Etablierung und Bestätigung eines postnatalen Mausmodells mit rechtsventrikulärer Volumenüberlastung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Etablierung und Bestätigung eines postnatalen Modells der rechtsventrikulären Volumenüberlastung (VO) bei Mäusen mit abdominaler arteriovenöser Fistel (AVF) dar, das angewendet werden kann, um zu untersuchen, wie VO zur postnatalen Herzentwicklung beiträgt.

Zusammenfassung

Eine rechtsventrikuläre (RV) Volumenüberlastung (VO) tritt häufig bei Kindern mit angeborenen Herzfehlern auf. Aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien kann das RV-Myokard bei Kindern anders auf VO reagieren als bei Erwachsenen. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein postnatales RV-VO-Modell in Mäusen unter Verwendung einer modifizierten abdominalen arteriovenösen Fistel zu etablieren. Um die Entstehung der VO und die folgenden morphologischen und hämodynamischen Veränderungen des RV zu bestätigen, wurden 3 Monate lang abdominelle Ultraschalluntersuchungen, Echokardiographie und histochemische Färbungen durchgeführt. Infolgedessen zeigte das Verfahren bei postnatalen Mäusen eine akzeptable Überlebens- und Fistelerfolgsrate. Bei VO-Mäusen war der RV-Hohlraum mit einer verdickten freien Wand vergrößert und das Schlagvolumen wurde innerhalb von 2 Monaten nach der Operation um etwa 30%-40% erhöht. Danach stieg der systolische Druck der RV an, es wurde eine entsprechende Pulmonalklappeninsuffizienz beobachtet und es trat ein Remodeling der kleinen Pulmonalarterie auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine modifizierte arteriovenöse Fistelchirurgie (AVF) möglich ist, um das RV-VO-Modell in postnatalen Mäusen zu etablieren. Unter Berücksichtigung der Wahrscheinlichkeit eines Fistelverschlusses und eines erhöhten Lungenarterienwiderstands müssen vor der Anwendung Ultraschall des Abdomens und eine Echokardiographie durchgeführt werden, um den Modellstatus zu bestätigen.

Einleitung

Eine rechtsventrikuläre (RV) Volumenüberlastung (VO) ist bei Kindern mit angeborenen Herzfehlern (KHK) häufig, was zu einem pathologischen Myokardumbau und einer schlechten Langzeitprognose führt ^1,2,3. Ein tiefgreifendes Verständnis des RV-Umbaus und der damit verbundenen frühzeitigen gezielten Interventionen ist für ein gutes Ergebnis bei Kindern mit KHK unerlässlich. Es gibt mehrere Unterschiede in den molekularen Strukturen, physiologischen Funktionen und Reaktionen auf Reize im Herzen von Erwachsenen und Kindern 1,4,5,6. Unter dem Einfluss einer Drucküberlastung ist beispielsweise die Kardiomyozytenproliferation die Hauptreaktion bei neonatalen Herzen, während die Fibrose bei erwachsenen Herzen auftritt ^5,6. Darüber hinaus haben viele wirksame Medikamente zur Behandlung der Herzinsuffizienz bei Erwachsenen keine therapeutische Wirkung auf die Herzinsuffizienz bei Kindern und können sogar weitere Schäden verursachen ^7,8. Daher können Schlussfolgerungen, die von erwachsenen Tieren gezogen werden, nicht direkt auf Jungtiere übertragen werden.

Das Modell der arteriovenösen Fistel (AVF) wird seit Jahrzehnten verwendet, um bei erwachsenen Tieren verschiedener Spezies eine chronische Herz-VO und eine entsprechende kardiale Dysfunktion zu induzieren 9,10,11,12,13. Über das Modell bei postnatalen Mäusen ist jedoch wenig bekannt. In unseren bisherigen Studien wurde erfolgreich ein postnatales VO-Mausmodell durch die Erstellung einer abdominalen AVF generiert. Der veränderte RV-Entwicklungsverlauf im postnatalen Herzen wurde ebenfalls nachgewiesen^14,15,16,17.

Um den zugrundeliegenden modifizierten chirurgischen Prozess und die Eigenschaften des vorliegenden Modells zu untersuchen, wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt; Das Modell wird in dieser Studie für 3 Monate evaluiert.

Protokoll

Alle hier vorgestellten Verfahren entsprachen den in der Deklaration von Helsinki dargelegten Grundsätzen und wurden vom Ausschuss für Tierschutz und Humanstudien am Shanghai Children's Medical Center genehmigt (SCMC-LAWEC-2023-003). Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6 Mäusejungtiere (P7, Männchen, 3-4 g) verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Mäusejungtiere und ihre säugenden Mütter (Jungtiere:Mütter = 6:1 in einem Einzelkäfig) wurden unter spezifisch-pathogenfreien Laborbedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22 ± 2 °C mit freiem Zugang zu Wasser und einer Ernährungsdiät gehalten. Die Welpen wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: eine VO-Gruppe und eine scheinoperierte (Schein-)Gruppe.

