Manuelle Therapie für ein chronisch unspezifisches Rattenmodell mit Rückenschmerzen

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein standardisiertes Verfahren für die manuelle Therapie an Modellratten mit chronischen Rückenschmerzen vorgeschlagen, das für zukünftige experimentelle Forschungen zur manuellen Therapie von Referenzwert sein wird.

Zusammenfassung

Chronische Kreuzschmerzen (CLBP) sind weltweit eine weit verbreitete Erkrankung und eine der Hauptursachen für Behinderungen. Bei der Mehrzahl der Patienten mit CLBP wird aufgrund einer unbekannten pathologischen Ursache ein chronischer unspezifischer Kreuzschmerz (CNLBP) diagnostiziert. Die Manuelle Therapie (MT) ist ein integraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin und wird in China als Tuina anerkannt. Es beinhaltet Techniken wie Knochensetzen und Muskelentspannungsmanipulation. Trotz ihrer klinischen Wirksamkeit bei der Behandlung von CNLBP sind die zugrunde liegenden Mechanismen der MT nach wie vor unklar. In Tierversuchen, die darauf abzielen, diese Mechanismen zu untersuchen, besteht eine der größten Herausforderungen darin, eine normative MT an CNLBP-Modellratten zu erreichen. Die Verbesserung der Stabilität der Fingerkraft ist ein zentrales Thema bei der maschinellen Maschinerie. Um diese technische Einschränkung zu beheben, wird in dieser Studie ein standardisiertes Verfahren für MT an CNLBP-Modellratten vorgestellt. Dieses Verfahren verbessert die Stabilität der MT mit den Händen erheblich und lindert häufige Probleme, die mit der Immobilisierung von Ratten während der MT verbunden sind. Die Ergebnisse dieser Studie sind von Referenzwert für zukünftige experimentelle Untersuchungen der MT.

Einleitung

Chronische Kreuzschmerzen (CLBP) sind gekennzeichnet durch anhaltende Schmerzen im unteren Rückenbereich, die länger als 3 Monate andauern, typischerweise zwischen dem Brustkorb und der queren Hüftlinie, mit oder ohne Schmerzen der unteren Gliedmaßen ^1,2. Es handelt sich um eine weit verbreitete Krankheit mit einer geschätzten weltweiten Jahresprävalenz von 38 % und einer Lebenszeitprävalenz von 39 %, was sie zu einem häufigen Problem der öffentlichen Gesundheit macht ^3,4. Die Mehrheit der Patienten mit CLBP, mehr als 90-95 %, kann keine endgültige pathologische und anatomische Diagnose gestellt werden (z. B. Tumor, Fraktur und Infektion), was zur Klassifizierung als chronisch unspezifische Kreuzschmerzen (CNLBP) ^führt5,6. Aufgrund der unspezifischen Natur des pathologischen Mechanismus sind Opioid-Analgetika und nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) die Hauptbehandlungsoptionen in der westlichen Medizin, sind jedoch mit Sicherheitsbedenken verbunden ^7,8. Daher besteht eine steigende Nachfrage nach komplementären und alternativen Arzneimitteln, die sowohl sicher als auch wirksam sind.

Die manuelle Therapie (MT), in China allgemein als Tui Na bezeichnet, ist ein wichtiger Aspekt der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und umfasst Techniken wie das Knochensetzen und die Manipulation der Muskelentspannung. Seine weit verbreitete Verwendung in China wird auf seine klinische Wirksamkeit, sein hohes Sicherheitsprofil und seine Nicht-Invasivität zurückgeführt⁹. Bei der Behandlung von CNLBP hat sich MT als wirksame Komplementär- und Alternativmedizin erwiesen, deren Wirksamkeit in früheren Studien nachgewiesen wurde 10,11,12. Die TCM glaubt, dass Qi-Stagnation und Blutstauung die Hauptursachen für chronische Schmerzen sind, und Tui Na lindert Schmerzen, indem es die Durchblutung fördert und das Qi in Muskeln und Weichteilen fördert. Trotz seiner Wirksamkeit bleibt der genaue Mechanismus, der seiner therapeutischen Wirkung zugrunde liegt, jedoch schwer fassbar.

