טיפול ידני במודל חולדה כרוני לא ספציפי לכאבי גב תחתון

Summary

מחקר זה מציע הליך סטנדרטי לטיפול ידני בחולדות מודל של כאבי גב תחתון כרוניים, אשר יהווה ערך ייחוס למחקר ניסיוני עתידי על טיפול ידני.

Abstract

כאבי גב תחתון כרוניים (CLBP) הם מצב שכיח מאוד ברחבי העולם וגורם עיקרי לנכות. רוב החולים עם CLBP מאובחנים עם כאבי גב תחתון כרוניים לא ספציפיים (CNLBP) עקב סיבה פתולוגית לא ידועה. טיפול ידני (MT) הוא היבט אינטגרלי של הרפואה הסינית המסורתית ומוכר כ-Tuina בסין. זה כולל טכניקות כמו קיבוע עצמות ומניפולציה של הרפיית שרירים. למרות יעילותו הקלינית בטיפול ב-CNLBP, המנגנונים הבסיסיים של MT נותרו לא ברורים. בניסויים בבעלי חיים שמטרתם לחקור מנגנונים אלה, אחד האתגרים העיקריים הוא השגת MT נורמטיבי על חולדות מודל CNLBP. שיפור היציבות של חוזק האצבעות הוא נושא מפתח ב-MT. כדי להתמודד עם מגבלה טכנית זו, נוהל סטנדרטי עבור MT על חולדות מודל CNLBP מוצג במחקר זה. הליך זה משפר משמעותית את היציבות של MT עם הידיים ומקל על בעיות נפוצות הקשורות לשיתוק חולדות במהלך MT. ממצאי מחקר זה הם בעלי ערך ייחוס למחקרים ניסיוניים עתידיים של MT.

Introduction

כאבי גב תחתון כרוניים (CLBP) מאופיינים בכאבי גב תחתון מתמשכים הנמשכים יותר מ-3 חודשים, בדרך כלל בין כלוב הצלעות לקו הירך הרוחבי, עם או בלי כאבי גפיים תחתונות ^1,2. זוהי מחלה נפוצה מאוד, עם שכיחות שנתית עולמית מוערכת של 38% ושכיחות לכל החיים של 39%, מה שהופך אותה לבעיה שכיחה בבריאות הציבור ^3,4. רוב החולים עם CLBP, יותר מ-90-95%, לא יכולים לקבל אבחנה פתולוגית ואנטומית מוחלטת (כגון הגידול, השבר והזיהום), מה שמוביל לסיווג של כאבי גב תחתון כרוניים לא ספציפיים (CNLBP)^5,6. בשל האופי הלא ספציפי של המנגנון הפתולוגי, משככי כאבים אופיואידים ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) הן אפשרויות הטיפול העיקריות ברפואה המערבית אך קשורות לחששות בטיחות ^7,8. לכן, יש ביקוש הולך וגובר לתרופות משלימות ואלטרנטיביות שהן גם בטוחות וגם יעילות.

טיפול ידני (MT), המכונה בדרך כלל Tui Na בסין, הוא היבט משמעותי של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) וכולל טכניקות כמו קיבוע עצם ומניפולציה של הרפיית שרירים. השימוש הנרחב בו בסין מיוחס ליעילות הקלינית שלו, פרופיל הבטיחות הגבוה והלא פולשני^שלו. בטיפול ב-CNLBP, MT נמצאה כרפואה משלימה ואלטרנטיבית יעילה עם יעילות מוכחת שהוכחה במחקרים קודמים 10,11,12. הרפואה הסינית המסורתית מאמינה כי קיפאון צ'י וקיפאון דם הם הגורמים העיקריים לכאב כרוני, וטוי נא מקל על כאבים על ידי קידום זרימת הדם וקידום צ'י לשרירים ולרקמות רכות. עם זאת, למרות יעילותו, המנגנון המדויק העומד בבסיס השפעתו הטיפולית נותר חמקמק.

בתחום המחקר הניסויי על MT, קיימים פערים ביישום התערבויות במודלים של בעלי חיים. נכון לעכשיו, רוב החוקרים בוחרים ב-MT מבוסס מכונה, בעוד שמיעוטם מבצעים MT באמצעות ידיים אנושיות 13,14,15,16. בעוד ש-MT מבוסס מכונה הוא סטנדרטי יותר, MT רלוונטי יותר מבחינה קלינית ומייצר נתונים מייצגים יותר. עם זאת, MT בחיות ניסוי מעוכב על ידי החוזק הלא יציב של האצבעות, מה שמוביל לאתגר מכריע בניסויים בבעלי חיים ופוגע ביכולת ההשוואה של תוצאות הניסוי. כדי להתגבר על אתגר טכני זה, מחקר זה מציע פתרון מתאים, המשפר את יציבות חוזק האצבעות במהלך MT על חולדות מודל CNLBP. ההיתכנות של פתרון זה מאומתת, ומספקת הנחיות חשובות למחקרים ניסיוניים עתידיים של MT.