1. Vorbereitung der Ausrüstung und des chirurgischen Werkzeugs

HINWEIS: Die kaufmännischen Details aller Materialien/Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Arten von Geräten einsatzbereit sind und ordnungsgemäß funktionieren: Operationstisch (Schaumstoffplatte), Inhalationsanästhesiegerät, Mikroskop mit vertikaler Beleuchtung und eingebauter Kamera, Ultraschallgerät mit einem 24-MHz-Wandler und thermostatische Heizplattform.
2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (z. B. einen Mikronadelhalter, eine Pinzette mit feiner Spitze und eine Vannas-Federschere mit rundem Griff).
3. Montieren Sie die folgenden Verbrauchsmaterialien: 11-0 und 9-0 chirurgische Nahtnadeln (Taper-Point) mit Faden, Klebestreifen, 5-ml-Spritzennadeln, 2-0 Seide (chirurgische Fixierung), sterile Wattestäbchen und Ultraschallgel.
4. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Reagenzien vorhanden sind: Betadin, 70% Ethanol, normale sterile Kochsalzlösung, Isofluran, Paracetamol, Augensalbe und Haarentfernungscreme.

2. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Das Verfahren der Fisteloperation wurde nach der zuvor beschriebenen Methode¹¹ modifiziert. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der AVF-Operation bei postnatalen Mäusen.

1. Anästhesie und Fixierung
   1. Legen Sie die Mäusebabys für 2 Minuten mit einem auf 1 l/min eingestellten Durchfluss in eine Anästhesie-Induktionsbox, die mit 2 % Isofluran/Sauerstoff versorgt wird. Paracetamol (0,1 ml PO von 80 mg/2,5 ml) mit einer TB-Spritze verabreichen.
   2. Legen Sie die Welpen in Rückenlage auf den Operationstisch mit nasaler Inhalation von 1,5% Isofluran mit einem Durchfluss von 0,8 l/min, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Passen Sie die Position des Welpen an, indem Sie die Beine an die festen Spritzennadeln binden. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Welpen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
   3. Kneifen Sie den Schwanz des betäubten Welpen, um seine Schmerzreaktion zu überprüfen. Keine offensichtlichen Körperbewegungen deuten auf eine ausreichende Anästhesie hin.
2. Fistel-OP
   1. Desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Peelings aus Betadin und 70%igem Ethanol und decken Sie dann die Operationsstelle ab. Schneiden Sie die Bauchdecke und das Bauchfell vom Unterbauch bis zum Subxiphoid durch, um die Bauchhöhle vollständig freizulegen, und achten Sie darauf, die Bauchorgane nicht zu verletzen. Tropfen Sie normale, sterile Kochsalzlösung, um die externalisierten Organe zu befeuchten.
   2. Ziehen Sie den Magen-Darm-Trakt und die Blase vorsichtig mit Wattestäbchen von der Operationsstelle weg, um die vertikale Bauchaorta (AA) und die untere Hohlvene (IVC) unter dem Retroperitoneum sichtbar zu machen. Drehen Sie den OP-Tisch um 90° gegen den Uhrzeigersinn und stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die beiden horizontalen Gefäße deutlich sichtbar sind.
   3. Die Fistel vom AA in die IVC wird in schräger Richtung 1 cm distal der Nierenarterie mit einer 11-0-Nahtnadel (Durchmesser = 0,07 mm) punktiert. Überprüfen Sie die erfolgreiche Fistelbildung anhand der Schwellung und Vermischung von venösem und arteriellem Blut in der IVC.
   4. Als nächstes wird die Blutungsstelle mit einer geeigneten Kraft, die mit trockenen Wattestäbchen 15 s lang ausgeübt wird, schnell komprimiert. Ersetzen Sie Magen, Darm und Blase in der Bauchhöhle so schnell wie möglich, um die hämostatische Kompression zu fördern.
   5. Vernähen Sie die Bauchdecke und das Bauchfell mit einem Blanketstich mit einem 9-0-Nahtfaden. Beenden Sie die Anästhesie und versorgen Sie die Welpen 1 Minute lang mit 100% Sauerstoff.
3. Anästhesie-Reanimation
   1. Legen Sie die Welpen auf eine 38 °C heiße Heizplattform. Nach einem vollständigen Erwachen mit Vitalität bringen Sie die Welpen zu ihrer säugenden Mutter zurück. Die gesamte Prozedur dauert ca. 15 Minuten.
      ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie durchläuft die Scheingruppe das gleiche Verfahren mit Ausnahme des Punktionsschritts.

