Terapia manual para um modelo de rato com dor lombar crônica inespecífica

Resumo

Este estudo propõe um procedimento padronizado para terapia manual em ratos modelo de dor lombar crônica, que será de valor de referência para futuras pesquisas experimentais sobre terapia manual.

Resumo

A dor lombar crônica (DLC) é uma condição altamente prevalente em todo o mundo e uma das principais causas de incapacidade. A maioria dos pacientes com DLC é diagnosticada com lombalgia crônica inespecífica (DLC) devido a uma causa patológica desconhecida. A terapia manual (MT) é um aspecto integral da medicina tradicional chinesa e é reconhecida como Tuina na China. Envolve técnicas como fixação óssea e manipulação de relaxamento muscular. Apesar de sua eficácia clínica no tratamento da lombalgia, os mecanismos subjacentes da MT permanecem obscuros. Em experimentos com animais destinados a investigar esses mecanismos, um dos principais desafios é alcançar a MT normativa em ratos modelo CNLBP. Melhorar a estabilidade da força dos dedos é uma questão fundamental na MT. Para resolver essa limitação técnica, um procedimento padronizado para MT em ratos modelo CNLBP é apresentado neste estudo. Este procedimento aumenta significativamente a estabilidade da MT com as mãos e alivia problemas comuns associados à imobilização de ratos durante a MT. Os achados deste estudo são de valor de referência para futuras investigações experimentais de MT.

Introdução

A dor lombar crônica (DLC) é caracterizada por dor lombar persistente com duração superior a 3 meses, geralmente entre a caixa torácica e a linha transversa do quadril, com ou sem dor nos membros inferiores ^1,2. É uma doença altamente prevalente, com prevalência global anual estimada de 38% e prevalência ao longo da vida de 39%, tornando-se um problema comum de saúde pública ^3,4. A maioria dos pacientes com DLC, mais de 90-95%, não pode receber um diagnóstico patológico e anatômico definitivo (como tumor, fratura e infecção), levando à classificação de Dor lombar crônica inespecífica (DLMC)^5,6. Devido à natureza inespecífica do mecanismo patológico, os analgésicos opioides e os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são as principais opções de tratamento na medicina ocidental, mas estão associados a preocupações de segurança ^7,8. Portanto, há uma demanda crescente por medicamentos complementares e alternativos que sejam seguros e eficazes.

A terapia manual (MT), comumente chamada de Tui Na na China, é um aspecto significativo da medicina tradicional chinesa (MTC) e abrange técnicas como fixação óssea e manipulação de relaxamento muscular. Seu uso generalizado na China é atribuído à sua eficácia clínica, alto perfil de segurança e não invasividade⁹. No tratamento da lombalgia, a MT tem se mostrado uma medicina complementar e alternativa eficaz, com eficácia comprovada demonstrada em estudos anteriores 10,11,12. A MTC acredita que a estagnação do Qi e a estase sanguínea são as principais causas da dor crônica, e a Tui Na alivia a dor promovendo a circulação sanguínea e promovendo o Qi para os músculos e tecidos moles. No entanto, apesar de sua eficácia, o mecanismo preciso subjacente ao seu efeito terapêutico permanece indescritível.

No domínio da pesquisa experimental em MT, existem discrepâncias na implementação de intervenções em modelos animais. Atualmente, a maioria dos pesquisadores opta pela MT baseada em máquina, enquanto uma minoria realiza a MT usando mãos humanas 13,14,15,16. Enquanto a MT baseada em máquina é mais padronizada, a MT é mais clinicamente relevante e produz dados mais representativos. No entanto, a MT em animais experimentais é prejudicada pela força instável dos dedos, levando a um desafio crucial em experimentos com animais e dificultando a comparabilidade dos resultados experimentais. Para superar esse desafio técnico, este estudo propõe uma solução adequada, que aumenta a estabilidade da força do dedo durante a MT em ratos modelo CNLBP. A viabilidade desta solução é verificada, fornecendo orientações valiosas para futuros estudos experimentais de MT.

