Terapia manuale per un modello di ratto con lombalgia cronica non specifica

Riepilogo

Questo studio propone una procedura standardizzata per la terapia manuale su ratti modello di lombalgia cronica, che sarà di riferimento per la futura ricerca sperimentale sulla terapia manuale.

Abstract

La lombalgia cronica (CLBP) è una condizione molto diffusa in tutto il mondo e una delle principali cause di disabilità. Alla maggior parte dei pazienti con CLBP viene diagnosticata una lombalgia cronica non specifica (CNLBP) dovuta a una causa patologica sconosciuta. La terapia manuale (MT) è un aspetto integrante della medicina tradizionale cinese ed è riconosciuta come Tuina in Cina. Coinvolge tecniche come l'impostazione delle ossa e la manipolazione del rilassamento muscolare. Nonostante la sua efficacia clinica nel trattamento della CNLBP, i meccanismi alla base della MT rimangono poco chiari. Negli esperimenti sugli animali volti a studiare questi meccanismi, una delle sfide principali è il raggiungimento di MT normative su ratti modello CNLBP. Migliorare la stabilità della forza delle dita è una questione chiave nella MT. Per affrontare questa limitazione tecnica, in questo studio viene presentata una procedura standardizzata per la MT su ratti modello CNLBP. Questa procedura migliora significativamente la stabilità della MT con le mani e allevia i problemi comuni associati all'immobilizzazione dei ratti durante la MT. I risultati di questo studio sono di valore di riferimento per future indagini sperimentali sulla MT.

Introduzione

La lombalgia cronica (CLBP) è caratterizzata da lombalgia persistente che dura più di 3 mesi, tipicamente tra la gabbia toracica e la linea trasversale dell'anca, con o senza dolore agli arti inferiori ^1,2. Si tratta di una malattia altamente diffusa, con una prevalenza annua globale stimata del 38% e una prevalenza una tantum del 39%, il che la rende un problema comune di salute pubblica ^3,4. La maggior parte dei pazienti con CLBP, oltre il 90-95%, non può ricevere una diagnosi patologica e anatomica definitiva (come il tumore, la frattura e l'infezione), portando alla classificazione di lombalgia cronica non specifica (CNLBP)^5,6. A causa della natura aspecifica del meccanismo patologico, gli analgesici oppioidi e i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono le principali opzioni di trattamento nella medicina occidentale, ma sono associati a problemi di sicurezza ^7,8. Pertanto, c'è una crescente domanda di medicine complementari e alternative che siano sicure ed efficaci.

La terapia manuale (MT), comunemente indicata come Tui Na in Cina, è un aspetto significativo della medicina tradizionale cinese (MTC) e comprende tecniche come l'impostazione delle ossa e la manipolazione del rilassamento muscolare. Il suo uso diffuso in Cina è attribuito alla sua efficacia clinica, all'elevato profilo di sicurezza e alla non invasività⁹. Nel trattamento della CNLBP, la MT si è dimostrata un'efficace medicina complementare e alternativa con un'efficacia dimostrata in studi precedenti 10,11,12. La MTC ritiene che il ristagno del Qi e la stasi del sangue siano le cause principali del dolore cronico e il Tui Na allevia il dolore promuovendo la circolazione sanguigna e promuovendo il Qi ai muscoli e ai tessuti molli. Tuttavia, nonostante la sua efficacia, il meccanismo preciso alla base del suo effetto terapeutico rimane sfuggente.

Nell'ambito della ricerca sperimentale sulla MT, esistono discrepanze nell'attuazione di interventi su modelli animali. Attualmente, la maggior parte dei ricercatori opta per la traduzione automatica basata su macchine, mentre una minoranza esegue la traduzione automatica utilizzando le mani umane 13,14,15,16. Mentre la traduzione automatica basata su macchine è più standardizzata, la traduzione automatica è più rilevante dal punto di vista clinico e produce dati più rappresentativi. Tuttavia, la MT sugli animali da esperimento è ostacolata dalla forza instabile delle dita, il che porta a una sfida cruciale negli esperimenti sugli animali e ostacola la comparabilità dei risultati sperimentali. Per superare questa sfida tecnica, questo studio propone una soluzione appropriata, che migliora la stabilità della forza delle dita durante la MT su ratti modello CNLBP. La fattibilità di questa soluzione viene verificata, fornendo una guida preziosa per futuri studi sperimentali sulla MT.