3. Ultraschallbestätigung der Fistel

ANMERKUNG: Die allgemeine Funktionsweise des Ultraschallgeräts war identisch mit früheren Berichten^18,19.

1. Bestätigung der Fistel durch Ultraschall des Abdomens
   1. Nach der Narkoseeinleitung (Schritt 2.1.1) fixieren Sie die Mäuse mit Klebebandstreifen in Rückenlage auf der warmen Plattform. Schließen Sie die Mäuse dann an einen Elektrokardiogramm-Monitor (EKG) mit Ultraschallgel an. Halten Sie die Anästhesie mit 1,5 % Isofluran bei einem Durchfluss von 0,8 l/min aufrecht.
   2. Bereiten Sie die Brust- und Bauchhaut mit einer Haarentfernungscreme vor. Nach einigen Sekunden die Creme mit einem warmen, mit Wasser getränkten Wattestäbchen entfernen. Platzieren Sie den Schallkopf (24 MHz) auf der Mittelbauchlinie und drehen Sie den Schallkopfmarker zum Kopf der Mäuse.
   3. Bewegen Sie die Plattform nach unten auf die linke oder rechte Seite der Mäuse und verwenden Sie den B-Modus und den Farb-Doppler-Modus, um die Längsachsenansicht der Gefäße und Blutsignale zu visualisieren^18,19. Messen Sie die Blutflussgeschwindigkeit von AA, IVC und Fistel, um die AVF-Durchgängigkeit im gepulsten Wellen-Doppler-Modus zu bestätigen.
      HINWEIS: Die erfolgreiche Fistelbildung im Ultraschall wurde durch ein turbulentes Strömungssignal angezeigt, das zwischen AA und IVC sichtbar war (Abbildung 2C). Die Doppler-Blutflussgeschwindigkeit an der AVF-Stelle war im Vergleich zu einer relativ niedrigeren systolischen Geschwindigkeit in der AA signifikant erhöht (Abbildung 2A,C). Im Gegensatz zu den normalen Flussmustern in der IVC (Abbildung 2B) bestätigte die pulsierende Wellenform des IVC-Blutflusses proximal zur AVF auch die erfolgreiche Bildung der Fistel (Abbildung 2D).
2. Bestätigung der VO durch Echokardiographie
   1. Bewegen Sie den hinteren Teil der Plattform nach unten, legen Sie den Schallkopf (24 MHz) auf die Brust und drehen Sie den Schallkopfmarker zur rechten Schulter der Mäuse. Visualisieren Sie die modifizierte parasternale Längsachsenansicht der Pulmonalarterie (PA) im B-Modus und Farbdoppler-Modus.
   2. Messen Sie im gepulsten Wellen-Doppler-Modus die Blutflusssignale in der PA, einschließlich des Geschwindigkeitszeitintegrals (PA-VTI), des Durchmessers des PA-Ventils (PAD), der pulmonal-arteriellen Beschleunigungszeit (PAT) und der RV-Auswurfzeit (RVET) (Abbildung 2E, F und Abbildung 3A, B).
   3. Messen Sie die Ultraschallparameter aus dem Mittelwert von drei aufeinanderfolgenden Messungen. Berechnen Sie das RV-Hubvolumen (RVSV, mL) und den systolischen RV-Druck (RVSP, mmHg) mit den folgenden Formeln²⁰:
      RVSV [ml] =1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - Index + 63,7
      HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Verzerrung der Ultraschallmessung wurde ein Anstieg der RVSV oder VTI_PA um >15 % bei VO-Mäusen im Vergleich zu Mäusen in der Scheingruppe als VO in der RV angesehen (Abbildung 2E,F).

Ergebnisse

Überlebensrate und AVF-Durchgängigkeit innerhalb von 3 Monaten
Insgesamt 30 (75 %) Mäuse in der VO-Gruppe und 19 (95 %) Mäuse in der Scheingruppe überlebten die AVF-Operation (Abbildung 4A). In der VO-Gruppe starben acht Mäuse innerhalb eines Tages nach der Operation aufgrund von übermäßigen Blutungen (n = 5) oder Kannibalisierung (n = 3), während zwei Mäuse nach 1 Monat an unbekannten Ursachen starben.

Von den überlebenden VO-Mäus...

Diskussion

Zuvor wurde das klassische RV-VO-Modell mit Klappenaufstoßen²¹ erstellt; Im Vergleich zur AVF kann die Klappenoperation am offenen Herzen jedoch ausgefeiltere Techniken erfordern und mit einer signifikant höheren Mortalität verbunden sein, insbesondere bei postnatalen Mäusen. Da Tierstudien gezeigt haben, dass der gleiche Effekt der VO durch AVF²² erzielt wurde, wurde in dieser Studie eine modifizierte Bauchfistelchirurgie mit weniger Trauma verwendet.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400