Protocolo

Este protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang, e todos os procedimentos aderiram ao Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O estudo utilizou ratos SD machos adultos (ver Tabela de Materiais) com um peso corporal variando de 330 g a 350 g. Todos os ratos foram alojados em um biotério padrão com ciclo claro-escuro de 12 h, temperatura de 24 ± 2 °C e umidade de 50 ± 5%. Os ratos receberam comida e água adequados. O protocolo a seguir fornece uma descrição detalhada do estabelecimento do modelo CNLBP e do procedimento de terapia manual.

1. Estabeleça o modelo de lombalgia de acordo com as etapas a seguir (Figura 1)

1. Alimente os ratos até que pesem 330-350 g, pese-os e, em seguida, injete pentobarbital sódico a 3% (1 mL / kg) por via intraperitoneal para anestesiá-los (ver Tabela de Materiais). Aguarde 2 minutos, aperte suavemente os quatro dedos dos membros posteriores com uma pinça e toque as córneas dos ratos com uma pinça para verificar a ausência de retração ou resposta a piscar, indicando que a anestesia foi bem-sucedida.
   NOTA: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos usados na modelagem de ratos com antecedência e esterilize outros instrumentos não autoclaváveis, como barbeadores, dispositivos ELFS e mesas termostáticas com álcool. O operador deve usar jaleco limpo, luvas estéreis descartáveis, máscara, touca cirúrgica e máscara facial.
2. Aplique uma quantidade adequada de pomada veterinária nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento devido à incapacidade prolongada de fechar os olhos após a anestesia.
3. Coloque o rato em decúbito esternal na mesa de temperatura constante, localize seu segmento L4-6, raspe o cabelo do segmento e desinfete-o com Iodophor 3x antes de espalhar o campo cirúrgico descartável.
4. Corte a pele e a fáscia do segmento L4-6 com uma tesoura cirúrgica e, em seguida, separe os músculos de ambos os lados do processo espinhoso das vértebras lombares desse segmento com um bisturi.
   NOTA: Certifique-se de que o músculo esteja totalmente separado do processo espinhoso e que nenhuma fibra muscular permaneça ligada ao processo espinhoso. Além disso, a profundidade da separação deve se estender ao processo transverso da coluna lombar.
5. Faça um furo no meio do processo espinhoso de L4-6 com uma agulha de seringa de 5 mL e, em seguida, carregue o sistema de fixação de elo externo (ELFS) (consulte a Tabela de Materiais) no processo espinhoso de L4-6.
6. Desinfete com iodóforo e, em seguida, suture após injeção intramuscular de 100.000 unidades de penicilina (consulte a Tabela de Materiais) em cada lado da ferida.
   NOTA: Empurre o dispositivo ELFS para frente para diminuir a altura do dispositivo ELFS antes de suturar e, em seguida, suture sob a pele para evitar infecções.
7. Faça um raio-X antes que o rato acorde para determinar se o dispositivo ELFS está conectado com sucesso aos processos espinhosos L4-6 (Figura 2).
   NOTA: Coloque o rato em decúbito esternal na tabela de temperatura constante (consulte a Tabela de Materiais) após fazer as radiografias, espere até que esteja acordado, depois devolva-o à gaiola e não o deixe sem vigilância até que esteja acordado.
8. Conforme relatado anteriormente¹⁷, alimente cada rato modelo em uma única gaiola por 2 semanas e, se o dispositivo ELFS não cair ao final das 2 semanas, a modelagem CNLBP é considerada bem-sucedida.
   NOTA: Durante o período de recuperação pós-operatória, alguns ratos desenvolverão abscessos na região lombar devido à infecção; neste caso, use uma seringa de 2,5 mL para aspirar o pus, depois lave a ferida com solução salina e, finalmente, pressione a ferida com uma bola de algodão por alguns segundos.
9. Para evitar que os ratos danifiquem os dispositivos ELFS uns dos outros, continue a manter cada modelo de rato em uma única gaiola após o período de recuperação de 2 semanas.
   NOTA: Para evitar a depressão psicológica de ratos causada pela alimentação em gaiola única, coloque um brinquedo de bola de plástico (consulte a Tabela de Materiais) na gaiola.

