Terapia manual para un modelo de rata con dolor lumbar crónico inespecífico

Resumen

Este estudio propone un procedimiento estandarizado para la terapia manual en ratas modelo de dolor lumbar crónico, que será de valor de referencia para futuras investigaciones experimentales sobre terapia manual.

Resumen

El dolor lumbar crónico (CLBP, por sus siglas en inglés) es una afección muy prevalente en todo el mundo y una de las principales causas de discapacidad. A la mayoría de los pacientes con CLBP se les diagnostica dolor lumbar crónico inespecífico (PNC) debido a una causa patológica desconocida. La terapia manual (MT) es un aspecto integral de la medicina tradicional china y es reconocida como Tuina en China. Implica técnicas como la manipulación de la fijación de huesos y la relajación muscular. A pesar de su eficacia clínica en el tratamiento de la CNLBP, los mecanismos subyacentes de la MT siguen sin estar claros. En los experimentos con animales destinados a investigar estos mecanismos, uno de los principales desafíos es lograr una TA normativa en ratas modelo CNLBP. Mejorar la estabilidad de la fuerza de los dedos es un tema clave en la MT. Para abordar esta limitación técnica, en este estudio se presenta un procedimiento estandarizado para la MT en ratas modelo CNLBP. Este procedimiento mejora significativamente la estabilidad de la MT con las manos y alivia los problemas comunes asociados con la inmovilización de ratas durante la MT. Los hallazgos de este estudio son de valor de referencia para futuras investigaciones experimentales de la MT.

Introducción

El dolor lumbar crónico (CLBP) se caracteriza por un dolor lumbar persistente que dura más de 3 meses, generalmente entre la caja torácica y la línea transversal de la cadera, con o sin dolor en las extremidades inferiores ^1,2. Es una enfermedad altamente prevalente, con una prevalencia anual global estimada del 38% y una prevalencia a lo largo de la vida del 39%, lo que la convierte en un problema común de salud pública ^3,4. La mayoría de los pacientes con CLBP, más del 90-95%, no pueden recibir un diagnóstico anatomopatológico definitivo (como el tumor, la fractura y la infección), lo que lleva a la clasificación de Lumbalgia Crónica Inespecífica (PNC)^5,6. Debido a la naturaleza inespecífica del mecanismo patológico, los analgésicos opioides y los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son las principales opciones de tratamiento en la medicina occidental, pero se asocian con preocupaciones de seguridad ^7,8. Por lo tanto, existe una creciente demanda de medicinas complementarias y alternativas que sean seguras y eficaces.

La terapia manual (MT), comúnmente conocida como Tui Na en China, es un aspecto importante de la medicina tradicional china (MTC) y abarca técnicas como la fijación de huesos y la manipulación de la relajación muscular. Su uso generalizado en China se atribuye a su eficacia clínica, alto perfil de seguridad y no invasividad⁹. En el tratamiento de la PNC, la MT ha demostrado ser una medicina complementaria y alternativa eficaz, con eficacia demostrada en estudios previos 10,11,12. La medicina tradicional china cree que el estancamiento del Qi y la estasis sanguínea son las principales causas del dolor crónico, y el Tui Na alivia el dolor al promover la circulación sanguínea y promover el Qi a los músculos y tejidos blandos. Sin embargo, a pesar de su eficacia, el mecanismo preciso que subyace a su efecto terapéutico sigue siendo difícil de alcanzar.

En el ámbito de la investigación experimental sobre la MT, existen discrepancias en la implementación de intervenciones en modelos animales. En la actualidad, la mayoría de los investigadores optan por la TA basada en máquinas, mientras que una minoría la realiza utilizando manos humanas 13,14,15,16. Mientras que la TA basada en máquinas está más estandarizada, la TA es más relevante desde el punto de vista clínico y produce datos más representativos. Sin embargo, la TA en animales de experimentación se ve obstaculizada por la fuerza inestable de los dedos, lo que supone un reto crucial en los experimentos con animales y dificulta la comparabilidad de los resultados experimentales. Para superar este desafío técnico, este estudio propone una solución adecuada, que mejora la estabilidad de la fuerza de los dedos durante la MT en ratas modelo CNLBP. Se verifica la viabilidad de esta solución, lo que proporciona una valiosa orientación para futuros estudios experimentales de MT.

