Etablissement et confirmation d’un modèle murin de surcharge du volume ventriculaire droit postnatal

Résumé

Ce protocole présente l’établissement et la confirmation d’un modèle de surcharge du volume ventriculaire droit postnatal chez la souris atteinte de fistule artérioveineuse abdominale (FAV), qui peut être appliqué pour étudier comment la VO contribue au développement cardiaque postnatal.

Résumé

La surcharge volumique ventriculaire droite (RV) est fréquente chez les enfants atteints de cardiopathie congénitale. Compte tenu des stades de développement distincts, le myocarde RV peut répondre différemment à la VO chez les enfants par rapport aux adultes. La présente étude vise à établir un modèle de VO RV postnatale chez la souris à l’aide d’une fistule artérioveineuse abdominale modifiée. Pour confirmer la création de VO et les changements morphologiques et hémodynamiques suivants du RV, une échographie abdominale, une échocardiographie et une coloration histochimique ont été effectuées pendant 3 mois. En conséquence, la procédure chez les souris postnatales a montré un taux de survie et de réussite de la fistule acceptable. Chez les souris VO, la cavité RV a été élargie avec une paroi libre épaissie, et le volume d’AVC a été augmenté d’environ 30% à 40% dans les 2 mois suivant la chirurgie. Par la suite, la pression systolique du RV a augmenté, une régurgitation valvulaire pulmonaire correspondante a été observée et un remodelage de la petite artère pulmonaire est apparu. En conclusion, la chirurgie de la fistule artérioveineuse modifiée (FAV) est réalisable pour établir le modèle RV VO chez les souris postnatales. Compte tenu de la probabilité de fermeture de la fistule et d’une résistance élevée de l’artère pulmonaire, une échographie abdominale et une échocardiographie doivent être effectuées pour confirmer l’état du modèle avant l’application.

Introduction

La surcharge volumique ventriculaire droite (RV) est fréquente chez les enfants atteints de cardiopathie congénitale (CHD), ce qui entraîne un remodelage myocardiologique pathologique et un mauvais pronostic à long terme ^1,2,3. Une compréhension approfondie du remodelage du VR et des interventions ciblées précoces connexes est essentielle pour obtenir de bons résultats chez les enfants atteints de coronaropathie. Il existe plusieurs différences dans les structures moléculaires, les fonctions physiologiques et les réponses aux stimuli dans le cœur des adultes et des enfants 1,4,5,6. Par exemple, sous l’influence d’une surcharge de pression, la prolifération des cardiomyocytes est la réponse principale dans les cœurs néonatals, tandis que la fibrose se produit dans les cœurs adultes ^5,6. De plus, de nombreux médicaments efficaces dans le traitement de l’insuffisance cardiaque chez l’adulte n’ont aucun effet thérapeutique sur l’insuffisance cardiaque chez l’enfant et peuvent même causer d’autres dommages ^7,8. Par conséquent, les conclusions tirées des animaux adultes ne peuvent pas être directement appliquées aux jeunes animaux.

Le modèle de la fistule artérioveineuse (FAV) a été utilisé pendant des décennies pour induire une VO cardiaque chronique et un dysfonctionnement cardiaque correspondant chez des animaux adultes de différentes espèces 9,10,11,12,13. Cependant, on sait peu de choses sur le modèle chez les souris postnatales. Dans nos études précédentes, un modèle murin postnatal VO a été généré avec succès par la création d’une FAV abdominale. La modification de la voie de développement de la RV dans le cœur postnatal a également été démontrée^14,15,16,17.

Afin d’explorer le processus chirurgical modifié sous-jacent et les caractéristiques du présent modèle, un protocole détaillé est présenté ; Le modèle est évalué pendant 3 mois dans cette étude.

Protocole

Toutes les procédures présentées ici étaient conformes aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki et ont été approuvées par le Comité du bien-être animal et des études humaines du Centre médical pour enfants de Shanghai (SCMC-LAWEC-2023-003). Des chiots souris C57BL/6 (P7, mâles, 3-4 g) ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Les bébés souris et leurs mères allaitantes (chiots : mères = 6 :1 dans une seule cage) ont été maintenus dans des conditions de laboratoire exemptes d’agents pathogènes spécifiques sous un cycle de lumière et d’obscurité de 12 h à 22 ± 2 °C avec un accès gratuit à l’eau et à un régime nutritionnel. Les chiots ont été randomisés en deux groupes : un groupe VO et un groupe simulé (simulacre).

