Postnatal Sağ Ventrikül Hacim Aşırı Yük Fare Modelinin Oluşturulması ve Doğrulanması

Özet

Bu protokol, abdominal arteriyovenöz fistüllü (AVF) farelerde doğum sonrası sağ ventrikül volüm aşırı yüklenmesi (VO) modelinin kurulmasını ve doğrulanmasını sunar ve VO'nun doğum sonrası kalp gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için uygulanabilir.

Özet

Konjenital kalp hastalığı olan çocuklarda sağ ventrikül (RV) aşırı hacim yüklenmesi (VO) yaygındır. Farklı gelişim aşamaları göz önüne alındığında, RV miyokard, çocuklarda yetişkinlere kıyasla VO'ya farklı yanıt verebilir. Bu çalışma, modifiye abdominal arteriyovenöz fistül kullanan farelerde postnatal RV VO modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. VO oluşumunu ve RV'nin aşağıdaki morfolojik ve hemodinamik değişikliklerini doğrulamak için 3 ay boyunca abdominal ultrason, ekokardiyografi ve histokimyasal boyama yapıldı. Sonuç olarak, postnatal farelerde prosedür kabul edilebilir bir sağkalım ve fistül başarı oranı gösterdi. VO farelerinde, RV boşluğu kalınlaşmış bir serbest duvarla genişletildi ve inme hacmi ameliyattan sonraki 2 ay içinde yaklaşık% 30 -% 40 oranında arttı. Daha sonra, RV sistolik basıncı arttı, karşılık gelen pulmoner kapak yetersizliği gözlendi ve küçük pulmoner arter yeniden şekillenmesi ortaya çıktı. Sonuç olarak, modifiye arteriyovenöz fistül (AVF) cerrahisi, postnatal farelerde RV VO modelini oluşturmak için uygundur. Fistülün kapanma ve pulmoner arter direncinin artmış olma olasılığı göz önüne alındığında, uygulama öncesi model durumunu doğrulamak için abdominal ultrason ve ekokardiyografi yapılmalıdır.

Giriş

Konjenital kalp hastalığı (KKH) olan çocuklarda sağ ventrikül (RV) aşırı hacim yüklenmesi (VO) yaygındır, bu da patolojik miyokardiyal yeniden şekillenmeye ve kötü bir uzun vadeli prognoza yol açar ^1,2,3. KKH'li çocuklarda iyi bir sonuç için RV yeniden şekillenmesi ve ilgili erken hedefli müdahalelerin derinlemesine anlaşılması esastır. Yetişkinlerin ve çocukların kalplerindeki moleküler yapılarda, fizyolojik işlevlerde ve uyaranlara verilen yanıtlarda çeşitli farklılıklar vardır 1,4,5,6. Örneğin, aşırı basınç yükünün etkisi altında, kardiyomiyosit proliferasyonu yenidoğan kalplerde ana yanıttır, oysa fibroz yetişkin kalplerde^{görülür 5,6}. Ek olarak, yetişkinlerde kalp yetmezliği tedavisinde etkili olan birçok ilacın çocuklarda kalp yetmezliği üzerinde terapötik bir etkisi yoktur ve hatta daha fazla hasara neden olabilir ^7,8. Bu nedenle, yetişkin hayvanlardan elde edilen sonuçlar doğrudan genç hayvanlara uygulanamaz.

Arteriyovenöz fistül (AVF) modeli, farklı türlerin yetişkin hayvanlarında onlarca yıldır kronik kalp VO'sunu ve buna karşılık gelen kardiyak disfonksiyonu indüklemek için kullanılmıştır 9,10,11,12,13. Bununla birlikte, doğum sonrası farelerde model hakkında çok az şey bilinmektedir. Önceki çalışmalarımızda, abdominal AVF oluşturularak bir VO postnatal fare modeli başarıyla oluşturulmuştur. Postnatal kalpte değişen RV gelişim yolu da^{gösterildi 14,15,16,17}.

Mevcut modelin altında yatan modifiye cerrahi süreci ve özelliklerini araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur; Bu çalışmada model 3 ay süreyle değerlendirilmiştir.

Protokol

Burada sunulan tüm prosedürler, Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygundur ve Şanghay Çocuk Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Refahı ve İnsan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır (SCMC-LAWEC-2023-003). Bu çalışma için C57BL/6 fare yavruları (P7, erkek, 3-4 g) kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları ve emziren anneleri (yavrular: anneler = tek bir kafeste = 6:1), suya serbest erişim ve besleyici bir diyet ile 22 ± 2 ° C'de 12 saatlik aydınlık ve karanlık bir döngü altında spesifik-patojensiz laboratuvar koşullarında tutuldu. Yavrular iki gruba ayrıldı: bir VO grubu ve sahte (sahte) bir grup.