Protocolo

Este protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Zhejiang, y todos los procedimientos se adhirieron a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En el estudio se utilizaron ratas SD macho adultas (véase la Tabla de Materiales) con un peso corporal que oscilaba entre 330 g y 350 g. Todas las ratas se alojaron en un animalario estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, temperatura de 24 ± 2 °C y humedad de 50 ± 5%. A las ratas se les proporcionó alimento y agua adecuados. El siguiente protocolo proporciona una descripción detallada del establecimiento del modelo CNLBP y el procedimiento de terapia manual.

1. Establecer el modelo de lumbalgia según los siguientes pasos (Figura 1)

1. Alimente a las ratas hasta que pesen entre 330 y 350 g, péselas y luego inyecte pentobarbital sódico al 3% (1 mL/kg) por vía intraperitoneal para anestesiarlas (ver Tabla de Materiales). Espere 2 minutos, luego pellizque suavemente los cuatro dedos de las extremidades traseras con pinzas y toque las córneas de las ratas con pinzas para verificar la ausencia de retracción o respuesta de parpadeo, lo que indica que la anestesia es exitosa.
   NOTA: Esterilize en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en el modelado de ratas con anticipación y esterilice otros instrumentos no esterilizables en autoclave, como afeitadoras, dispositivos ELFS y mesas termostáticas con alcohol. El operador debe usar una bata de laboratorio limpia, guantes estériles desechables, mascarilla, gorro quirúrgico y mascarilla.
2. Aplique una cantidad adecuada de ungüento veterinario a los ojos de las ratas para evitar que se sequen debido a la incapacidad prolongada de cerrar los ojos después de la anestesia.
3. Coloque la rata en la posición reclinada esteral en la mesa de temperatura constante, ubique su segmento L4-6, afeite el pelo del segmento y desinféctelo con Iodophor 3x antes de extender el paño desechable para cavidades quirúrgicas.
4. Corte la piel y la fascia del segmento L4-6 con tijeras quirúrgicas, luego separe los músculos de ambos lados de la apófisis espinosa de las vértebras lumbares de este segmento con un bisturí.
   NOTA: Asegúrese de que el músculo esté completamente separado de la apófisis espinosa y que no queden fibras musculares unidas a la apófisis espinosa. Además, la profundidad de separación debe extenderse a la apófisis transversal de la columna lumbar.
5. Taladre un agujero en el medio de la apófisis espinosa de L4-6 con una aguja de jeringa de 5 mL, luego cargue el sistema de fijación de enlace externo (ELFS) (consulte la Tabla de materiales) en la apófisis espinosa de L4-6.
6. Desinfectar con yodoforo, luego suturar después de la inyección intramuscular de 100.000 unidades de penicilina (ver Tabla de Materiales) en cada lado de la herida.
   NOTA: Empuje el dispositivo ELFS hacia adelante para bajar la altura del dispositivo ELFS antes de suturar, luego sutura debajo de la piel para evitar infecciones.
7. Tome una radiografía antes de que la rata esté despierta para determinar si el dispositivo ELFS se ha conectado con éxito a las apófisis espinosas L4-6 (Figura 2).
   NOTA: Coloque a la rata en posición recostada esternalmente en la mesa de temperatura constante (ver Tabla de Materiales) después de tomar las radiografías, espere hasta que esté despierta, luego devuélvala a la jaula y no la deje desatendida hasta que esté despierta.
8. Como se informó anteriormente¹⁷, alimente a cada rata modelo en una sola jaula durante 2 semanas, y si el dispositivo ELFS no se cae al final de las 2 semanas, el modelado CNLBP se considera exitoso.
   NOTA: Durante el período de recuperación postoperatoria, algunas ratas desarrollarán abscesos en la región lumbar debido a una infección; en este caso, use una jeringa de 2,5 ml para aspirar el pus, luego enjuague la herida con solución salina y finalmente presione la herida con una bola de algodón durante unos segundos.
9. Para evitar que las ratas dañen los dispositivos ELFS de las demás, continúe manteniendo cada rata modelo en una sola jaula después del período de recuperación de 2 semanas.
   NOTA: Para prevenir la depresión psicológica de las ratas causada por la alimentación en una sola jaula, coloque una pelota de juguete de plástico (consulte la Tabla de materiales) en la jaula.

