Tuina en un modelo de rata de hombro congelado: un protocolo eficiente y reproducible

Resumen

Este estudio desarrolla un protocolo de Tuina eficiente y reproducible para el tratamiento de la paleta congelada establecido en un modelo de rata. Este enfoque ayudará a estudiar el método de tratamiento de la terapia Tuina para los hombros congelados.

Resumen

El hombro congelado (FS) es una afección común sin una terapia óptima definida. La terapia Tuina, una técnica de medicina tradicional china (MTC) utilizada para tratar a pacientes con SF en hospitales chinos, ha demostrado excelentes resultados, pero sus mecanismos no se comprenden completamente. Sobre la base de un estudio previo, este trabajo tuvo como objetivo desarrollar un protocolo Tuina para un modelo de rata FS. Dividimos aleatoriamente 20 ratas SD en grupos control (C; n = 5), modelo FS (M; n = 5), tratamiento Tuina modelo FS (MT; n = 5) y tratamiento oral modelo FS (MO; n = 5). En este estudio se utilizó el método de inmovilización con yeso para establecer el modelo de rata FS. Se evaluó el efecto de Tuina y dexametasona oral sobre el rango de movimiento glenohumeral (ROM) y se evaluaron los hallazgos histológicos. Nuestro estudio demostró que Tuina y la dexametasona oral fueron capaces de mejorar el ROM activo del hombro y preservar la estructura de la cápsula, demostrando ser la terapia con Tuina más eficaz que la dexametasona oral. En conclusión, el protocolo de Tuina establecido en este estudio fue altamente efectivo para el SF.

Introducción

El hombro congelado (FS), también conocido como capsulitis adhesiva del hombro, es una enfermedad autolimitada caracterizada por dolor de hombro y déficits de movilidad. Suele afectar a personas de entre 30 y 70 años, con una edad media de 50 años, y tiene una prevalencia de alrededor del 5% en la población china¹. Se ha reportado que las mujeres tienen una incidencia 1,6 veces mayor de SF en comparación con los hombres². La prevalencia de SF es mayor en personas con diabetes, trastornos del metabolismo de la glucosa y los lípidos u otras enfermedades relacionadas, oscilando entre el 10% y el 36%^2,3. Los tratamientos clínicos actuales para el SF incluyen fisioterapia, medicamentos esteroides y tratamientos quirúrgicos⁴.

Se ha demostrado que la tuina, una terapia de medicina tradicional china (MTC), alivia eficazmente el dolor de hombro en pacientes con SF, mejorando su calidad de vida ^5,6. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de este tratamiento no se comprenden bien. Por lo tanto, el uso de modelos animales para estudiar los efectos y mecanismos de Tuina en el tratamiento del SF es crucial.

La articulación del hombro de rata tiene una estructura compleja similar a la del hombro humano y se utiliza a menudo en estudios mecanicistas de FS⁷. El modelo de rata FS se caracteriza por una disminución del ROM glenohumeral y de la fibrosis de la cápsula⁸. Además, este modelo permite la observación de la cápsula del hombro y posibilita la investigación patológica en la reparación de la lesión⁹. Además, los corticoides orales se utilizan a menudo como grupo control en la investigación sobre el tratamiento del SF¹⁰. Este estudio tiene como objetivo desarrollar un protocolo de Tuina para el modelo de rata FS y demuestra la viabilidad de realizar experimentos con animales en la investigación de Tuina comparando la eficacia de la terapia con Tuina y la dexametasona oral.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (Número: AWE-2022-023).

1. Animales de experimentación

1. Veinte ratas macho Sprague-Dawley (SD) (7 semanas de edad, 250-280 g) se alojaron en condiciones estándar (temperatura ambiente [RT] 20-24 °C, humedad 40%-60% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h).

2. Método de agrupación

1. Agrupe las ratas SD en el grupo control (C), el grupo control modelo FS (M), el grupo de tratamiento Tuina modelo FS (MT) y el grupo de tratamiento oral modelo FS (MO), cada uno de los cuales consta de 5 ratas. Mantenga 5 ratas por jaula (mismo grupo).
2. Después de 7 días de aclimatación, inmovilice un hombro de las ratas de los grupos M, MT y MO utilizando inmovilización con yeso durante 3 semanas para imitar el FS como se describe en la siguiente sección.
3. Administrar el tratamiento con Tuina a las ratas del grupo MT durante 2 semanas, tal y como se describe en la sección 4 (Figura 1).
4. Calcule la dosis requerida de dexametasona por cada kilogramo de ratas (0,0675 mg/día) en función de la dosis para adultos (0,75 mg/día) y la relación entre la superficie de la rata y el cuerpo humano (0,018).
5. Administrar diariamente una solución de dexametasona intragástrica a ratas del grupo MO a 0,067 mg/kg/día a las 7:00 AM durante 2 semanas.
   NOTA: Utilice este método de agrupación para confirmar el efecto del protocolo Tuina en este estudio. Realizar el método de agrupamiento según fines experimentales en diferentes estudios.