1. Ekipman ve cerrahi alet hazırlığı

NOT: Tüm malzemelerin/ekipmanların ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Aşağıdaki ekipman türlerinin hazır ve düzgün çalıştığından emin olun: ameliyat masası (köpük plastik panel), inhalasyon anestezi makinesi, dikey aydınlatmalı mikroskop ve dahili kamera, 24 MHz dönüştürücülü ultrason cihazı ve termostatik ısıtma platformu.
2. Cerrahi aletleri sterilize edin (yani mikro iğne tutucu, ince uçlu forseps ve yuvarlak saplı Vannas yaylı makas).
3. Aşağıdaki sarf malzemelerini birleştirin: İplikli 11-0 ve 9-0 cerrahi dikiş iğneleri (konik nokta), bant şeritleri, 5 mL şırınga iğneleri, 2-0 ipek (cerrahi fiksasyon), steril pamuklu çubuklar ve ultrason jeli.
4. Aşağıdaki reaktiflerin mevcut olduğundan emin olun: Betadin, %70 etanol, normal steril salin, izofluran, asetaminofen, oftalmik merhem ve tüy dökücü krem.

2. Cerrahi prosedür

NOT: Fistül cerrahisi prosedürü daha önce açıklanan yönteme^{göre değiştirildi 11}. Şekil 1 , doğum sonrası farelerde AVF operasyonunun şematik bir diyagramını göstermektedir.

1. Anestezi ve kısıtlama
   1. Fare yavrularını, akış 1 L/dk'ya ayarlanmış olarak 2 dakika boyunca %2 izofluran/oksijen içeren bir anestezi-indüksiyon kutusuna yerleştirin. Bir TB şırınga kullanarak asetaminofen (0.1 ml PO 80 mg / 2.5 ml) uygulayın.
   2. Anesteziyi sürdürmek için yavruları ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve 0,8 L/dk akışla %1,5 izofluran nazal inhalasyon yapın. Bacakları sabit şırınga iğnelerine bağlayarak yavrunun konumunu ayarlayın. Kornea kurumasını önlemek için yavruların gözlerine oftalmik merhem sürün.
   3. Ağrıya tepki verip vermediğini kontrol etmek için anestezi uygulanmış yavrunun kuyruğunu sıkıştırın; Belirgin vücut hareketlerinin olmaması yeterli anesteziyi gösterir.
2. Fistül cerrahisi
   1. Cildi üç alternatif betadin ve% 70 etanol fırçası ile dezenfekte edin ve ardından cerrahi bölgeyi örtün. Karın organlarına zarar vermemeye dikkat ederek, periton boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için karın duvarını ve peritonu alt karın bölgesinden subksifoide doğru kesin. Dışlanmış organları nemlendirmek için normal steril salin damlatın.
   2. Retroperiton altındaki dikey abdominal aortu (AA) ve inferior vena kava'yı (IVC) görselleştirmek için pamuklu çubuklar kullanarak gastrointestinal sistemi ve mesaneyi cerrahi bölgeden nazikçe çekin. Ameliyat masasını saat yönünün tersine 90° döndürün ve iki yatay damarı net bir şekilde görselleştirmek için mikroskop büyütmesini ayarlayın.
   3. 11-0 dikiş iğnesi (çap = 0.07 mm) ile fistülleri AA'dan IVC'ye renal arterin 1 cm distalinde eğik yönde delin. IVC'de venöz ve arteriyel kanın şişmesine ve karışmasına dayalı olarak başarılı fistül oluşumunu doğrulayın.
   4. Ardından, 15 saniye boyunca kuru pamuklu çubuklarla uygulanan uygun bir kuvvet kullanarak kanama noktasını hızla sıkıştırın. Hemostatik sıkıştırmayı teşvik etmek için karın boşluğundaki mideyi, bağırsakları ve mesaneyi mümkün olan en kısa sürede değiştirin.
   5. Karın duvarını ve peritonu 9-0 dikiş ipliği kullanarak bir battaniye dikişi ile dikin. Anesteziyi bırakın ve yavrulara 1 dakika boyunca %100 oksijen verin.
3. Anestezi resüsitasyonu
   1. Yavruları 38 °C'lik bir ısıtma platformuna yerleştirin. Canlılıkla tam bir uyanıştan sonra, yavruları emziren annelerine geri verin. Tüm prosedür yaklaşık 15 dakika sürer.
      NOT: Bu çalışmada sahte grup, delme adımı dışında aynı prosedüre tabi tutulmaktadır.

