만성 비특이적 요통 쥐 모델을 위한 도수치료

요약

본 연구는 만성 요통 모델 쥐에 대한 도수치료를 위한 표준화된 절차를 제안하며, 이는 향후 도수치료에 대한 실험적 연구에서 참고할 가치가 될 것이다.

초록

만성 요통(CLBP)은 전 세계적으로 매우 흔한 질환이며 장애의 주요 원인입니다. 만성 요통 환자의 대다수는 알 수 없는 병리학적 원인으로 인해 만성 비특이적 요통(CNLBP) 진단을 받습니다. 도수치료(MT)는 중국 전통 의학의 필수적인 측면이며 중국에서는 투이나(Tuina)로 인정받고 있습니다. 여기에는 뼈 세팅 및 근육 이완 조작과 같은 기술이 포함됩니다. CNLBP 치료에 대한 임상적 효능에도 불구하고 MT의 기본 메커니즘은 불분명합니다. 이러한 메커니즘을 조사하기 위한 동물 실험에서 주요 과제 중 하나는 CNLBP 모델 쥐에서 규범적 MT를 달성하는 것입니다. 손가락 힘의 안정성을 개선하는 것은 MT의 핵심 과제입니다. 이러한 기술적 한계를 해결하기 위해 본 연구에서는 CNLBP 모델 랫드의 MT에 대한 표준화된 절차를 제시합니다. 이 절차는 손으로 MT의 안정성을 크게 향상시키고 MT 중 쥐를 고정시키는 것과 관련된 일반적인 문제를 완화합니다. 이 연구의 결과는 MT에 대한 향후 실험 조사에 참고 가치가 있습니다.

서문

만성 요통(CLBP)은 일반적으로 흉곽과 횡고관절 사이에서 3개월 이상 지속되는 지속적인 요통을 특징으로 하며, 하지 통증의 유무에 관계없이 ^1,2. 이 질환은 전 세계적으로 연간 유병률이 38%, 평생 유병률이 39%로 추정되는 매우 흔한 질병으로, 일반적인 공중 보건 문제입니다 ^3,4. 90-95% 이상인 대부분의 만성 요통 환자는 종양, 골절, 감염 등 명확한 병리학적, 해부학적 진단을 받을 수 없어 만성 비특이적 요통(CNLBP)으로 분류됩니다^5,6. 병리학적 기전의 비특이적 특성으로 인해 오피오이드 진통제와 비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 서양 의학에서 주요 치료 옵션이지만 안전성 문제와 관련이 있습니다 ^7,8. 따라서 안전하고 효과적인 보완 및 대체 의약품에 대한 수요가 증가하고 있습니다.

중국에서 흔히 투이나(Tui Na)라고 불리는 도수치료(MT)는 중국 전통 의학(TCM)의 중요한 측면이며 뼈 세팅 및 근육 이완 조작과 같은 기술을 포함합니다. 중국에서의 광범위한 사용은 임상적 효과, 높은 안전성 프로필, 비침습성에 기인한다⁹. CNLBP의 치료에서 MT는 이전 연구에서 입증된 효능이 입증된 효과적인 보완 및 대체 의학으로 밝혀졌습니다 10,11,12. TCM은 기의 정체와 혈액 정체가 만성 통증의 핵심 원인이라고 믿으며, Tui Na는 혈액 순환을 촉진하고 근육과 연조직에 기를 촉진하여 통증을 완화합니다. 그러나 그 효능에도 불구하고 치료 효과의 기저에 있는 정확한 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다.

MT에 대한 실험적 연구 영역에서는 동물 모델에 대한 중재를 구현하는 데 불일치가 존재합니다. 현재 대다수의 연구자는 기계 기반 MT를 선택하는 반면, 소수는 사람의 손을 사용하여 MT를 수행합니다 13,14,15,16. 기계 기반 MT가 더 표준화되어 있는 반면, MT는 임상적으로 더 관련성이 높고 더 많은 대표 데이터를 생성합니다. 그러나 실험 동물에 대한 MT는 손가락의 불안정한 강도로 인해 방해를 받아 동물 실험에서 중요한 도전으로 이어지고 실험 결과의 비교를 방해합니다. 이러한 기술적 과제를 극복하기 위해 본 연구는 CNLBP 모델 쥐에서 MT 중 손가락 힘의 안정성을 향상시키는 적절한 솔루션을 제안합니다. 이 솔루션의 타당성이 검증되어 향후 MT 실험 연구에 유용한 지침을 제공합니다.