2. Procedimiento para la terapia manual en ratas modelo CNLBP (Figura 3)

1. Antes de la MT, realice ejercicios de estabilidad de la fuerza de los dedos en una mesa de pesaje (consulte la Tabla de materiales) durante 2 semanas. Durante el ejercicio, mantenga una fuerza de amasado controlada con los dedos a aproximadamente 600 g con una frecuencia de dos veces por segundo. Realice el ejercicio una vez al día durante 10 minutos cada vez.
2. Antes de la MT, aclimate las ratas modelo a la bolsa para ratas durante 1 semana. Coloque la parte superior del cuerpo de la rata en la bolsa, con la región lumbar y las extremidades inferiores expuestas. Al mismo tiempo, acaricie suavemente la región lumbar de las ratas para animarlas a aceptar el contacto entre los dedos y la región lumbar.
   NOTA: Corte la forma de un trozo de tela en forma de abanico con un ángulo superior de 90° y un radio de 12 cm. Luego, cose los dos lados de la tela festoneada para hacer una bolsa para ratas (ver Figura Suplementaria S1).
3. Coloca la rata en una bolsa para ratas. En este momento, la mitad superior del cuerpo de la rata está cubierta por la bolsa de rata, y solo la cintura y las extremidades inferiores están expuestas. Sostenga la parte superior del cuerpo de la rata en forma de "C" con la mano no dominante, mientras realiza la MT en la región lumbar de la rata con la mano dominante.
   NOTA: No sujete el torso de la rata con demasiada fuerza cuando lo sostenga con la mano no dominante. El tórax de la rata se comprimirá y la respiración se verá obstaculizada si la rata se sujeta con demasiada fuerza. También hará que la rata se vuelva muy resistente.
4. Encuentra la ubicación exacta de los puntos de acupuntura Jiaji (EX-B2). Primero, determine la ubicación de la apófisis espinosa L4-6 de la rata. Los puntos de acupuntura de Jiaji se encuentran a ambos lados de L4-6, a 0,5 cm de la apófisis vertebral espinosa. Hay seis puntos de acupuntura Jiaji en total.
   NOTA: En las ratas, las espinas de L6 están en la línea de las dos espinas ilíacas anterosuperiores, y las posiciones de L4 y L5 se pueden encontrar contando hacia arriba a lo largo de las espinas de L6.
5. Coloque el pulgar en el punto de acupuntura Jiaji del segmento L4-6 de la rata y aumente gradualmente la intensidad del amasado. Cuando las ratas modelo muestran comportamientos de resistencia como retorcer las extremidades, gritar fuerte y luchar fuerte en el estado tranquilo, la fuerza de amasamiento en ese momento es el valor máximo de presión. Asegúrese de que la presión más adecuada sea ligeramente inferior al valor máximo de presión, que es el valor máximo de presión que las ratas pueden tolerar sin mostrar comportamientos de resistencia.
6. Comienza con el punto de acupuntura Jiaji en el lado izquierdo de L6. Después de encontrar el nivel de presión más apropiado para el punto de acupuntura Jiaji de la rata, sostenga el pulgar a ese nivel de presión el mayor tiempo posible mientras realiza una acción de amasado a una frecuencia de dos veces por segundo durante un minuto. Repite el procedimiento para los cinco puntos de acupuntura Jiaji restantes.
7. Si se observa un comportamiento resistente en ratas durante el procedimiento de amasamiento, detenga la presión del pulgar hasta que la rata se calme y luego reanude el procedimiento. Asegúrese de que el proceso de amasado dure 1 minuto para cada punto de acupuntura, incluso si hay una interrupción durante el proceso.