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Protocollo

Questo protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Zhejiang e tutte le procedure hanno aderito alla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Lo studio ha utilizzato ratti SD maschi adulti (vedi Tabella dei materiali) con un peso corporeo compreso tra 330 g e 350 g. Tutti i ratti sono stati alloggiati in una struttura per animali standard con un ciclo luce-buio di 12 ore, temperatura di 24 ± 2 °C e umidità del 50 ± 5%. Ai ratti è stato fornito cibo e acqua adeguati. Il seguente protocollo fornisce una descrizione dettagliata dell'istituzione del modello CNLBP e della procedura di terapia manuale.

1. Stabilire il modello di lombalgia secondo i seguenti passaggi (Figura 1)

1. Nutrire i ratti fino a quando non pesano 330-350 g, pesarli e quindi iniettare pentobarbital di sodio al 3% (1 ml/kg) per via intraperitoneale per anestetizzarli (vedi Tabella dei materiali). Attendere 2 minuti, quindi pizzicare delicatamente le quattro dita degli arti posteriori con una pinza e toccare le cornee dei ratti con una pinza per verificare l'assenza di retrazione o risposta ammiccante, indicando che l'anestesia ha avuto successo.
   NOTA: Autoclave in anticipo di tutti gli strumenti chirurgici utilizzati nella modellazione dei ratti e sterilizzazione di altri strumenti non autoclavabili come rasoi, dispositivi ELFS e tavoli termostatici con alcol. L'operatore deve indossare un camice da laboratorio pulito, guanti sterili monouso, maschera, cuffia chirurgica e maschera facciale.
2. Applicare una quantità adeguata di unguento veterinario sugli occhi dei ratti per prevenire l'essiccazione dovuta alla prolungata incapacità di chiudere gli occhi dopo l'anestesia.
3. Posizionare il ratto in posizione sdraiata sternale sulla tabella a temperatura costante, individuare il suo segmento L4-6, radere i peli del segmento e disinfettarli con Iodophor 3x prima di stendere il telo chirurgico monouso per cavità.
4. Tagliare la pelle e la fascia del segmento L4-6 con le forbici chirurgiche, quindi separare i muscoli su entrambi i lati del processo spinoso delle vertebre lombari di questo segmento con un bisturi.
   NOTA: Assicurarsi che il muscolo sia completamente separato dal processo spinoso e che nessuna fibra muscolare rimanga attaccata al processo spinoso. Inoltre, la profondità di separazione dovrebbe estendersi al processo trasverso della colonna lombare.
5. Praticare un foro al centro del processo spinoso di L4-6 con un ago per siringa da 5 mL, quindi caricare il sistema di fissazione del collegamento esterno (ELFS) (vedere la Tabella dei materiali) sul processo spinoso di L4-6.
6. Disinfettare con iodoforo, quindi suturare dopo l'iniezione intramuscolare di 100.000 unità di penicillina (vedi Tabella dei materiali) su ciascun lato della ferita.
   NOTA: Spingere il dispositivo ELFS in avanti per abbassare l'altezza del dispositivo ELFS prima della sutura, quindi suturare sotto la pelle per prevenire l'infezione.
7. Eseguire una radiografia prima che il ratto sia sveglio per determinare se il dispositivo ELFS è collegato correttamente ai processi spinosi L4-6 (Figura 2).
   NOTA: Posizionare il ratto in posizione sdraiata sternale sulla tabella a temperatura costante (vedi Tabella dei materiali) dopo aver eseguito le radiografie, attendere che sia sveglio, quindi rimetterlo nella gabbia e non lasciarlo incustodito fino a quando non è sveglio.
8. Come riportato in precedenza¹⁷, nutrire ogni ratto modello in una singola gabbia per 2 settimane e, se il dispositivo ELFS non cade alla fine delle 2 settimane, il modello CNLBP è considerato riuscito.
   NOTA: Durante il periodo di recupero postoperatorio, alcuni ratti svilupperanno ascessi nella regione lombare a causa di un'infezione; in questo caso, utilizzare una siringa da 2,5 ml per aspirare il pus, quindi sciacquare la ferita con soluzione fisiologica e infine premere la ferita con un batuffolo di cotone per alcuni secondi.
9. Per evitare che i ratti danneggino i dispositivi ELFS l'uno dell'altro, continua a tenere ogni modello di ratto in un'unica gabbia dopo il periodo di recupero di 2 settimane.
   NOTA: Per prevenire la depressione psicologica dei ratti causata dall'alimentazione in gabbia singola, posizionare una palla giocattolo di plastica (vedi Tabella dei materiali) nella gabbia.