Im Bereich der experimentellen Forschung zur MT gibt es Diskrepanzen bei der Umsetzung von Eingriffen in Tiermodelle. Derzeit entscheidet sich die Mehrheit der Forscher für maschinelle MT, während eine Minderheit MT mit menschlichen Händen durchführt 13,14,15,16. Während die maschinelle MT eher standardisiert ist, ist die MT klinisch relevanter und produziert repräsentativere Daten. Die maschinelle Übersetzung an Versuchstieren wird jedoch durch die instabile Kraft der Finger behindert, was zu einer entscheidenden Herausforderung im Tierversuch führt und die Vergleichbarkeit der Versuchsergebnisse erschwert. Um diese technische Herausforderung zu meistern, wird in dieser Studie eine geeignete Lösung vorgeschlagen, die die Stabilität der Fingerkraft während der MT an CNLBP-Modellratten erhöht. Die Machbarkeit dieser Lösung wird verifiziert und bietet eine wertvolle Orientierungshilfe für zukünftige experimentelle Studien zur MT.

Protokoll

Dieses Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine genehmigt, und alle Verfahren entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Studie verwendete erwachsene männliche SD-Ratten (siehe Materialtabelle) mit einem Körpergewicht zwischen 330 g und 350 g. Alle Ratten wurden in einer Standard-Tierhaltung mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden, einer Temperatur von 24 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 ± 5 % untergebracht. Die Ratten wurden mit ausreichend Futter und Wasser versorgt. Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Etablierung des CNLBP-Modells und des Verfahrens der manuellen Therapie.

1. Etablieren Sie das Modell für Rückenschmerzen gemäß den folgenden Schritten (Abbildung 1)

1. Füttern Sie die Ratten, bis sie 330-350 g wiegen, wiegen Sie sie und injizieren Sie dann 3% Natrium-Pentobarbital (1 ml/kg) intraperitoneal, um sie zu betäuben (siehe Materialtabelle). Warten Sie 2 Minuten, kneifen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette in die vier Zehen der Hintergliedmaßen und berühren Sie die Hornhaut der Ratten mit einer Pinzette, um zu überprüfen, ob es keine Retraktion oder Blinzelreaktion gibt, was darauf hinweist, dass die Anästhesie erfolgreich war.
   HINWEIS: Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die bei der Rattenmodellierung verwendet werden, im Voraus und sterilisieren Sie andere nicht autoklavierbare Instrumente wie Rasierer, ELFS-Geräte und Thermostattische mit Alkohol. Der Bediener sollte einen sauberen Laborkittel, sterile Einweghandschuhe, eine Maske, eine OP-Kappe und eine Gesichtsmaske tragen.
2. Tragen Sie eine angemessene Menge Tiersalbe auf die Augen von Ratten auf, um ein Austrocknen aufgrund längerer Unfähigkeit, die Augen nach der Anästhesie zu schließen, zu verhindern.