2. Procedimento para terapia manual em ratos modelo CNLBP (Figura 3)

1. Antes do MT, realize exercícios de estabilidade da força dos dedos em uma mesa de pesagem (consulte a Tabela de Materiais) por 2 semanas. Durante o exercício, manter uma força controlada de amassar os dedos a cerca de 600 g, com uma frequência de duas vezes por segundo. Realize o exercício uma vez por dia por um período de 10 minutos de cada vez.
2. Antes do MT, aclimate os ratos modelo à bolsa de ratos por 1 semana. Coloque a parte superior do corpo do rato na bolsa, com a região lombar e os membros inferiores expostos. Simultaneamente, acaricie suavemente a região lombar dos ratos para incentivá-los a aceitar o contato entre os dedos e a região lombar.
   NOTA: Corte a forma de um pedaço de tecido em forma de leque com um ângulo superior de 90° e um raio de 12 cm. Em seguida, costure os dois lados do tecido recortado para fazer uma bolsa de rato (consulte a Figura Suplementar S1).
3. Coloque o rato em uma bolsa de rato. Neste momento, a metade superior do corpo do rato é coberta pela bolsa do rato, e apenas a cintura e os membros inferiores ficam expostos. Segure a parte superior do corpo do rato em forma de "C" usando a mão não dominante, enquanto executa MT na região lombar do rato com a mão dominante.
   NOTA: Não segure o tronco do rato com muita força ao segurá-lo com a mão não dominante. O tórax do rato será comprimido e a respiração será impedida se o rato for segurado com muita força. Também fará com que o rato se torne muito resistente.
4. Encontre a localização exata dos pontos de acupuntura Jiaji (EX-B2). Primeiro, determine a localização do processo espinhoso L4-6 do rato. Os pontos de acupuntura Jiaji estão localizados em ambos os lados de L4-6, a 0,5 cm do processo espinhoso vertebral. Existem seis pontos de acupuntura Jiaji no total.
   NOTA: Em ratos, os espinhos de L6 estão na linha dos dois espinhos ilíacos ântero-superiores, e as posições de L4 e L5 podem ser encontradas contando ao longo dos espinhos de L6.
5. Coloque o polegar no ponto de acupuntura Jiaji do segmento L4-6 do rato e aumente gradualmente a intensidade do amassamento. Quando os ratos modelo mostram comportamentos de resistência, como contorção de membros, gritos altos e forte luta no estado silencioso, a força de amassamento naquele momento é o valor máximo de pressão. Certifique-se de que a pressão mais apropriada seja ligeiramente menor que o valor máximo de pressão, que é o valor máximo de pressão que os ratos podem tolerar sem mostrar comportamentos de resistência.
6. Comece com o ponto de acupuntura Jiaji no lado esquerdo de L6. Depois de encontrar o nível de pressão mais apropriado para o ponto de acupuntura Jiaji do rato, segure o polegar nesse nível de pressão o maior tempo possível enquanto executa uma ação de amassar a uma frequência de duas vezes por segundo por um minuto. Repita para os cinco pontos de acupuntura Jiaji restantes.
7. Se for observado comportamento resistente em ratos durante o procedimento de amassar, pare a pressão do polegar até que o rato se acalme e, em seguida, retome o procedimento. Certifique-se de que o processo de amassamento dure 1 min para cada ponto de acupuntura, mesmo que haja uma interrupção durante o processo.