3. Umbral de retiro de la pata (PWT)

1. Coloque las ratas en una caja de plexiglás transparente sobre una malla de alambre durante 30 minutos antes de la prueba oficial para aclimatarlas al medio ambiente.
2. Utilice diferentes tamaños de filamentos de von Frey (0,6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 g) (ver Tabla de materiales), después de que las ratas hayan dejado de explorar y acicalarse, estimule verticalmente el centro de la pata trasera izquierda, aumente lentamente la presión hasta que los filamentos estén ligeramente doblados, luego detenga la presión y mantenga el valor de presión durante 5 s.
   NOTA: Evite el área más gruesa de la piel en el medio de la pata trasera cuando estimule las patas traseras con el filamento.
3. Registre el comportamiento positivo como X si la rata muestra una respuesta de retracción de la pata o de lamido del pie y proporcione un nivel más bajo de filamento de estímulo. Registre la ausencia de comportamiento positivo como O y dé un mayor nivel de filamento de estímulo.
   NOTA: El intervalo entre dos estímulos adyacentes debe ser superior a 30 s.
4. Detecte 4 veces seguidas cuando se obtiene X y luego una secuencia de X O consecutivos, y luego convierta la secuencia al valor PWT correspondiente de acuerdo con el método de Chaplan¹⁸.

4. Latencia de retiro de la pata (PWL)

1. Coloque a las ratas en el aparato de Hargreaves (ver Tabla de Materiales) durante 30 minutos antes de la prueba formal para permitirles aclimatarse al entorno.
2. Ajuste los parámetros del instrumento de la siguiente manera: tiempo máximo de exposición a la luz 20 s; intensidad de la exposición a la luz 50% (ver Figura Suplementaria S2).
   NOTA: El tiempo máximo de exposición a la luz no debe exceder los 20 s para evitar quemar las patas de la rata, lo que afectaría la precisión de los valores de prueba posteriores.
3. Alinee el + en el estimulador de calor con el centro de la pata trasera izquierda de la rata después de que la rata haya dejado de explorar y acicalarse. Haga clic en Inicio, y cuando la rata muestre un comportamiento de elevación del pie y el instrumento detenga automáticamente el cronometraje, registre el valor de tiempo resultante. Realice un total de cinco pruebas para cada rata.
   NOTA: El intervalo entre cada prueba para la misma rata es de al menos 5 minutos para evitar quemar la piel de la pata trasera de la rata.
4. Elimine los valores máximo y mínimo de los cinco valores medidos para cada rata y tome el promedio de los tres valores restantes como el valor PWL de la rata.

5. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Anestesiar a las ratas con pentobarbital sódico al final de las 2 semanas de MT y sacrificar a todas las ratas por perfusión cardíaca después de que estén completamente anestesiadas.
2. Retire el músculo psoas izquierdo de la rata L5 y sumérjalo en paraformaldehído al 4% (ver Tabla de Materiales) para una fijación de 48 h.
3. Recorte el pañuelo al tamaño apropiado y colóquelo en una caja de inclusión (consulte la Tabla de materiales) y luego use el Deshidratador automático (consulte la Tabla de materiales) para la deshidratación.
4. Use cera de parafina para incrustar el pañuelo y luego corte el tejido en secciones de 5 μm de grosor.
5. Monta las secciones en portaobjetos y hornea durante 4 h.
6. Coloque los pañuelos en el tinte automático (ver Tabla de Materiales) para el posterior desparafinado, tinción con hematoxilina, diferenciación, azulado, tinción con eosina, deshidratación y transparencia¹⁹.
7. Sellar las secciones con Resina Neutra (ver Tabla de Materiales) y dejar en un lugar ventilado durante 24 h.
8. Escanee las diapositivas con un escáner digital de diapositivas (consulte la tabla de materiales).

Resultados

En este estudio, el objetivo fue investigar el efecto analgésico de la MT en ratas modelo CNLBP. Para este propósito, 24 ratas fueron asignadas aleatoriamente a cuatro grupos, a saber, los grupos en blanco, operado simuladamente, modelo y MT, cada uno con seis ratas. El grupo en blanco no recibió ninguna intervención, mientras que el grupo operado simuladamente se sometió solo a un procedimiento quirúrgico en el que los músculos lumbares de ambos lados de la apófisis espinosa L4-...

Discusión

En la actualidad, no existe un consenso sobre un modelo animal que reproduzca con precisión el dolor lumbar crónico inespecífico (PNCN). Existen múltiples modelos animales de CNLBP, como los modelos derivados del disco, neurogénicos, osteoarticulares y musculares²³. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones debido a la naturaleza heterogénea de la CNLBP en la práctica clínica. El modelo CNLBP utilizado en este estudio fue modificado a partir del model...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B