3. Platzieren Sie die Ratte in sternaler Liegeposition auf dem Tisch mit konstanter Temperatur, lokalisieren Sie ihr L4-6-Segment, rasieren Sie das Haar des Segments und desinfizieren Sie es 3x mit Iodophor, bevor Sie das Einweg-OP-Kavitätentuch verteilen.
4. Schneiden Sie die Haut und die Faszie des Segments L4-6 mit einer chirurgischen Schere ab und trennen Sie dann mit einem Skalpell die Muskeln auf beiden Seiten des Dornfortsatzes der Lendenwirbel dieses Segments.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Muskel vollständig vom Dornfortsatz getrennt ist und dass keine Muskelfasern am Dornfortsatz befestigt bleiben. Des Weiteren sollte sich die Trenntiefe bis zum Querfortsatz der Lendenwirbelsäule erstrecken.
5. Bohren Sie mit einer 5 mL Spritzennadel ein Loch in die Mitte des Dornfortsatzes von L4-6 und laden Sie dann das External Link Fixation System (ELFS) (siehe Materialtabelle) auf den Dornfortsatz von L4-6.
6. Desinfizieren Sie mit Iodophor und nähen Sie dann nach intramuskulärer Injektion von 100.000 Einheiten Penicillin (siehe Materialtabelle) auf jede Seite der Wunde.
   HINWEIS: Schieben Sie das ELFS-Gerät nach vorne, um die Höhe des ELFS-Geräts vor dem Nähen zu verringern, und nähen Sie dann unter die Haut, um eine Infektion zu vermeiden.
7. Machen Sie eine Röntgenaufnahme, bevor die Ratte wach ist, um festzustellen, ob das ELFS-Gerät erfolgreich an den L4-6-Dornfortsätzen befestigt ist (Abbildung 2).
   HINWEIS: Bringen Sie die Ratte nach der Aufnahme der Röntgenaufnahmen in die sternale Liegeposition auf der Tabelle mit konstanter Temperatur (siehe Materialtabelle), warten Sie, bis sie wach ist, bringen Sie sie dann wieder in den Käfig zurück und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach ist.
8. Wie bereits berichtet¹⁷, füttern Sie jede Modellratte 2 Wochen lang in einem einzigen Käfig, und wenn das ELFS-Gerät am Ende der 2 Wochen nicht herunterfällt, gilt die CNLBP-Modellierung als erfolgreich.
   HINWEIS: Während der postoperativen Erholungsphase entwickeln einige Ratten aufgrund einer Infektion Abszesse im Lendenwirbelbereich. Verwenden Sie in diesem Fall eine 2,5-ml-Spritze, um den Eiter abzusaugen, spülen Sie dann die Wunde mit Kochsalzlösung und drücken Sie schließlich einige Sekunden lang mit einem Wattebausch auf die Wunde.
9. Um zu verhindern, dass die Ratten die ELFS-Geräte der anderen beschädigen, halten Sie jedes Rattenmodell nach der 2-wöchigen Erholungsphase weiterhin in einem einzigen Käfig.
   HINWEIS: Um die psychische Depression von Ratten zu verhindern, die durch die Fütterung in einem Käfig verursacht wird, legen Sie ein Plastikballspielzeug (siehe Materialtabelle) in den Käfig.