3. Desarrollo del modelo del servicio fijo

1. Anestesiar ratas con tribromoetanol (250 mg/kg, por inyección intraperitoneal)¹¹.
   NOTA: De acuerdo con los requisitos del comité de ética de la institución, se almacenó a 4 °C una solución madre compuesta por tribomoetanol (10 g) y alcohol terc-amílico (10 mL).  Antes de su uso, se diluyó al 2% con agua destilada.
2. Aplicar vendajes empapados de yeso en el hombro derecho y el pecho de las ratas, manteniendo la extremidad anterior derecha a 90° de rotación interna de la articulación del hombro durante 3 semanas (Figura 2)¹².
   NOTA: Vigile a las ratas para asegurarse de que puedan realizar actividades fisiológicas normales, como caminar, comer y beber. Vuelva a colocar el vendaje de yeso si las ratas no pueden realizar actividades fisiológicas normales.
3. Confirmar el establecimiento exitoso del modelo FS mediante la observación del desarrollo de síntomas como rigidez en la articulación del hombro derecho, contracción de la extremidad superior derecha, atrofia muscular y cojera en ratas¹³.

4. Método Tuina

NOTA: Durante todo el procedimiento, el investigador debe usar equipo de protección personal. Solo un médico profesional de Tuina debe realizar todas las manipulaciones (Figura 3, Figura 4 y Figura 5).

1. Entrene mediante el sistema de determinación de parámetros de la técnica de masaje inteligente, que incluye un mecanorreceptor y una computadora (Figura 3A).
   1. Realice manipulaciones en el mecanorreceptor y fuerce los parámetros en tres direcciones que se muestran a través del software (Figura 3B).
   2. Utilice el dedo pulgar para realizar el método de amasamiento rotatorio en un movimiento rotatorio con una fuerza de 0,5 kg y una frecuencia de 100-120 veces/min (Figura 3C).
   3. Utilice la yema del dedo pulgar para realizar el método de presión puntual con una fuerza de 0,5 kg (Figura 3D).
   4. Realice Tuina en las ratas manteniendo la pantalla mecánica mencionada en los pasos 4.1.2 y 4.1.3 durante 1 min.
2. Sostén a la rata hasta que se calme (~2 min). A continuación, realice la manipulación. Coloque a la rata en posición recostada lateralmente, pero la posición puede cambiar según los diferentes métodos de manipulación.
3. Use el dedo índice y el dedo medio derecho para sujetar la extremidad delantera derecha de la rata y flexionarla y extenderla varias veces para determinar las posiciones de la articulación del hombro, la articulación del codo y el húmero de la rata.
4. Amasar el hombro derecho, la extremidad delantera y la espalda de la rata rotándola en el sentido de las agujas del reloj con la pulpa del pulgar a una fuerza de 0,5 kg y una frecuencia de 100-120 veces/min durante 3 min (Figura 4A-C).
   1. Manipule los músculos de las extremidades anteriores en posición lateral recostada.
   2. Manipule los músculos de los hombros y la espalda en posición prona.
5. Presione el punto de acupuntura LI15 (Jianyu), SI11 (Tianzong), HT01 (Jiquan) y LI11 (Quchi) verticalmente con la yema del dedo pulgar 30 veces por punto de acupuntura a una fuerza de 0,5 kg (Figura 4D-G).
   1. Utilice el atlas de ratas y puntos de acupuntura para definir la ubicación de cada punto de acupuntura (Figura 5)^14,15.
   2. Presione LI15, ubicado en la depresión antero-inferior al extremo acromial, en posición prona.
   3. Presione SI11, ubicado en la depresión de la fosa infraespinosa en el punto medio de la espina escapular, en decúbito prono.
   4. Presione HT01, ubicado en el centro de la axila, en posición supina.
   5. Presione LI11 ubicado en la depresión medial al extensor radial del carpo en el extremo lateral del pliegue cubital en posición lateral reclinada.
6. Sostenga la articulación del hombro con el pulgar y el dedo medio izquierdos, y estire la extremidad anterior en las posiciones de aducción, abducción, extensión anterior y extensión posterior durante 10 s (Figura 4H-K).
   NOTA: Este método de estiramiento debe realizarse sin resistencia en ratas.
7. Pausa el procedimiento de Tuina si la rata se agita. Acaricia a la rata durante 10 segundos para calmarla y luego continúa con la prueba.
8. Realice el procedimiento diariamente durante 2 semanas.

5. Medición del ROM glenohumeral

NOTA: Es importante completar el proceso de medición lo más rápido posible para evitar la degeneración del tejido de la cápsula articular.

