출생 후 우심실 용적 과부하 마우스 모델의 확립 및 확인

요약

이 프로토콜은 복부 동정맥루(AVF)가 있는 마우스에서 출생 후 우심실 부피 과부하(VO) 모델의 설정 및 확인을 제시하며, VO가 출생 후 심장 발달에 어떻게 기여하는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

초록

우심실(RV) 부피 과부하(VO)는 선천성 심장 질환이 있는 어린이에게 흔합니다. 뚜렷한 발달 단계를 고려할 때 RV 심근은 성인과 비교하여 어린이의 VO에 다르게 반응할 수 있습니다. 본 연구는 변형된 복부 동정맥루를 사용하여 생쥐에서 출생 후 RV VO 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. VO의 생성과 RV의 다음과 같은 형태학적 및 혈류역학적 변화를 확인하기 위해 복부 초음파, 심초음파 및 조직화학적 염색을 3개월 동안 수행했습니다. 그 결과, 출생 후 마우스에서의 시술은 허용 가능한 생존율과 누공 성공률을 보였다. VO 마우스에서 RV 캐비티는 두꺼워진 자유 벽으로 확대되었으며 수술 후 2개월 이내에 스트로크 부피가 약 30%-40% 증가했습니다. 그 후, RV 수축기 혈압이 증가하고, 그에 상응하는 폐동맥 역류가 관찰되었으며, 작은 폐동맥 리모델링이 나타났다. 결론적으로, 변형된 동정맥루(AVF) 수술은 출생 후 마우스에서 RV VO 모델을 확립하는 데 가능합니다. 누공 폐쇄 가능성과 폐동맥 저항 상승 가능성을 고려하여 복부 초음파와 심장 초음파를 시행하여 적용 전 모델 상태를 확인해야 합니다.

서문

우심실(RV) 부피 과부하(VO)는 선천성 심장 질환(CHD)이 있는 소아에서 흔히 발생하며, 이는 병리학적 심근 리모델링과 나쁜 장기 예후를 초래한다 ^1,2,3. RV 리모델링 및 관련 조기 표적 개입에 대한 심층적인 이해는 CHD 아동의 좋은 결과를 위해 필수적입니다. 성인과 어린이의 심장에서 분자 구조, 생리적 기능 및 자극에 대한 반응에는 몇 가지 차이가 있습니다 1,4,5,6. 예를 들어, 압력 과부하의 영향으로 신생아 심장에서는 심근 세포 증식이 주요 반응인 반면, 성인 심장에서는 섬유화가 발생한다 ^5,6. 또한, 성인의 심부전 치료에 효과적인 많은 약물은 소아의 심부전에 치료 효과가 없으며, 심지어 추가적인 손상을 일으킬 수도 있다 ^7,8. 따라서 다 자란 동물에서 도출된 결론은 어린 동물에게 직접 적용할 수 없습니다.

동정맥루(AVF) 모델은 수십 년 동안 다른 종의 성체 동물에서 만성 심장 VO 및 해당 심장 기능 장애를 유도하는 데 사용되어 왔습니다 9,10,11,12,13. 그러나 출생 후 쥐의 모델에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이전 연구에서 VO 산후 마우스 모델은 복부 AVF를 생성하여 성공적으로 생성되었습니다. 산후 심장에서 변화된 RV 발달 트랙도 입증되었다^14,15,16,17.

현재 모델의 근본적인 수정된 수술 과정과 특성을 탐구하기 위해 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 이 연구에서는 모델을 3개월 동안 평가합니다.

프로토콜

여기에 제시된 모든 절차는 헬싱키 선언에 명시된 원칙을 준수했으며 상하이 아동 의료 센터의 동물 복지 및 인간 연구 위원회(SCMC-LAWEC-2023-003)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 C57BL/6마리의 새끼 마우스(P7, 수컷, 3-4g)가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 새끼 생쥐와 수유 중인 어미(단일 케이지에서 새끼:어미 = 6:1)는 22 ± 2°C에서 12시간 밝고 어두운 주기 하에서 특정 병원체가 없는 실험실 조건에서 물과 영양 식단에 자유롭게 접근할 수 있도록 유지되었습니다. 새끼들은 VO 그룹과 가짜(가짜) 그룹의 두 그룹으로 무작위 배정되었습니다.