3. Limiar de retirada da pata (PWT)

1. Coloque os ratos em uma caixa de acrílico transparente em tela de arame por 30 minutos antes do teste oficial para aclimatá-los ao ambiente.
2. Use diferentes tamanhos de filamentos de von Frey (0,6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 g) (ver Tabela de Materiais), depois que os ratos pararem de explorar e limpar, estimule verticalmente o meio da pata traseira esquerda, aumente lentamente a pressão até que os filamentos estejam ligeiramente dobrados, depois pare a pressão e mantenha o valor da pressão por 5 s.
   NOTA: Evite a área mais espessa da pele no meio da pata traseira ao estimular as patas traseiras com o filamento.
3. Registre o comportamento positivo como X se o rato mostrar uma resposta de retração da perna ou lamber os pés e der um nível mais baixo de filamento de estímulo. Registre a ausência de comportamento positivo como O e dê um nível mais alto de filamento de estímulo.
   NOTA: O intervalo entre dois estímulos adjacentes deve ser maior que 30 s.
4. Detecte 4x em uma linha quando X e, em seguida, uma sequência de X O consecutivo for obtida e, em seguida, converta a sequência para o valor PWT correspondente de acordo com o método de Chaplan¹⁸.

4. Latência de retirada da pata (PWL)

1. Coloque os ratos no Aparelho Hargreaves (ver Tabela de Materiais) por 30 minutos antes do teste formal para permitir que eles se aclimatem ao ambiente.
2. Defina os parâmetros do instrumento da seguinte forma: tempo máximo de exposição à luz 20 s; intensidade de exposição à luz 50% (ver Figura Suplementar S2).
   NOTA: O tempo máximo de exposição à luz não deve exceder 20 s para evitar queimar as patas do rato, o que afetaria a precisão dos valores de teste subsequentes.
3. Alinhe o + no estimulador de calor com o centro da pata traseira esquerda do rato depois que o rato parar de explorar e se limpar. Clique em Iniciar e, quando o rato exibir o comportamento de levantar o pé e o instrumento parar automaticamente de cronometrar, registre o valor do tempo resultante. Realizar um total de cinco testes para cada rato.
   NOTA: O intervalo entre cada teste para o mesmo rato é de pelo menos 5 minutos para evitar queimar a pele da pata traseira do rato.
4. Remover os valores máximo e mínimo dos cinco valores medidos para cada rato e tomar a média dos três valores restantes como o valor PWL do rato.

5. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

1. Anestesiar ratos com pentobarbital sódico ao final de 2 semanas de MT e eutanasiar todos os ratos por perfusão cardíaca após estarem completamente anestesiados.
2. Remova o músculo psoas esquerdo do rato L5 e mergulhe em paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais) para fixação de 48 h.
3. Apare o tecido no tamanho apropriado e coloque-o em uma caixa de incorporação (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, use o Desidratador Automático (consulte a Tabela de Materiais) para desidratação.
4. Use cera de parafina para incorporar o tecido e, em seguida, corte o tecido em seções de 5 μm de espessura.
5. Monte as seções em lâminas e leve ao forno por 4 h.
6. Coloque os lenços no Stainer Automático (ver Tabela de Materiais) para posterior desparafinação, coloração de hematoxilina, diferenciação, azulamento, coloração de eosina, desidratação e transparência¹⁹.
7. Sele as seções com Resina Neutra (ver Tabela de Materiais) e deixe em local ventilado por 24 h.
8. Digitalize os slides usando um scanner de slides digital (consulte Tabela de materiais).

Resultados

Neste estudo, o objetivo foi investigar o efeito analgésico do MT em ratos modelo CNLBP. Para isso, 24 ratos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos, a saber, os grupos branco, simulado, modelo e MT, cada um contendo seis ratos. O grupo em branco não recebeu nenhuma intervenção, enquanto o grupo operado simulado foi submetido apenas a um procedimento cirúrgico no qual os músculos lombares de ambos os lados do processo espinhoso L4-6 foram separados e suturados sem qualq...

Discussão

Atualmente, falta um consenso sobre um modelo animal que replique com precisão a dor lombar crônica inespecífica (CNLBP). Existem vários modelos animais de lombalgia, como modelos derivados de disco, neurogênicos, derivados osteoarticulares e derivados de músculo²³. No entanto, esses modelos apresentam limitações devido à natureza heterogênea da lombalgia na prática clínica. O modelo CNLBP usado neste estudo foi modificado do modelo de "link externo" d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B