1. Extirpar la escápula y los dos tercios proximales del húmero en bloque después de sacrificar a la rata con una dosis excesiva de tribromoetanol (3 veces la dosis inicial, por inyección intraperitoneal), dejando al descubierto el borde inferior de la escápula.
2. Inserte una aguja de inyección (1,2 cm x 0,45 mm) a lo largo de la diáfisis humeral hasta la cabeza humeral.
3. Inserte dos agujas de inyección verticalmente en las esquinas superior e inferior de la escápula sobre espuma plástica envuelta con una lámina quirúrgica estéril.
4. Coloque un hilo fino en la aguja de inyección en la diáfisis humeral y tire de ella en el otro extremo con una fuerza de 5 g para que quede paralela a la diáfisis humeral. Mida el ángulo entre el borde inferior de la escápula y la diáfisis humeral (Figura 6).
   NOTA: Para garantizar resultados confiables, haga que un investigador independiente realice las mediciones.
5. Reporte los datos como medias ±desviación estándar (DE) utilizando una aplicación de software de análisis estadístico.
   NOTA: Aquí se utilizó el software SPSS (SPSS, versión 25.0).
6. Analice las diferencias entre los grupos mediante el análisis de varianza de un factor (ANOVA).
7. Obtenga gráficos de barras utilizando el software adecuado.
   NOTA: Aquí se utilizó GraphPad Prism 8.
8. Evalúe la patología de la cápsula mediante la tinción de H&E y Masson después de la medición.

6. Preparación de la sección

1. Después de evaluar la ROM glenohumeral, fijar muestras enteras en PFA al 4% durante 3 días, seguido de descalcificación en solución de EDTA (pH 7,2) durante 2 meses más.
2. Después de la deshidratación, cortar los bloques de tejido incrustados que contienen las muestras en rodajas de 5 μm¹⁶.
3. Secar la loncha a 65 °C durante 60 min.
4. Desparafina la rebanada.
5. Remoje la rebanada en xileno I, xileno II y xileno III durante 7 minutos, seguido de una serie de etanol descendente (etanol anhidro, 5 min; etanol al 95%, 2 min; etanol al 80%, 2 min, y etanol al 70%, 2 min) y, finalmente, en agua ultrapura durante 2 minutos.

7. Tinción de H&E

1. Teñir las secciones con hematoxilina durante 5 min, enjuagar con etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 3 s y lavar con agua corriente durante 5 min.
2. Tiñe la sección con eosina durante 3 minutos y lávala con agua del grifo.
3. Remojar la sección en una serie de etanol (etanol al 95% I, 3 s; etanol II al 95%, 3 s; etanol anhidro I, 3 s, y etanol anhidro II, 1 min) y luego sumergirla en una serie de xileno (xileno I, 1 min; xileno II, 1 min).
4. Coloque una gota de sellador de goma neutro en cada muestra. Selle cada muestra con un cubreobjetos.
5. Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia invertida (barra de escala = 100 μm).

8. Tinción de Masson

1. Con una pluma inmunohistoquímica, dibuje un círculo alrededor de las secciones y luego incube las secciones en la solución de Bouin durante 2 h a 37 °C hasta mordiente. Posteriormente, lavar las secciones con agua hasta que desaparezca el color amarillo.
2. Tratar las muestras con tinte azul lapislázuli durante 3 min y luego lavarlas con agua destilada.
3. Después de teñir las secciones con hematoxilina (Mayer) durante 2 min, tratar las secciones durante 3 s en la solución ácida de diferenciación de etanol. Luego, lave las secciones con agua corriente durante 10 minutos.
4. Tiñe las secciones con una solución de tinte magenta ponceau durante 10 minutos y posteriormente lávalas con agua.
5. Sumerja las secciones en la solución de ácido fosfomolíbdico durante 10 min.
6. Agregue una solución de tinción de azul de anilina a las secciones durante 5 minutos y luego lávelas con una solución de trabajo ácida débil durante 2 minutos.
7. Deshidrate y haga que las secciones sean transparentes como se describe en el paso 7.3.
8. Coloque una gota de agente sellador de goma neutro en cada sección y cúbrala con un cubreobjetos. Deje secar las secciones en una campana extractora.
9. Recopile imágenes como se describe en el paso 7.5.

Discusión

El primer paso crítico es la selección del modelo. Debido a la dificultad en la implementación del modelo primario de FS, la inmovilización con yeso y la fijación quirúrgica interna se utilizan a menudo para establecer modelos de ratas FS ^9,12. La restricción más severa de la movilidad del hombro y la fibrosis de la cápsula se observaron en el modelo de SF establecido por inmovilización con yeso durante 3 semanas^12,20. En este estudio, las tasas de éxito del modelo FS fueron excelentes, con un 100% de éxito.