2. Procedura per la terapia manuale su ratti modello CNLBP (Figura 3)

1. Prima di MT, eseguire esercizi di stabilità della forza delle dita su un tavolo di pesata (vedi Tabella dei materiali) per 2 settimane. Durante l'esercizio, mantenere una forza di impasto controllata con le dita a circa 600 g con una frequenza di due volte al secondo. Eseguire l'esercizio una volta al giorno per una durata di 10 minuti ogni volta.
2. Prima di MT, acclimatare i ratti modello alla sacca per ratti per 1 settimana. Posiziona la parte superiore del corpo del ratto nella sacca, con la regione lombare e gli arti inferiori esposti. Contemporaneamente, accarezza dolcemente la regione lombare dei ratti per incoraggiarli ad accettare il contatto tra le dita e la regione lombare.
   NOTA: Tagliare la forma di un pezzo di tessuto a forma di ventaglio con un angolo superiore di 90° e un raggio di 12 cm. Quindi, cuci insieme i due lati del tessuto smerlato per creare un sacchetto per topi (vedi Figura supplementare S1).
3. Metti il topo in un sacchetto per topi. A questo punto, la metà superiore del corpo del ratto è coperta dalla sacca per topi e solo la vita e gli arti inferiori sono esposti. Tenere la parte superiore del corpo del ratto a forma di "C" usando la mano non dominante, mentre si esegue la MT sulla regione lombare del ratto con la mano dominante.
   NOTA: Non tenere il busto del topo troppo stretto quando lo si tiene con la mano non dominante. Il torace del ratto sarà compresso e la respirazione sarà ostacolata se il ratto viene tenuto troppo stretto. Inoltre, farà sì che il ratto diventi molto resistente.
4. Trova la posizione esatta dei punti di agopuntura Jiaji (EX-B2). Innanzitutto, determina la posizione del processo spinoso L4-6 del ratto. I punti di agopuntura Jiaji si trovano su entrambi i lati di L4-6, a 0,5 cm dal processo spinoso vertebrale. Ci sono sei agopunti Jiaji in totale.
   NOTA: Nei ratti, le spine di L6 si trovano sulla linea delle due spine iliache antero-superiori e le posizioni di L4 e L5 possono essere trovate contando lungo le spine di L6.
5. Posiziona il pollice sul punto di agopuntura Jiaji del segmento L4-6 del ratto e aumenta gradualmente l'intensità dell'impasto. Quando i ratti modello mostrano comportamenti di resistenza come contorcersi negli arti, urlare forte e lottare forte nello stato di quiete, la forza di impasto in quel momento è il valore massimo di pressione. Assicurarsi che la pressione più appropriata sia leggermente inferiore al valore di pressione massimo, che è il valore di pressione massimo che i ratti possono tollerare senza mostrare comportamenti di resistenza.
6. Inizia con il punto di agopuntura Jiaji sul lato sinistro di L6. Dopo aver trovato il livello di pressione più appropriato per l'agopunto Jiaji del ratto, tenere il pollice a quel livello di pressione il più a lungo possibile mentre si esegue un'azione di impasto a una frequenza di due volte al secondo per una durata di un minuto. Ripeti per i restanti cinque agopunti Jiaji.
7. Se si osserva un comportamento resistente nei ratti durante la procedura di impasto, interrompere la pressione del pollice finché il ratto non si calma, quindi riprendere la procedura. Assicurarsi che il processo di impasto duri 1 minuto per ogni agopunto, anche in caso di interruzione durante il processo.