1. 장비 및 수술 도구 준비

알림: 모든 재료/장비의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술대(발포 플라스틱 패널), 흡입 마취 기계, 수직 조명 및 내장 카메라가 있는 현미경, 24MHz 변환기가 있는 초음파 장치 및 자동 온도 조절 가열 플랫폼과 같은 유형의 장비가 준비되고 제대로 작동하는지 확인하십시오.
2. 수술 기구(예: 마이크로 바늘 홀더, 가는 끝 집게, 둥근 손잡이 Vannas 스프링 가위)를 소독합니다.
3. 실이 있는 11-0 및 9-0 수술용 봉합사(테이퍼 포인트), 테이프 스트립, 5mL 주사기 바늘, 2-0 실크(수술용 고정), 멸균 면봉 및 초음파 젤을 조립합니다.
4. 베타딘, 70% 에탄올, 일반 멸균 식염수, 이소플루란, 아세트아미노펜, 안과 연고 및 제모 크림과 같은 시약이 있는지 확인하십시오.

2. 수술 절차

참고: 누공 수술 절차는 앞서 설명한 방법¹¹에 따라 수정되었습니다. 도 1 은 출생 후 마우스에서의 AVF 수술의 개략도를 나타낸다.

1. 마취 및 억제
   1. 새끼 생쥐를 2% 이소플루란/산소가 공급되는 마취 유도 상자에 넣고 유량을 1L/min으로 설정하여 2분 동안 보냅니다. 결핵 주사기를 사용하여 아세트아미노펜(80mg/2.5ml의 PO 0.1ml)을 투여합니다.
   2. 마취를 유지하기 위해 0.8L/min의 유량으로 1.5% 이소플루란의 비강 흡입으로 새끼를 수술대에 누운 자세로 놓습니다. 다리를 고정 주사기 바늘에 묶어 강아지의 위치를 조정하십시오. 각막 건조를 방지하기 위해 강아지의 눈에 안과 연고를 바르십시오.
   3. 마취된 강아지의 꼬리를 꼬집어 통증 반응을 확인합니다. 뚜렷한 신체 움직임이 없는 것으로 보아 적절한 마취가 이루어졌음을 알 수 있다.
2. 누공 수술
   1. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 가며 세 번 문질러 피부를 소독한 다음 수술 부위를 드레이프합니다. 복벽과 복막을 하복부에서 복하부까지 잘라 복강이 완전히 노출되도록 하고 복부 장기를 다치지 않도록 주의합니다. 외부 장기를 촉촉하게 하기 위해 일반 멸균 식염수를 떨어뜨립니다.
   2. 면봉을 사용하여 수술 부위에서 위장관과 방광을 부드럽게 당겨 후복막 아래의 수직 복부 대동맥(AA)과 하대정맥(IVC)을 시각화합니다. 수술대를 시계 반대 방향으로 90° 회전하고 현미경 배율을 조정하여 두 개의 수평 혈관을 선명하게 시각화합니다.
   3. 11-0 봉합사 바늘(직경 = 0.07mm)을 사용하여 신장 동맥 원위 1cm의 비스듬한 방향으로 AA에서 IVC로 누공을 뚫습니다. IVC에서 정맥혈과 동맥혈의 부종과 혼합을 기반으로 성공적인 누공 생성을 확인합니다.
   4. 그런 다음 마른 면봉으로 적절한 힘을 가하여 15초 동안 출혈 지점을 빠르게 압박합니다. 복강의 위, 장, 방광을 가능한 한 빨리 교체하여 지혈 압박을 촉진하십시오.
   5. 9-0 봉합사를 사용하여 블랭킷 스티치로 복벽과 복막을 봉합합니다. 마취를 중단하고 강아지에게 100분 동안 1% 산소를 공급하십시오.
3. 마취 소생술
   1. 강아지를 38°C 가열 플랫폼에 놓습니다. 활력으로 완전히 깨어난 후 새끼를 수유 중인 어미에게 돌려보냅니다. 전체 절차는 약 15분 동안 지속됩니다.
      참고: 본 연구에서 가짜 그룹은 천공 단계를 제외하고는 동일한 절차를 거칩니다.