프로토콜

이 실험 프로토콜은 Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드를 준수했습니다. 이 연구는 체중이 330g에서 350g 사이인 성인 수컷 SD 쥐( 재료 표 참조)를 사용했습니다. 모든 쥐는 명암 주기가 12시간, 온도가 24± 2°C, 습도가 50 ± 5%인 표준 동물 시설에 수용되었습니다. 쥐에게는 적절한 음식과 물이 공급되었습니다. 다음 프로토콜은 CNLBP 모델 수립 및 도수치료 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

1. 다음 단계에 따라 요통 모델을 설정합니다(그림 1).

1. 쥐의 무게가 330-350g이 될 때까지 먹이고 무게를 잰 다음 3% 펜토바르비탈 나트륨(1mL/kg)을 복강내에 주입하여 마취시킵니다( 재료 표 참조). 2분 정도 기다렸다가 뒷다리의 네 발가락을 집게로 부드럽게 꼬집고 집게로 쥐의 각막을 만져 수축이나 깜박임 반응이 없는지 확인하여 마취가 성공적임을 나타냅니다.
   참고: 랫드 모델링에 사용되는 모든 수술 기구를 미리 고압멸균하고 면도기, ELFS 장치 및 자동 온도 조절 테이블과 같은 다른 고압멸균 기구를 알코올로 멸균합니다. 작업자는 깨끗한 실험복, 일회용 멸균 장갑, 마스크, 수술용 모자 및 안면 마스크를 착용해야 합니다.
2. 마취 후 장기간 눈을 감을 수 없어 건조해지는 것을 방지하기 위해 쥐의 눈에 적당량의 동물용 연고를 바르십시오.
3. 항온 테이블의 흉골 누운 자세로 쥐를 놓고 L4-6 세그먼트를 찾은 다음 세그먼트의 털을 면도하고 일회용 수술 구멍 드레이프를 펴기 전에 요오드 3x로 소독합니다.
4. 수술 용 가위로 L4-6 세그먼트의 피부와 근막을 절단 한 다음이 세그먼트의 요추 뼈의 가시 돌기의 양쪽 근육을 메스로 분리합니다.
   알림: 근육이 가시돌기에서 완전히 분리되어 있고 척추돌기에 근육 섬유가 붙어 있지 않은지 확인하십시오. 또한, 분리의 깊이는 요추의 횡돌기까지 확장되어야 합니다.
5. 5mL 주사기 바늘로 L4-6의 가시돌기 중간에 구멍을 뚫은 다음 L4-6의 가시돌기에 외부 링크 고정 시스템(ELFS)( 재료 표 참조)을 로드합니다.
6. 요오드로 소독한 다음 상처의 양쪽에 페니실린 100,000단위( 재료 표 참조)를 근육 주사한 후 봉합합니다.
   알림: 봉합하기 전에 ELFS 장치를 앞으로 밀어 ELFS 장치의 높이를 낮춘 다음 감염을 방지하기 위해 피부 아래를 봉합하십시오.
7. 쥐가 깨어나기 전에 X-ray를 찍어 ELFS 장치가 L4-6 가시돌기에 성공적으로 연결되었는지 확인합니다(그림 2).
   알림: 방사선 사진을 촬영한 후 쥐를 항온 표( 재료 표 참조)의 흉골 누운 위치에 놓고 깨어날 때까지 기다렸다가 케이지로 되돌려 놓고 깨어날 때까지 방치하지 마십시오.
8. 이전에 보고된^{바와 같이 17}, 각 모델 랫에게 2주 동안 단일 케이지에서 먹이를 주고 2주가 지나도 ELFS 장치가 떨어지지 않으면 CNLBP 모델링이 성공적인 것으로 간주됩니다.
   참고: 수술 후 회복 기간 동안 일부 쥐는 감염으로 인해 요추 부위에 농양이 생깁니다. 이 경우 2.5mL 주사기를 사용하여 고름을 흡인하고 식염수로 상처를 씻어내고 마지막으로 면봉으로 몇 초 동안 상처를 누르십시오.
9. 랫트가 서로의 ELFS 장치를 손상시키는 것을 방지하려면 2주간의 회복 기간 후에도 각 모델 랫을 하나의 케이지에 계속 보관하십시오.
   알림: 단일 케이지 먹이로 인한 쥐의 심리적 우울증을 예방하려면 케이지에 플라스틱 공 장난감( 재료 표 참조)을 놓으십시오.