El segundo paso crítico son las manipulaciones utilizadas en este protocolo. En este estudio se utilizaron tres manipulaciones (amasamiento, presión y estiramiento). La manipulación del amasamiento de tejidos blandos se aplicó en el hombro, la escápula y la parte superior del brazo para relajar los músculos. La manipulación del prensado se realizó mediante la aplicación de presión en puntos de acupuntura como LI15, SI11, HT01 y LI11, que son los más utilizados en la práctica clínica para el SF ^5,21. LI15, SI11 y HT01 se encuentran en posiciones alrededor de la cápsula del hombro y pueden ser eficaces para mejorar el ROM y la función del hombro²². El LI11 se utiliza a menudo para el deterioro motor de las extremidades superiores y se encuentra en el mismo meridiano que el LI15. Este método de coincidencia de puntos de acupuntura ayuda a mejorar la eficacia de LI15²³. Después de la relajación completa, se utilizaron técnicas de estiramiento para restaurar las actividades funcionales.

El posible problema en este protocolo es que las ratas exhiben una intensa resistencia durante el Tuina, que puede ser causada por el miedo en lugar de exceder la tolerancia de las ratas. En este punto, las manipulaciones deben detenerse hasta que las ratas se calmen (acariciar durante 10 segundos calma a las ratas). Además, el grado de estiramiento debe ajustarse de acuerdo con los síntomas de las ratas. Inicialmente, la limitación de la articulación del hombro era obvia y la amplitud de estiramiento era pequeña. Junto con la intervención, la función articular del hombro de las ratas se recuperó gradualmente y la amplitud del estiramiento aumentó progresivamente. El estándar es que las ratas pueden aceptar el método de estiramiento sin resistencia. Por último, las ratas tienen cierto grado de agresividad, y Tuina requiere un contacto prolongado con las ratas, por lo que es importante llevar equipo de protección personal.

El control cuantitativo de la manipulación es el más difícil en los experimentos de Tuina. Si bien se puede utilizar un simulador de manipulación de masaje para controlar la fuerza y la frecuencia de una sola manipulación, este método es limitado cuando se involucran múltiples manipulaciones y sitios de tratamiento^24,25. En la práctica clínica, la Tuina suele ser realizada directamente por los profesionales y, en este estudio, fue difícil intervenir con equipos médicos. Para controlar la estimulación, el sistema inteligente de determinación de parámetros de la técnica de masaje se puede utilizar para estandarizar el entrenamiento de Tuina. Después del entrenamiento, el investigador puede aplicar la misma fuerza a cada rata hasta cierto punto. La principal limitación de este protocolo es que las manipulaciones no se pueden controlar por completo.

La terapia de la MTC Tuina tiene una rica historia de uso en toda China, con varios médicos en hospitales que utilizan diferentes combinaciones de manipulación y sitios de tratamiento. Por lo tanto, es importante establecer protocolos replicables y efectivos tanto para experimentos con animales como para estudios clínicos. En este estudio, las manipulaciones y puntos de acupuntura utilizados se basaron en un estudio previo de nuestro equipo, combinando nuestra experiencia clínica con las características del modelo animal FS²¹. Este estudio demostró la eficacia del protocolo Tuina desarrollado para mejorar la función de la articulación del hombro y reducir la fibrosis de la cápsula en ratas FS. Estos hallazgos proporcionan una base para futuras investigaciones sobre los mecanismos subyacentes al tratamiento con Tuina. Además, el protocolo puede ser útil para los investigadores interesados en explorar la eficacia de tratamientos médicos alternativos para el SF.

Un estudio previo encontró que el mecanismo de intervención de Tuina sobre la fibrosis puede estar relacionado con la regulación negativa de TGF-β y CTGF, al tiempo que regula el equilibrio de MMP-1/TIMP-1, aliviando así la producción de matriz extracelular (MEC)²⁶. El efecto de Tuina sobre la fibrosis de la cápsula del hombro puede lograrse a través de la regulación de varios mecanismos. Sin embargo, se requiere más investigación para comprender completamente los mecanismos involucrados en esta mejora.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
Embedding machine	Changzhou Paisijie Medical Equipment Co., Ltd	BM450A
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Solarbio	E1171
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Sparkjade	EE0012
Intelligent-massage technique parameter determination system	Shanghai Dukang Intrument Equipment Co. Ltd	ZTC-
Microtome	Leica	531CM-Y43
Modified Masson Trichrome Staining Solution	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	R20381-8	Bouin 50 mL; lapis lazuli blue dye 50 mL; Hematoxylin (Mayer) 50 mL; acidic ethanol differentiation solution 50 mL; ponceau magenta dye solution 50 mL; phosphomolybdic acid solution 50 mL; aniline blue staining solution 50 mL;  weak acid 50 mL
Tribromoethanol	Macklin	T903147-5