2. Verfahren zur manuellen Therapie an CNLBP-Modellratten (Abbildung 3)

1. Führen Sie vor der MT 2 Wochen lang Stabilitätsübungen für die Fingerkraft auf einer Wägetabelle (siehe Materialtabelle) durch. Halten Sie während der Übung eine kontrollierte Fingerknetkraft von ca. 600 g mit einer Frequenz von zweimal pro Sekunde aufrecht. Führen Sie die Übung einmal täglich für eine Dauer von jeweils 10 Minuten durch.
2. Akklimatisieren Sie die Modellratten vor der MT 1 Woche lang an den Rattenbeutel. Legen Sie den Oberkörper der Ratte in den Beutel, wobei die Lendenwirbelsäule und die unteren Gliedmaßen freiliegen. Streicheln Sie gleichzeitig sanft über die Lendenwirbelsäule der Ratten, um sie zu ermutigen, den Kontakt zwischen den Fingern und der Lendenwirbelsäule zu akzeptieren.
   HINWEIS: Schneiden Sie die Form eines Stoffstücks in eine Fächerform mit einem oberen Winkel von 90° und einem Radius von 12 cm. Nähen Sie dann die beiden Seiten des gewellten Stoffes zu einem Rattenbeutel zusammen (siehe Ergänzende Abbildung S1).
3. Lege die Ratte in einen Rattenbeutel. Zu diesem Zeitpunkt ist die obere Körperhälfte der Ratte vom Rattenbeutel bedeckt und nur die Taille und die unteren Gliedmaßen sind freigelegt. Halten Sie den Oberkörper der Ratte mit der nicht-dominanten Hand in einer "C"-Form, während Sie mit der dominanten Hand MT an der Lendenwirbelsäule der Ratte ausführen.
   HINWEIS: Halten Sie den Oberkörper der Ratte nicht zu fest, wenn Sie ihn mit der nicht dominanten Hand halten. Der Thorax der Ratte wird zusammengedrückt und die Atmung wird behindert, wenn die Ratte zu fest gehalten wird. Es wird auch dazu führen, dass die Ratte sehr widerstandsfähig wird.
4. Finden Sie die genaue Position der Jiaji (EX-B2) Akupunkturpunkte. Bestimmen Sie zunächst die Position des L4-6-Dornfortsatzes der Ratte. Die Jiaji-Akupunkturpunkte befinden sich auf beiden Seiten von L4-6, 0,5 cm vom Dornfortsatz der Wirbel entfernt. Es gibt insgesamt sechs Jiaji-Akupunkturpunkte.
   HINWEIS: Bei Ratten befinden sich die Stacheln von L6 auf der Linie der beiden vorderen oberen Beckenstacheln, und die Positionen von L4 und L5 können durch Hochzählen entlang der Stacheln von L6 ermittelt werden.
5. Legen Sie den Daumen auf den Jiaji-Akupunkturpunkt des L4-6-Segments der Ratte und erhöhen Sie allmählich die Knetintensität. Wenn die Modellratten im ruhigen Zustand Widerstandsverhaltensweisen wie das Krümmen der Gliedmaßen, lautes Schreien und starkes Kämpfen zeigen, ist die Knetkraft zu diesem Zeitpunkt der maximale Druckwert. Stellen Sie sicher, dass der am besten geeignete Druck etwas niedriger ist als der maximale Druckwert, d. h. der maximale Druckwert, den die Ratten tolerieren können, ohne Widerstandsverhalten zu zeigen.
6. Beginne mit dem Jiaji-Akupunkturpunkt auf der linken Seite von L6. Nachdem Sie den am besten geeigneten Druckpegel für den Jiaji-Akupunkturpunkt der Ratte gefunden haben, halten Sie den Daumen so lange wie möglich auf diesem Druckniveau, während Sie eine Minute lang zweimal pro Sekunde kneifen. Wiederholen Sie dies für die restlichen fünf Jiaji-Akupunkturpunkte.
7. Wenn bei Ratten während des Knetvorgangs resistentes Verhalten beobachtet wird, stoppen Sie den Daumendruck, bis sich die Ratte beruhigt hat, und setzen Sie dann den Vorgang fort. Achten Sie darauf, dass der Knetvorgang für jeden Akupunkturpunkt eine Dauer von 1 Minute dauert, auch wenn es während des Prozesses zu einer Unterbrechung kommt.

3. Pfotenentzugsschwelle (PWT)

1. Legen Sie die Ratten vor dem offiziellen Test für 30 Minuten in eine durchsichtige Plexiglasbox auf Drahtgeflecht, um sie an die Umgebung zu gewöhnen.
2. Verwenden Sie verschiedene Größen von von Frey Filamenten (0,6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 g) (siehe Materialtabelle), nachdem die Ratten aufgehört haben zu erforschen und zu pflegen, stimulieren Sie vertikal die Mitte der linken Hinterpfote, erhöhen Sie langsam den Druck, bis die Filamente leicht gebogen sind, stoppen Sie dann den Druck und halten Sie den Druckwert für 5 s.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die dickere Hautpartie in der Mitte der Hinterpfote, wenn Sie die Hinterpfoten mit dem Filament stimulieren.
3. Notieren Sie positives Verhalten als X , wenn die Ratte ein Beinzurückziehen oder eine Fußleckreaktion zeigt, und geben Sie ein geringeres Maß an Stimulusfilament ab. Notieren Sie das Fehlen von positivem Verhalten als O und geben Sie ein höheres Maß an Stimulusfilament.
   HINWEIS: Das Intervall zwischen zwei benachbarten Stimuli sollte größer als 30 s sein.
4. Erkennt 4x hintereinander, wenn X und dann eine Sequenz von aufeinanderfolgenden X O erhalten wird, und wandelt dann die Sequenz gemäß der Methode von Chaplan¹⁸ in den entsprechenden PWT-Wert um.

