Ensamble los siguientes consumibles: agujas de sutura quirúrgica 11-0 y 9-0 (punta cónica) con hilo, tiras de cinta adhesiva, agujas de jeringa de 5 ml, seda 2-0 (fijación quirúrgica), hisopos de algodón estériles y gel de ultrasonido.
4. Asegúrese de que los siguientes reactivos estén presentes: betadina, etanol al 70%, solución salina estéril normal, isoflurano, paracetamol, ungüento oftálmico y crema depilatoria.

2. Procedimiento quirúrgico

NOTA: El procedimiento de cirugía de fístula fue modificado de acuerdo con el método¹¹ descrito anteriormente. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la operación de FAV en ratones postnatales.

1. Anestesia y contención
   1. Coloque las crías de ratón en una caja de inducción de anestesia suministrada con isoflurano/oxígeno al 2% durante 2 minutos con el flujo ajustado a 1 L/min. Administrar paracetamol (0,1 ml VO de 80 mg/2,5 ml) con una jeringa para la tuberculosis.
   2. Coloque a los cachorros en decúbito supino sobre la mesa de operaciones con inhalación nasal de isoflurano al 1,5% con un flujo de 0,8 L/min para mantener la anestesia. Ajusta la posición del cachorro atando las patas a las agujas fijas de la jeringa. Aplique ungüento oftálmico en los ojos de los cachorros para prevenir la desecación de la córnea.
   3. Pellizque la cola del cachorro anestesiado para verificar su capacidad de respuesta al dolor; Ningún movimiento corporal obvio indica una anestesia adecuada.
2. Cirugía de fístula
   1. Desinfecte la piel con tres exfoliantes alternos de betadine y etanol al 70%, y luego cubra el sitio quirúrgico. Corte la pared abdominal y el peritoneo desde la parte inferior del abdomen hasta el subxifoides para exponer completamente la cavidad peritoneal, teniendo cuidado de no lesionar los órganos abdominales. Gotee solución salina estéril normal para humedecer los órganos externalizados.
   2. Tire suavemente del tracto gastrointestinal y la vejiga lejos del sitio quirúrgico con hisopos de algodón para visualizar la aorta abdominal vertical (AA) y la vena cava inferior (IVC) debajo del retroperitoneo. Gire la mesa de operaciones 90° en sentido contrario a las agujas del reloj y ajuste el aumento del microscopio para visualizar claramente los dos recipientes horizontales.
   3. Punción de la fístula desde el AA en la VCI en dirección oblicua 1 cm distal a la arteria renal con una aguja de sutura 11-0 (diámetro = 0,07 mm). Verificar la creación exitosa de la fístula en función de la hinchazón y la mezcla de sangre venosa y arterial en la VCI.
   4. A continuación, comprima rápidamente el punto de sangrado con una fuerza adecuada aplicada con bastoncillos de algodón secos durante 15 s. Reemplace el estómago, los intestinos y la vejiga en la cavidad abdominal lo antes posible para promover la compresión hemostática.
   5. Suturar la pared abdominal y el peritoneo con una sutura de manta utilizando un hilo de sutura 9-0. Suspenda la anestesia y proporcione a los cachorros oxígeno al 100% durante 1 minuto.
3. Reanimación con anestesia
   1. Coloque a los cachorros en una plataforma de calentamiento a 38 °C. Después de un despertar completo con vitalidad, devuelva a los cachorros a su madre lactante. Todo el procedimiento dura aproximadamente 15 min.
      NOTA: En el presente estudio, el grupo simulado se somete al mismo procedimiento, excepto por la etapa de punción.

3. Confirmación ecográfica de fístula

NOTA: El funcionamiento general del ecógrafo fue idéntico al de los informes anteriores^18,19.

1. Confirmación de fístula mediante ecografía abdominal
   1. Después de la inducción de la anestesia (paso 2.1.1), fije los ratones con tiras de cinta adhesiva en posición supina sobre la plataforma caliente. Luego, conecte los ratones a un monitor de electrocardiograma (ECG) con gel de ultrasonido. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% a un flujo de 0,8 L/min.
   2. Prepara la piel del pecho y el abdomen con crema depilatoria. Después de unos segundos, retire la crema con una punta de algodón empapada en agua tibia. Coloque el transductor (24 MHz) en la línea abdominal media y gire el marcador del transductor hacia la cabeza de los ratones.
   3. Mueva la plataforma hacia abajo hacia el lado izquierdo o derecho de los ratones y use el modo B y el modo Doppler color para visualizar la vista del eje largo de los vasos y las señales sanguíneas^18,19. Mida la velocidad del flujo sanguíneo del AA, la VCI y la fístula para confirmar la permeabilidad de la FAV a través del modo Doppler de onda pulsada.
      NOTA: La creación exitosa de la fístula en la ecografía fue indicada por una señal de flujo turbulento visible entre el AA y la VCI (Figura 2C). La velocidad del flujo sanguíneo Doppler en el sitio de la FAV fue significativamente elevada en comparación con una velocidad sistólica relativamente más baja en el AA (Figura 2A, C). Además, en contraste con los patrones de flujo normales en la VCI (Figura 2B), la forma de onda pulsátil del flujo sanguíneo de la VCI proximal a la FAV también confirmó la creación exitosa de la fístula (Figura 2D).
2. Confirmación de VO por ecocardiografía
   1. Mueva la parte del extremo de la cola de la plataforma hacia abajo, coloque el transductor (24 MHz) en el pecho y gire el marcador del transductor hacia el hombro derecho de los ratones. Visualice la vista paraesternal modificada del eje largo de la arteria pulmonar (AP) utilizando el modo B y el modo Doppler color.
   2. Usando el modo Doppler de onda pulsada, mida las señales de flujo sanguíneo en la PA, incluida la integral de tiempo de velocidad (PA-VTI), el diámetro de la válvula PA (PAD), el tiempo de aceleración arterial pulmonar (PAT) y el tiempo de eyección del VD (RVET) (Figura 2E, F y Figura 3A, B).
   3. Mida los parámetros de ultrasonido a partir de la media de tres mediciones consecutivas. Calcule el volumen sistólico del VD (RVSV, ml) y la presión sistólica del VD (RVSP, mmHg) utilizando las siguientes fórmulas²⁰:
      RVSV [mL] = 1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - índice + 63.7
      NOTA: Teniendo en cuenta el sesgo de medición ecográfica, se consideró un aumento del >15% en la RVSV o VTI_PA en ratones VO en comparación con los ratones del grupo simulado en el RV (Figura 2E, F).

Resultados

Tasa de supervivencia y permeabilidad de la FAV a los 3 meses
Un total de 30 (75%) ratones en el grupo VO y 19 (95%) ratones en el grupo simulado sobrevivieron a la cirugía de FAV (Figura 4A). En el grupo de VO, ocho ratones murieron dentro de 1 día después de la cirugía debido a sangrado excesivo (n = 5) o canibalización (n = 3), mientras que dos ratones murieron por causas desconocidas al mes de edad.

De los ratones VO supervivientes (n ...

Discusión

Anteriormente, el modelo clásico de RV VO se creaba utilizando la regurgitación valvular²¹; sin embargo, en comparación con la FAV, la cirugía de válvula a corazón abierto puede requerir técnicas más sofisticadas y puede estar asociada con una mortalidad significativamente mayor, particularmente en ratones posnatales. Como los estudios en animales han demostrado que el mismo efecto de la VO se ha logrado con la FAV²², en este estudio se utilizó la cirugía de físt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400