3. Soglia di prelievo della zampa (PWT)

1. Metti i ratti in una scatola di plexiglass trasparente su una rete metallica per 30 minuti prima del test ufficiale per acclimatarli all'ambiente.
2. Utilizzare filamenti von Frey di diverse dimensioni (0,6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 g) (vedi Tabella dei materiali), dopo che i ratti hanno smesso di esplorare e pulire, stimolare verticalmente il centro della zampa posteriore sinistra, aumentare lentamente la pressione fino a quando i filamenti non sono leggermente piegati, quindi interrompere la pressione e mantenere il valore di pressione per 5 s.
   NOTA: Evitare l'area più spessa della pelle al centro della zampa posteriore quando si stimolano le zampe posteriori con il filamento.
3. Registra un comportamento positivo come X se il ratto mostra una retrazione della gamba o una risposta di leccamento dei piedi e fornisce un livello inferiore di filamento di stimolo. Registra l'assenza di comportamento positivo come O e fornisce un livello più elevato di filamento di stimolo.
   NOTA: L'intervallo tra due stimoli adiacenti deve essere maggiore di 30 s.
4. Rileva 4 volte di seguito quando si ottiene X e quindi una sequenza di X O consecutivi, quindi converti la sequenza nel corrispondente valore PWT secondo il metodo di Chaplan¹⁸.

4. Latenza di prelievo della zampa (PWL)

1. Posizionare i ratti nell'apparato di Hargreaves (vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti prima del test formale per consentire loro di acclimatarsi all'ambiente.
2. Impostare i parametri dello strumento come segue: tempo massimo di esposizione alla luce 20 s; intensità dell'esposizione alla luce 50% (vedi Figura supplementare S2).
   NOTA: Il tempo massimo di esposizione alla luce non deve superare i 20 s per evitare di bruciare le zampe del ratto, che influenzerebbero l'accuratezza dei valori di test successivi.
3. Allineare il + sullo stimolatore di calore con il centro della zampa posteriore sinistra del ratto dopo che il ratto ha smesso di esplorare e pulire. Fare clic su Avvia e, quando il ratto mostra un comportamento di sollevamento del piede e lo strumento interrompe automaticamente il cronometraggio, registrare il valore del tempo risultante. Esegui un totale di cinque test per ogni ratto.
   NOTA: L'intervallo tra ogni test per lo stesso ratto è di almeno 5 minuti per evitare di bruciare la pelle della zampa posteriore del ratto.
4. Togliete i valori massimo e minimo dai cinque valori misurati per ciascun ratto e prendete la media dei tre valori rimanenti come valore PWL del ratto.

5. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

1. Anestetizzare i ratti con pentobarbital sodico al termine di 2 settimane di MT e sopprimere tutti i ratti mediante perfusione cardiaca dopo che sono stati completamente anestetizzati.
2. Rimuovere il muscolo psoas sinistro dal ratto L5 e immergerlo in paraformaldeide al 4% (vedi Tabella dei materiali) per una fissazione di 48 ore.
3. Tagliare il tessuto alla dimensione appropriata e metterlo in una scatola di inclusione (vedere Tabella dei materiali), quindi utilizzare l'essiccatore automatico (vedere Tabella dei materiali) per la disidratazione.
4. Usa la cera di paraffina per incorporare il tessuto, quindi taglia il tessuto in sezioni spesse 5 μm.
5. Montate le sezioni sulle diapositive e cuocete per 4 h.
6. Posizionare i tessuti nel coloratore automatico (vedi Tabella dei materiali) per la successiva deceratura, colorazione con ematossilina, differenziazione, azzurramento, colorazione con eosina, disidratazione e trasparenza¹⁹.
7. Sigillare le sezioni con Resina Neutra (vedi Tabella dei Materiali) e lasciare in luogo ventilato per 24 h.
8. Scansiona i vetrini utilizzando uno scanner digitale per vetrini (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

In questo studio, l'obiettivo era quello di studiare l'effetto analgesico della MT sui ratti modello CNLBP. A questo scopo, 24 ratti sono stati assegnati in modo casuale a quattro gruppi, vale a dire i gruppi bianco, sham-operated, modello e MT, ciascuno contenente sei ratti. Il gruppo bianco non ha ricevuto alcun intervento, mentre il gruppo operato in sham è stato sottoposto solo a una procedura chirurgica in cui i muscoli lombari su entrambi i lati del processo spinoso L4-6 sono stat...

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Discussione

Attualmente, manca un consenso su un modello animale che riproduca accuratamente la lombalgia cronica non specifica (CNLBP). Esistono diversi modelli animali di CNLBP, come i modelli derivati dal disco, neurogeni, quelli di derivazione osteoarticolare e quelli derivati dai muscoli²³. Tuttavia, questi modelli presentano limitazioni a causa della natura eterogenea della CNLBP nella pratica clinica. Il modello CNLBP utilizzato in questo studio è stato modificato dal...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B