3. 누공의 초음파 확인

참고: 초음파 장치의 일반적인 작동은 이전 보고서^18,19와 동일했다.

1. 복부 초음파로 누공 확인
   1. 마취 유도 후(2.1.1 단계) 테이프 스트립으로 마우스를 따뜻한 플랫폼의 누운 자세에 고정합니다. 그런 다음 초음파 젤을 사용하여 생쥐를 심전도(ECG) 모니터에 연결합니다. 0.8L/min 유량으로 1.5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다.
   2. 제모 크림을 사용하여 가슴과 복부 피부를 정돈합니다. 몇 초 후 따뜻한 물에 적신 면 끝으로 크림을 제거합니다. 변환기(24MHz)를 복부 중간에 놓고 변환기 마커를 마우스의 머리로 돌립니다.
   3. 플랫폼을 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하고 B-모드 및 컬러 도플러 모드를 사용하여 혈관 및 혈액 신호의 장축 보기를 시각화합니다(^18,19). AA, IVC, 누공의 혈류속도를 측정하여 펄스파 도플러 모드를 통해 AVF 개통성을 확인합니다.
      참고: 초음파에서 성공적인 누공 생성은 AA와 IVC 사이에서 볼 수 있는 난류 흐름 신호로 표시되었습니다(그림 2C). AVF 부위의 도플러 혈류 속도는 AA의 수축기 속도가 상대적으로 낮은 것에 비해 상당히 높았습니다(그림 2A,C). 또한, IVC의 정상적인 혈류 패턴(그림 2B)과 대조적으로, AVF에 근접한 IVC 혈류의 박동성 파형도 누공의 성공적인 생성을 확인했습니다(그림 2D).
2. 심초음파에 의한 VO 확인
   1. 플랫폼의 꼬리 끝 부분을 아래쪽으로 이동하고 변환기(24MHz)를 가슴에 놓고 변환기 마커를 마우스의 오른쪽 어깨로 돌립니다. B-모드와 컬러 도플러 모드를 사용하여 폐동맥(PA)의 수정된 흉골 주위 장축 보기를 시각화합니다.
   2. 펄스 웨이브 도플러 모드를 사용하여 속도 시간 적분(PA-VTI), PA 판막의 직경(PAD), 폐동맥 가속 시간(PAT) 및 RV 배출 시간(RVET)을 포함한 PA의 혈류 신호를 측정합니다(그림 2E, F 및 그림 3A, B).
   3. 세 번의 연속 측정의 평균에서 초음파 파라미터를 측정합니다. 다음 공식²⁰을 사용하여 RV 스트로크 부피(RVSV, mL) 및 RV 수축기 혈압(RVSP, mmHg)을 계산합니다.
      RVSV [mL] = 1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - 지수 + 63.7
      참고: 초음파 측정 바이어스를 고려할 때, 가짜 그룹의 마우스에 비해 VO 마우스의 RVSV 또는 VTI_PA에서 >15%의 증가는 RV에서 VO로 간주되었습니다(그림 2E,F).

결과

3개월 이내 생존율 및 AVF 개통성
VO 그룹의 총 30마리(75%)의 마우스와 가짜 그룹의 19마리(95%)의 마우스가 AVF 수술에서 살아남았습니다(그림 4A). VO 투여군에서는 8마리의 마우스가 과다출혈(n=5) 또는 자기잠식(n=3)으로 수술 후 1일 이내에 사망한 반면, 2마리의 마우스는 1개월에 원인 불명으로 사망했다.

생존한 VO 마우스(n=30) 중 초음파를 통해...

토론

이전에, 고전적인 RV VO 모델은 밸브 역류(²¹)를 사용하여 생성되었다. 그러나 AVF와 비교할 때 심장 절개 판막 수술은 더 정교한 기술이 필요할 수 있으며 특히 출생 후 쥐에서 훨씬 더 높은 사망률과 관련될 수 있습니다. 동물 연구에서 AVF²²에 의해 VO와 동일한 효과가 달성된 것으로 나타났기 때문에 이 연구에서는 외상이 적은 변형된 복부 누공 수술이 사용되었?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400