Создание и подтверждение постнатальной модели мышиной перегрузки объема правого желудочка

Резюме

В этом протоколе представлено создание и подтверждение модели постнатальной объемной перегрузки (ВО) правого желудочка у мышей с брюшной артериовенозной фистулой (АВФ), которая может быть применена для изучения того, как ВО способствует постнатальному развитию сердца.

Аннотация

Объемная перегрузка правого желудочка (ПЖ) часто встречается у детей с врожденными пороками сердца. В связи с различными стадиями развития миокард ПЖ может по-разному реагировать на ВО у детей по сравнению со взрослыми. Целью настоящего исследования является создание постнатальной модели ПЖ ВО у мышей, использующих модифицированную брюшную артериовенозную фистулу. Для подтверждения создания ВО и последующих морфологических и гемодинамических изменений ПЖ в течение 3 мес выполняли УЗИ брюшной полости, эхокардиографию, гистохимическое окрашивание. В результате процедура на постнатальных мышах показала приемлемую выживаемость и успешность лечения фистулы. У мышей VO полость ПЖ была увеличена с утолщенной свободной стенкой, а ударный объем увеличился примерно на 30%-40% в течение 2 месяцев после операции. После этого систолическое давление ПЖ повышалось, наблюдалась соответствующая регургитация легочного клапана, возникало ремоделирование малой легочной артерии. В заключение, модифицированная операция артериовенозной фистулы (АВФ) осуществима для создания модели RV VO у постнатальных мышей. Учитывая вероятность закрытия свища и повышенного сопротивления легочной артерии, перед применением необходимо выполнить УЗИ брюшной полости и эхокардиографию для подтверждения статуса модели.

Введение

Объемная перегрузка правого желудочка (ПЖ) часто встречается у детей с врожденными пороками сердца (ВПС), что приводит к патологическому ремоделированию миокарда и неблагоприятному долгосрочному прогнозу ^1,2,3. Глубокое понимание ремоделирования ПЖ и связанных с этим ранних целенаправленных вмешательств имеет важное значение для хорошего исхода у детей с ИБС. Существует несколько различий в молекулярных структурах, физиологических функциях и реакциях на раздражители в сердцах взрослых и детей 1,4,5,6. Например, под влиянием перегрузки давлением пролиферация кардиомиоцитов является основной реакцией в сердцах новорожденных, тогда как фиброз возникает в сердцах взрослых ^5,6. Кроме того, многие эффективные препараты для лечения сердечной недостаточности у взрослых не оказывают терапевтического эффекта на сердечную недостаточность у детей и даже могут вызвать дальнейшее повреждение ^7,8. Поэтому выводы, сделанные на взрослых животных, не могут быть непосредственно применены к молодняку.

Модель артериовенозной фистулы (АВФ) использовалась для индуцирования хронического сердечного ВО и соответствующей сердечной дисфункции в течение десятилетий у взрослых животных разных видов 9,10,11,12,13. Тем не менее, мало что известно об этой модели на постнатальных мышах. В наших предыдущих исследованиях постнатальная мышиная модель VO была успешно сгенерирована путем создания брюшного АВФ. Также было продемонстрировано изменение траектории развития ПЖ в постнатальном периоде^сердца 14,15,16,17.

Для изучения основного модифицированного хирургического процесса и характеристик данной модели представлен подробный протокол; В этом исследовании модель оценивается в течение 3 месяцев.

протокол

Все процедуры, представленные здесь, соответствовали принципам, изложенным в Хельсинкской декларации, и были одобрены Комитетом по благополучию животных и изучению человека в Шанхайском детском медицинском центре (SCMC-LAWEC-2023-003). Для настоящего исследования использовали детенышей мышей C57BL/6 (P7, самцы, 3-4 г). Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей и их кормящие матери (щенки:матери = 6:1 в одной клетке) содержались в лабораторных условиях, свободных от специфических патогенов, в 12-часовом цикле света и темноты при температуре 22 ± 2 °C со свободным доступом к воде и питательной диетой. Детеныши были рандомизированы в две группы: группу VO и группу с фиктивным управлением (sham).

1. Подготовка оборудования и хирургического инструмента

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные обо всех материалах/оборудовании перечислены в Таблице материалов.

1. Убедитесь в готовности и исправном функционировании следующих видов оборудования: операционный стол (пенопластовая панель), аппарат ингаляционной анестезии, микроскоп с вертикальной подсветкой и встроенной камерой, ультразвуковой аппарат с датчиком 24 МГц, термостатическая нагревательная платформа.
2. Простерилизуйте хирургические инструменты (например, микроиглодержатель, щипцы с тонким наконечником и пружинные ножницы Vannas с круглой ручкой).
3. Соберите следующие расходные материалы: хирургические шовные иглы 11-0 и 9-0 (конусная точка) с ниткой, полоски ленты, иглы для шприцев по 5 мл, шелк 2-0 (хирургическая фиксация), стерильные ватные палочки и гель для УЗИ.
4. Убедитесь в присутствии следующих реагентов: бетадин, 70% этанол, обычный стерильный физиологический раствор, изофлуран, ацетаминофен, офтальмологическая мазь и крем для удаления волос.

2. Хирургическое вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура операции по удалению фистулы была модифицирована в соответствии с ранее описанным методом¹¹. На рисунке 1 показана принципиальная схема работы АВФ у мышей в постнатальном периоде.