2. CNLBP 모델 쥐에 대한 수동 치료 절차(그림 3)

1. MT 전에 2주 동안 계량 테이블( 재료 표 참조)에서 손가락 근력 안정성 운동을 수행합니다. 운동하는 동안 초당 2회의 빈도로 약 600g의 제어된 손가락 주무르는 힘을 유지하십시오. 하루에 한 번 10분 동안 운동을 하십시오.
2. MT 전에 모델 쥐를 1주일 동안 쥐 주머니에 적응시킵니다. 쥐의 상체를 요추 부위와 하지가 드러나게 하여 주머니에 넣습니다. 동시에 쥐의 요추 부위를 부드럽게 쓰다듬어 손가락과 요추 부위 사이의 접촉을 받아들이도록 격려합니다.
   알림: 천 조각의 모양을 상단 각도가 90°이고 반경이 12cm인 부채꼴 모양으로 자릅니다. 그런 다음 가리비 천의 양면을 함께 꿰매어 쥐 주머니를 만듭니다( 보충 그림 S1 참조).
3. 쥐 주머니에 쥐를 넣으십시오. 이때 쥐의 몸의 상반신은 쥐주머니로 덮여 있고 허리와 하지만 노출되어 있습니다. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 쥐의 상체를 "C"자 모양으로 잡고 주로 사용하는 손으로 쥐의 요추 부위에 MT를 수행합니다.
   알림: 주로 사용하지 않는 손으로 쥐의 몸통을 잡을 때 쥐의 몸통을 너무 세게 잡지 마십시오. 쥐의 흉부가 압박되고 쥐를 너무 세게 잡으면 호흡이 방해를 받습니다. 그것은 또한 쥐가 매우 저항력을 갖게 될 것입니다.
4. 지아지(EX-B2) 경혈의 정확한 위치를 찾습니다. 먼저 쥐의 L4-6 가시돌기의 위치를 결정합니다. Jiaji 경혈은 척추 돌기에서 0.5cm 떨어진 L4-6의 양쪽에 있습니다. 총 6개의 Jiaji 경혈이 있습니다.
   참고: 쥐에서 L6의 척추는 두 개의 앞쪽 상장골 척추의 선상에 있으며, L4와 L5의 위치는 L6의 척추를 따라 세어 볼 수 있습니다.
5. 쥐의 L4-6 분절의 Jiaji 경혈에 엄지 손가락을 놓고 점차적으로 반죽 강도를 높입니다. 모델 랫드가 조용한 상태에서 팔다리 몸부림, 큰 비명, 강한 몸부림과 같은 저항 행동을 보일 때 이때의 반죽력이 최대 압력 값입니다. 가장 적절한 압력이 쥐가 저항 행동을 보이지 않고 견딜 수 있는 최대 압력 값인 최대 압력 값보다 약간 작은지 확인하십시오.
6. L6 왼쪽에 있는 Jiaji 경혈부터 시작합니다. 쥐의 Jiaji 경혈에 가장 적합한 압력 수준을 찾은 후 1분 동안 초당 2회의 빈도로 주무르는 동작을 수행하면서 해당 압력 수준에서 엄지 손가락을 가능한 한 오래 유지합니다. 나머지 5개의 Jiaji 경혈에 대해 반복합니다.
7. 반죽 과정 중 쥐에서 저항 행동이 관찰되면 쥐가 진정될 때까지 엄지 손가락 압력을 멈춘 다음 절차를 다시 시작하십시오. 반죽 과정이 각 경혈에 대해 1분 동안 지속되는지 확인하며, 과정 중에 중단이 있더라도 마찬가지입니다.

3. 발 인출 임계값(PWT)