3. Fistülün ultrason onayı

NOT: Ultrason cihazının genel çalışması önceki raporlarla^{aynıydı 18,19}.

1. Fistülün abdominal ultrason ile doğrulanması
   1. Anestezi indüksiyonundan sonra (adım 2.1.1), fareleri sıcak platform üzerinde sırtüstü pozisyonda bant şeritleri ile sabitleyin. Ardından, fareleri ultrason jeli ile bir elektrokardiyogram (EKG) monitörüne bağlayın. 0,8 L / dak akışta% 1,5 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün.
   2. Tüy dökücü krem kullanarak göğüs ve karın derisini hazırlayın. Birkaç saniye sonra, kremayı ılık suya batırılmış pamuklu bir uçla çıkarın. Dönüştürücüyü (24 MHz) orta karın çizgisine yerleştirin ve dönüştürücü işaretleyiciyi farelerin kafasına döndürün.
   3. Platformu farelerin sol veya sağ tarafına doğru hareket ettirin ve damarların ve kan sinyallerinin uzun eksen görünümünü görselleştirmek için B modunu ve renkli Doppler modunu kullanın^18,19. Darbeli dalga Doppler modu ile AVF açıklığını doğrulamak için AA, IVC ve fistülün kan akış hızını ölçün.
      NOT: Ultrasonda başarılı fistül oluşumu, AA ve IVC arasında görülebilen türbülanslı bir akış sinyali ile gösterildi (Şekil 2C). AVF bölgesinde Doppler kan akım hızı, AA'da nispeten daha düşük sistolik hıza kıyasla anlamlı olarak yüksekti (Şekil 2A,C). Ayrıca, IVC'deki normal akış paternlerinin aksine (Şekil 2B), AVF'ye yakın IVC kan akışının pulsatil dalga formu da fistülün başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğruladı (Şekil 2D).
2. Ekokardiyografi ile VO'nun doğrulanması
   1. Platformun kuyruk ucu kısmını aşağı doğru hareket ettirin, dönüştürücüyü (24 MHz) göğsün üzerine yerleştirin ve dönüştürücü işaretleyiciyi farelerin sağ omzuna döndürün. Pulmoner arterin (PA) modifiye edilmiş parasternal uzun eksen görünümünü B modu ve renkli Doppler modunu kullanarak görselleştirin.
   2. Darbeli dalga Doppler modunu kullanarak, hız zaman integrali (PA-VTI), PA valfinin çapı (PAD), pulmoner arteriyel hızlanma süresi (PAT) ve RV ejeksiyon süresi (RVET) dahil olmak üzere PA'daki kan akış sinyallerini ölçün (Şekil 2E, F ve Şekil 3A, B).
   3. Ultrason parametrelerini ardışık üç ölçümün ortalamasından ölçün. Aşağıdaki formülleri²⁰ kullanarak RV strok hacmini (RVSV, mL) ve RV sistolik basıncını (RVSP, mmHg) hesaplayın:
      RVSV [mL] =1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - indeks + 63.7
      NOT: Ultrason ölçüm yanlılığı göz önüne alındığında, sahte gruptaki farelere kıyasla VO farelerinde RVSV veya VTI_PA'da % >15'lik bir artış, RV'de VO olarak kabul edildi (Şekil 2E, F).

Sonuçlar

3 ay içinde sağkalım oranı ve AVF açıklığı
VO grubunda toplam 30 (% 75) fare ve sahte grupta 19 (% 95) fare AVF ameliyatından kurtuldu (Şekil 4A). VO grubunda, sekiz fare aşırı kanama (n = 5) veya yamyamlık (n = 3) nedeniyle ameliyattan sonraki 1 gün içinde ölürken, iki fare 1 ayda bilinmeyen nedenlerden öldü.

Hayatta kalan VO farelerinden (n = 30), ultrason, postoperatif 21 farede başarılı bir şekilde fistül oluşumun...

Tartışmalar

Önceden, klasik RV VO modeli, valf yetersizliği²¹ kullanılarak oluşturulmuştu; bununla birlikte, AVF ile karşılaştırıldığında, açık kalp kapakçığı cerrahisi daha karmaşık teknikler gerektirebilir ve özellikle doğum sonrası farelerde önemli ölçüde daha yüksek mortalite ile ilişkili olabilir. Hayvan çalışmaları, VO'nun aynı etkisinin AVF²² ile elde edildiğini gösterdiğinden, bu çalışmada daha az travma ile modifiye abdominal fistül ce...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400