4. Latenz bei der Pfotenentnahme (PWL)

1. Legen Sie die Ratten vor dem formalen Test 30 Minuten lang in das Hargreaves-Gerät (siehe Materialtabelle), damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können.
2. Stellen Sie die Geräteparameter wie folgt ein: maximale Lichteinwirkungszeit 20 s; Lichteinwirkungsintensität 50 % (siehe Zusatzbild S2).
   HINWEIS: Die maximale Lichteinwirkzeit sollte 20 s nicht überschreiten, um Verbrennungen an den Pfoten der Ratte zu vermeiden, da dies die Genauigkeit der nachfolgenden Testwerte beeinträchtigen würde.
3. Richten Sie das + auf dem Hitzestimulator auf die Mitte der linken Hinterpfote der Ratte aus, nachdem die Ratte aufgehört hat, zu erkunden und zu pflegen. Klicken Sie auf Start, und wenn die Ratte ein Fußhebeverhalten zeigt und das Instrument die Zeitmessung automatisch stoppt, notieren Sie den resultierenden Zeitwert. Führen Sie insgesamt fünf Tests für jede Ratte durch.
   HINWEIS: Das Intervall zwischen den einzelnen Tests für dieselbe Ratte beträgt mindestens 5 Minuten, um Verbrennungen an der Hinterpfotenhaut der Ratte zu vermeiden.
4. Entfernen Sie die Maximal- und Minimalwerte aus den fünf für jede Ratte gemessenen Werten und nehmen Sie den Durchschnitt der verbleibenden drei Werte als PWL-Wert der Ratte.

5. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)

1. Betäuben Sie Ratten am Ende von 2 Wochen MT mit Natrium-Pentobarbital und euthanasieren Sie alle Ratten durch Herzperfusion, nachdem sie vollständig anästhesiert wurden.
2. Entfernen Sie den linken Psoas-Muskel aus Ratte L5 und tauchen Sie ihn für eine 48-stündige Fixierung in 4% Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle).
3. Schneiden Sie das Gewebe auf die entsprechende Größe zu und legen Sie es in eine Einbettungsbox (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie dann den automatischen Dörrautomaten (siehe Materialtabelle) zur Dehydratisierung.
4. Verwenden Sie Paraffinwachs, um das Gewebe einzubetten, und schneiden Sie das Gewebe dann in 5 μm dicke Abschnitte.
5. Die Abschnitte auf Folien montieren und 4 h backen.
6. Legen Sie das Gewebe in den automatischen Färbeer (siehe Materialtabelle) für die anschließende Entparaffinierung, Hämatoxylin-Färbung, Differenzierung, Blaufärbung, Eosin-Färbung, Dehydratisierung und Transparenz¹⁹.
7. Versiegeln Sie die Abschnitte mit neutralem Harz (siehe Materialtabelle) und lassen Sie sie 24 Stunden lang an einem belüfteten Ort stehen.
8. Scannen Sie die Dias mit einem digitalen Diascanner (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Ziel dieser Studie war es, die analgetische Wirkung von MT auf CNLBP-Modellratten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden 24 Ratten nach dem Zufallsprinzip vier Gruppen zugeteilt, nämlich der Blank-, der Schein-, der Modell- und der MT-Gruppe mit jeweils sechs Ratten. Die Blindgruppe erhielt keinen Eingriff, während die scheinoperierte Gruppe nur einen chirurgischen Eingriff erhielt, bei dem die Lendenmuskulatur beiderseits des L4-6-Dornfortsatzes ohne nachfolgenden Eingriff getrennt un...

Diskussion

Derzeit fehlt ein Konsens über ein Tiermodell, das chronische unspezifische Kreuzschmerzen (CNLBP) genau repliziert. Es gibt mehrere Tiermodelle von CNLBP, wie z. B. von Bandscheiben abgeleitete, neurogene, osteoartikuläre und Muskelmodelle²³. Diese Modelle haben jedoch aufgrund der heterogenen Natur der CNLBP in der klinischen Praxis Einschränkungen. Das in dieser Studie verwendete CNLBP-Modell wurde von Hendersons "externer Link"-Modell²⁴

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B