1. Анестезия и фиксация
   1. Поместите детенышей мышей в бокс для индукционной анестезии, снабженный 2% изофлураном/кислородом, на 2 минуты с расходом, установленным на 1 л/мин. Ввести парацетамол (0,1 мл перорально 80 мг/2,5 мл) с помощью противотуберкулезного шприца.
   2. Поместите щенков в положение лежа на спине на операционном столе с назальной ингаляцией 1,5% изофлурана с потоком 0,8 л/мин для поддержания анестезии. Отрегулируйте положение щенка, привязав лапки к неподвижным иглам шприца. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза щенков, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
   3. Ущипните щенка за хвост под наркозом, чтобы проверить его реакцию на боль; Отсутствие явных движений тела указывает на адекватную анестезию.
2. Хирургия свища
   1. Продезинфицируйте кожу тремя чередующимися скрабами из бетадина и 70% этанола, а затем накройте место операции. Разрежьте брюшную стенку и брюшину от нижней части живота до субксифоидной, чтобы полностью обнажить брюшную полость, стараясь не травмировать органы брюшной полости. Закапать обычный стерильный физиологический раствор для увлажнения наружных органов.
   2. Осторожно оттяните желудочно-кишечный тракт и мочевой пузырь от места операции с помощью ватных тампонов, чтобы визуализировать вертикальную брюшную аорту (АА) и нижнюю полую вену (НПВ) под забрюшинным пространством. Поверните операционный стол на 90° против часовой стрелки и отрегулируйте увеличение микроскопа, чтобы четко визуализировать два горизонтальных сосуда.
   3. Пункцию свища из АА в НПВ в косом направлении на 1 см дистальнее почечной артерии шовной иглой 11-0 (диаметр = 0,07 мм). Проверка успешного создания фистулы на основе набухания и смешивания венозной и артериальной крови в НПВ.
   4. Затем быстро сожмите место кровотечения с соответствующей силой с помощью сухих ватных тампонов в течение 15 с. Как можно скорее замените желудок, кишечник и мочевой пузырь в брюшной полости, чтобы способствовать гемостатической компрессии.
   5. Зашить брюшную стенку и брюшину общим швом с использованием шовной нити 9-0. Прекратите анестезию и обеспечьте щенкам 100% кислород в течение 1 минуты.
3. Анестезиологическая реанимация
   1. Поместите щенков на нагревательную платформу с температурой 38 °C. После полного пробуждения с жизненной силой верните детенышей кормящей матери. Вся процедура длится около 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании фиктивная группа подвергается той же процедуре, за исключением этапа прокалывания.

3. Ультразвуковое подтверждение свища

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая работа ультразвукового аппарата была идентична предыдущим отчетам^18,19.

1. Подтверждение свища с помощью УЗИ брюшной полости
   1. После индукции анестезии (шаг 2.1.1) зафиксируйте мышей ленточными полосками в положении лежа на спине на теплой платформе. Затем подключите мышей к монитору электрокардиограммы (ЭКГ) с гелем для УЗИ. Поддерживайте анестезию с использованием 1,5% изофлурана при потоке 0,8 л/мин.
   2. Подготовьте кожу груди и живота с помощью крема для депиляции. Через несколько секунд удалите крем с помощью теплого ватного наконечника, смоченного в воде. Поместите датчик (24 МГц) на среднебрюшную линию и поверните маркер датчика к голове мышей.
   3. Переместите платформу влево или вправо от мышей и используйте B-режим и режим цветного допплера для визуализации изображения сосудов и сигналов крови по длинной оси^18,19. Измерьте скорость кровотока в АА, НПВ и фистуле для подтверждения проходимости АВФ в режиме импульсно-волновой допплерографии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На успешное создание фистулы на УЗИ указывал сигнал турбулентного потока, видимый между АА и НПВ (рис. 2C). Допплеровская скорость кровотока в месте АВФ была значительно повышена по сравнению с относительно более низкой систолической скоростью в АА (рис. 2А, В). Более того, в отличие от нормальных паттернов кровотока в НПВ (рис. 2B), пульсирующая форма волны кровотока НПВ проксимальнее АВФ также подтвердила успешное создание фистулы (рис. 2D).
2. Подтверждение ВО с помощью эхокардиографии
   1. Сдвиньте хвостовую часть платформы вниз, поместите датчик (24 МГц) на грудную клетку и поверните маркер датчика к правому плечу мыши. Визуализируйте модифицированный парастернальный вид легочной артерии (ПА) по длинной оси с использованием B-режима и режима цветной допплерографии.
   2. Используя режим импульсно-волновой допплерографии, измеряйте сигналы кровотока в ПА, включая интеграл скорости во времени (PA-VTI), диаметр клапана PA (PAD), время ускорения легочной артерии (PAT) и время выброса ПЖ (RVET) (рис. 2E,F и рис. 3A,B).
   3. Измеряют параметры ультразвука по среднему значению трех последовательных измерений. Рассчитайте ударный объем ПЖ (ПЖ, мл) и систолическое давление ПЖ (ПЖ, мм рт. ст.) по следующим формулам²⁰:
      RVSV [мл] =1/4 × πD² × VTI_PA
      РВСП [мм рт.ст.] = -83,7 × PAT/RVET - индекс + 63,7
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая во внимание смещение ультразвуковых измерений, увеличение на >15% RVSV или VTI_PA у мышей VO по сравнению с мышами в фиктивной группе считалось VO в RV (рис. 2E, F).

Результаты

Выживаемость и проходимость АВФ в течение 3 месяцев
В общей сложности 30 (75%) мышей в группе VO и 19 (95%) мышей в фиктивной группе пережили операцию AVF (рис. 4A). В группе VO восемь мышей умерли в течение 1 дня после операции из-за чрезмерного кровотечения (n = 5) или канниба?...

Обсуждение

Ранее классическая модель RV VO создавалась с использованием клапанной регургитации²¹; однако, по сравнению с АВФ, операция на открытом клапане сердца может потребовать более сложных методов и может быть связана со значительно более высокой смертностью, особенно у постнатал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400