1. Préparation de l’équipement et des outils chirurgicaux

REMARQUE : Les détails commerciaux de tous les matériaux/équipements sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Assurez-vous que les types d’équipement suivants sont prêts et fonctionnent correctement : table d’opération (panneau en plastique mousse), appareil d’anesthésie par inhalation, microscope avec éclairage vertical et caméra intégrée, appareil à ultrasons avec transducteur de 24 MHz et plate-forme de chauffage thermostatique.
2. Stérilisez les instruments chirurgicaux (c.-à-d. un porte-aiguille, une pince à pointe fine et des ciseaux à ressort Vannas à manche rond).
3. Assemblez les consommables suivants : aiguilles de suture chirurgicales 11-0 et 9-0 (pointe conique) avec fil, bandes adhésives, aiguilles de seringue de 5 ml, soie 2-0 (fixation chirurgicale), cotons-tiges stériles et gel à ultrasons.
4. Assurez-vous que les réactifs suivants sont présents : bétadine, éthanol à 70 %, solution saline stérile normale, isoflurane, acétaminophène, pommade ophtalmique et crème dépilatoire.

2. Intervention chirurgicale

REMARQUE : La procédure de chirurgie de la fistule a été modifiée selon la méthode décrite précédemment¹¹. La figure 1 montre un diagramme schématique de l’opération de la FAV chez les souris postnatales.

1. Anesthésie et contention
   1. Placez les chiots souris dans une boîte d’induction d’anesthésie alimentée en isoflurane/oxygène à 2 % pendant 2 min avec un débit réglé sur 1 L/min. Administrer de l’acétaminophène (0,1 ml PO de 80 mg/2,5 ml) à l’aide d’une seringue antituberculeuse.
   2. Placez les chiots en décubitus dorsal sur la table d’opération avec inhalation nasale d’isoflurane à 1,5 % avec un débit de 0,8 L/min pour maintenir l’anesthésie. Ajustez la position du chiot en attachant les pattes aux aiguilles de seringue fixes. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux des chiots pour prévenir la dessiccation de la cornée.
   3. Pincez la queue du chiot anesthésié pour vérifier sa réactivité à la douleur ; Aucun mouvement corporel évident n’indique une anesthésie adéquate.
2. Chirurgie de la fistule
   1. Désinfectez la peau avec trois gommages alternés de bétadine et d’éthanol à 70 %, puis drapez le site chirurgical. Coupez la paroi abdominale et le péritoine du bas-ventre au sous-xiphoïde pour exposer complètement la cavité péritonéale, en prenant soin de ne pas blesser les organes abdominaux. Versez une solution saline stérile normale pour humidifier les organes extériorisés.
   2. Retirez doucement le tractus gastro-intestinal et la vessie du site chirurgical à l’aide de cotons-tiges pour visualiser l’aorte abdominale verticale (AA) et la veine cave inférieure (IVC) sous le rétropéritoine. Faites pivoter la table d’opération de 90° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et ajustez le grossissement du microscope pour visualiser clairement les deux vaisseaux horizontaux.
   3. Ponctionner la fistule de l’AA dans l’IVC dans une direction oblique de 1 cm distale par rapport à l’artère rénale avec une aiguille de suture 11-0 (diamètre = 0,07 mm). Vérifier la création réussie de la fistule en fonction de l’enflure et du mélange du sang veineux et artériel dans la CIV.
   4. Ensuite, comprimez rapidement le point de saignement à l’aide d’une force appropriée appliquée avec des cotons-tiges secs pendant 15 s. Replacez l’estomac, les intestins et la vessie dans la cavité abdominale dès que possible pour favoriser la compression hémostatique.
   5. Suturez la paroi abdominale et le péritoine avec un point de couverture à l’aide d’un fil de suture 9-0. Arrêtez l’anesthésie et fournissez aux chiots 100% d’oxygène pendant 1 min.
3. Réanimation sous anesthésie
   1. Placez les chiots sur une plate-forme chauffante à 38 °C. Après un réveil complet avec vitalité, remettez les chiots à leur mère allaitante. L’ensemble de la procédure dure environ 15 min.
      NOTE : Dans la présente étude, le groupe fictif subit la même procédure, à l’exception de l’étape de ponction.