1. 공식 테스트 전에 30분 동안 철망이 있는 투명한 플렉시글라스 상자에 쥐를 넣어 환경에 적응하도록 합니다.
2. 다양한 크기의 폰 프레이 필라멘트(0.6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26g)를 사용하고( 재료 표 참조), 쥐가 탐색 및 손질을 멈춘 후 왼쪽 뒷발 중앙을 수직으로 자극하고 필라멘트가 약간 구부러질 때까지 천천히 압력을 높인 다음 압력을 멈추고 5초 동안 압력 값을 유지합니다.
   알림: 필라멘트로 뒷발을 자극할 때 뒷발 중앙의 두꺼운 피부 부위를 피하십시오.
3. 쥐가 다리 후퇴 또는 발 핥기 반응을 보이고 더 낮은 수준의 자극 필라멘트를 제공하는 경우 긍정적인 행동을 X 로 기록합니다. 긍정적 인 행동의 부재를 O 로 기록하고 더 높은 수준의 자극 필라멘트를 제공하십시오.
   알림: 인접한 두 자극 사이의 간격은 30초 이상이어야 합니다.
4. X가 얻어질 때 연속된 Xo의 시퀀스가 얻어질 때 연속으로 4x를 검출한 다음, Chaplan¹⁸의 방법에 따라 시퀀스를 해당 PWT 값으로 변환합니다.

4. 발 철수 지연(PWL)

1. 쥐를 Hargreaves Apparatus ( 재료 표 참조)에 공식 테스트 전에 30 분 동안 놓아 환경에 적응할 수 있도록합니다.
2. 기기 매개변수를 다음과 같이 설정하십시오: 최대 광 노출 시간 20초; 광 노출 강도 50% ( 보충 그림 S2 참조).
   알림: 최대 광 노출 시간은 쥐의 발에 화상을 입지 않도록 20초를 초과해서는 안 되며, 이는 후속 테스트 값의 정확도에 영향을 미칩니다.
3. 쥐가 탐색과 그루밍을 멈춘 후 열 자극기의 + 를 쥐의 왼쪽 뒷발 중앙에 맞춥니다. 시작을 클릭하고 쥐가 발을 들어 올리는 행동을 보이고 기기가 자동으로 타이밍을 중지하면 결과 시간 값을 기록합니다. 각 쥐에 대해 총 5개의 테스트를 수행합니다.
   참고: 같은 쥐에 대한 각 테스트 사이의 간격은 쥐의 뒷발 피부가 타는 것을 방지하기 위해 최소 5분입니다.
4. 각 랫트에 대해 측정된 5개의 값에서 최대값과 최소값을 제거하고 나머지 3개 값의 평균을 랫의 PWL 값으로 취합니다.

5. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색

1. MT 2주가 끝나면 펜토바르비탈나트륨으로 쥐를 마취하고 완전히 마취된 후 심장 관류로 모든 쥐를 안락사시킵니다.
2. 랫드 L5에서 왼쪽 요근을 제거하고 48시간 고정을 위해 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조)에 담그십시오.
3. 조직을 적절한 크기로 자르고 임베딩 상자( 재료 표 참조)에 넣은 다음 탈수를 위해 자동 탈수기( 재료 표 참조)를 사용합니다.
4. 파라핀 왁스를 사용하여 조직을 삽입한 다음 조직을 5μm 두께의 섹션으로 자릅니다.
5. 슬라이드에 섹션을 장착하고 4시간 동안 굽습니다.
6. 후속 탈왁스, 헤마톡실린 염색, 분화, 블루잉, 에오신 염색, 탈수 및 투명도를 위해 자동 염색기( 재료 표 참조)에 조직을 놓습니다¹⁹.
7. 중성 수지로 섹션을 밀봉하고( 재료 표 참조) 통풍이 잘 되는 곳에 24시간 동안 그대로 두십시오.
8. 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다( 자료표 참조).

결과

이 연구의 목적은 CNLBP 모델 쥐에 대한 MT의 진통 효과를 조사하는 것이었습니다. 이를 위해 24마리의 쥐를 4개 그룹, 즉 각각 6마리의 쥐를 포함하는 blank, sham-operated, model 및 MT 그룹에 무작위로 할당했습니다. 블랭크 그룹은 어떠한 중재도 받지 않은 반면, 가짜 수술을 받은 그룹은 L4-6 가시돌기 양쪽의 요추 근육을 분리하고 봉합하는 수술만 받았으며 후속 개입은 없었습니...

토론

현재로서는 만성 비특이적 요통(CNLBP)을 정확하게 재현하는 동물모델에 대한 합의가 부족하다. CNLBP의 여러 동물 모델, 예를 들어 디스크 유래 모델, 신경 인성 모델, 골관절 유래 모델 및 근육 유래 모델²³. 그러나 이러한 모델은 임상 실습에서 CNLBP의 이질적인 특성으로 인해 한계가 있습니다. 본 연구에서 사용된 CNLBP 모델은 골관절 유래 CNLBP 모델인 Hender...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B