3. Confirmation échographique de la fistule

NOTA : Le fonctionnement général de l’appareil à ultrasons était identique à celui des rapports précédents^18,19.

1. Confirmation de la fistule par échographie abdominale
   1. Après l’induction de l’anesthésie (étape 2.1.1), fixez les souris avec des bandes de ruban adhésif en position couchée sur le dos sur la plate-forme chaude. Ensuite, connectez les souris à un moniteur d’électrocardiogramme (ECG) avec du gel à ultrasons. Maintenir l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 % à un débit de 0,8 L/min.
   2. Préparez la peau de la poitrine et de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire. Après quelques secondes, retirez la crème à l’aide d’un coton imbibé d’eau tiède. Placez le transducteur (24 MHz) sur la ligne médio-abdominale et faites pivoter le marqueur du transducteur sur la tête des souris.
   3. Déplacez la plate-forme vers le bas vers le côté gauche ou droit des souris et utilisez le mode B et le mode Doppler couleur pour visualiser la vue grand axe des vaisseaux et des signaux sanguins^18,19. Mesurez la vitesse du flux sanguin de l’AA, de l’IVC et de la fistule pour confirmer la perméabilité de l’AVF en mode Doppler à ondes pulsées.
      REMARQUE : La création réussie d’une fistule à l’échographie a été indiquée par un signal d’écoulement turbulent visible entre l’AA et l’IVC (Figure 2C). La vitesse du flux sanguin Doppler au site de la FAV était significativement élevée par rapport à une vitesse systolique relativement plus faible dans l’AA (Figure 2A,C). De plus, contrairement aux schémas d’écoulement normaux dans l’IVC (Figure 2B), la forme d’onde pulsatile du flux sanguin IVC à proximité de l’AVF a également confirmé la création réussie de la fistule (Figure 2D).
2. Confirmation de la VO par échocardiographie
   1. Déplacez la partie arrière de la plate-forme vers le bas, placez le transducteur (24 MHz) sur la poitrine et faites pivoter le marqueur du transducteur sur l’épaule droite des souris. Visualisez la vue parasternale modifiée de l’artère pulmonaire (PA) à l’aide du mode B et du mode Doppler couleur.
   2. À l’aide du mode Doppler à ondes pulsées, mesurez les signaux de flux sanguin dans le PA, y compris l’intégrale de temps de vitesse (PA-VTI), le diamètre de la valve PA (PAD), le temps d’accélération artérielle pulmonaire (PAT) et le temps d’éjection RV (RVET) (Figure 2E, F et Figure 3A, B).
   3. Mesurez les paramètres échographiques à partir de la moyenne de trois mesures consécutives. Calculer le volume d’AVC (RVSV, mL) et la pression systolique RV (RVSP, mmHg) à l’aide des formules suivantes²⁰ :
      RVSV [mL] = 1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - indice + 63,7
      REMARQUE : Compte tenu du biais de mesure des ultrasons, une augmentation de >15 % de_l’AP RVSV ou VTI chez les souris VO par rapport aux souris du groupe fictif a été considérée comme VO dans le RV (Figure 2E, F).

Résultats

Taux de survie et perméabilité de la FAV dans les 3 mois
Au total, 30 souris (75 %) du groupe VO et 19 (95 %) souris du groupe simulé ont survécu à la chirurgie de la FAV (Figure 4A). Dans le groupe VO, huit souris sont mortes dans un délai d’un jour après la chirurgie en raison d’un saignement excessif (n = 5) ou d’une cannibalisation (n = 3), tandis que deux souris sont mortes de causes inconnues à 1 mois.

Parmi les souris VO su...

Discussion

Auparavant, le modèle RV VO classique était créé à l’aide de la régurgitation de la valve²¹ ; cependant, par rapport à la FAV, la chirurgie valvulaire à cœur ouvert peut nécessiter des techniques plus sophistiquées et peut être associée à une mortalité significativement plus élevée, en particulier chez les souris postnatales. Comme des études animales ont montré que le même effet de VO a été obtenu par AVF²², la chirurgie modifiée de la fistule abdo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400