Protocol

פרוטוקול ניסיוני זה אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית מסורתית, וכל הנהלים דבקו במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר השתמש בחולדות SD זכרים בוגרים (ראו טבלת חומרים) עם משקל גוף שנע בין 330 גרם ל-350 גרם. כל החולדות שוכנו במתקן בעלי חיים סטנדרטי עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, טמפרטורה של 24 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 5%. החולדות קיבלו אספקת מזון ומים נאותים. הפרוטוקול הבא מספק תיאור מפורט של הקמת מודל CNLBP ונוהל טיפול ידני.

1. קבע את מודל כאבי הגב התחתון לפי השלבים הבאים (איור 1)

1. האכילו את החולדות עד שהן שוקלות 330-350 גרם, שקלו אותן, ולאחר מכן הזריקו 3% נתרן פנטוברביטל (1 מ"ל/ק"ג) תוך צפקית כדי להרדים אותן (ראו טבלת חומרים). המתן 2 דקות, ואז צבט בעדינות את ארבע אצבעות הגפיים האחוריות בעזרת מלקחיים, וגע בקרניות של החולדות עם מלקחיים כדי לבדוק אם אין נסיגה או תגובה מהבהבת, מה שמעיד על כך שההרדמה הצליחה.
   הערה: חיטוי מראש של כל המכשירים הכירורגיים המשמשים בדוגמנות חולדות ולעקר מכשירים אחרים שאינם ניתנים לחיטוי כגון מכונות גילוח, מכשירי ELFS ושולחנות תרמוסטטיים עם אלכוהול. על המפעיל ללבוש חלוק מעבדה נקי, כפפות סטריליות חד פעמיות, מסכה, כובע כירורגי ומסכת פנים.
2. יש למרוח כמות מתאימה של משחה וטרינרית על עיני החולדות כדי למנוע התייבשות עקב חוסר יכולת ממושכת לעצום עיניים לאחר ההרדמה.
3. הנח את החולדה במצב שכיבה חזה על טבלת הטמפרטורה הקבועה, אתר את קטע L4-6 שלה, גלח את שיער הקטע וחטא אותו עם יודופור 3x לפני שמורחים את וילון חלל הניתוח החד פעמי.
4. חותכים את העור והפאשיה של קטע L4-6 בעזרת מספריים כירורגיים, ואז מפרידים את השרירים משני צידי התהליך הקוצני של החוליות המותניות של קטע זה בעזרת אזמל.
   הערה: ודא שהשריר מופרד לחלוטין מהתהליך הקוצני ושלא יישארו סיבי שריר מחוברים לתהליך הקוצני. יתר על כן, עומק ההפרדה צריך להתרחב לתהליך הרוחבי של עמוד השדרה המותני.
5. קדחו חור באמצע התהליך הקוצני של L4-6 עם מחט מזרק של 5 מ"ל, ולאחר מכן טענו את מערכת קיבוע הקישור החיצוני (ELFS) (ראה טבלת חומרים) על התהליך הקוצני של L4-6.
6. יש לחטא עם יודופור, ולאחר מכן לתפור לאחר הזרקה תוך שרירית של 100,000 יחידות פניצילין (ראה טבלת חומרים) בכל צד של הפצע.
   הערה: דחוף את מכשיר ה-ELFS קדימה כדי להוריד את גובה מכשיר ה-ELFS לפני התפירה, ולאחר מכן תפר מתחת לעור כדי למנוע זיהום.
7. קחו צילום רנטגן לפני שהחולדה ערה כדי לקבוע אם מכשיר ה-ELFS מחובר בהצלחה לתהליכים הקוצניים L4-6 (איור 2).
   הערה: הנח את החולדה במצב שכיבה חזה על טבלת הטמפרטורה הקבועה (ראה טבלת חומרים) לאחר צילום הצילומים, המתן עד שהיא ערה, ואז החזר אותה לכלוב, ואל תשאיר אותה ללא השגחה עד שהיא ערה.
8. כפי שדווח בעבר¹⁷, האכילו כל חולדה מודל בכלוב יחיד למשך שבועיים, ואם מכשיר ה-ELFS לא נופל בתום השבועיים, מידול CNLBP נחשב למוצלח.
   הערה: במהלך תקופת ההחלמה שלאחר הניתוח, כמה חולדות יפתחו מורסות באזור המותני עקב זיהום; במקרה זה, השתמש במזרק של 2.5 מ"ל כדי לשאוב את המוגלה, ואז שטוף את הפצע במי מלח, ולבסוף לחץ על הפצע בעזרת צמר גפן למשך מספר שניות.
9. כדי למנוע מהחולדות לפגוע במכשירי ELFS זו של זו, המשיכו להחזיק כל חולדה מודל בכלוב יחיד לאחר תקופת ההחלמה של שבועיים.
   הערה: כדי למנוע דיכאון פסיכולוגי של חולדות הנגרם על ידי האכלה בכלוב יחיד, הניחו צעצוע כדורי מפלסטיק (ראו טבלת חומרים) בכלוב.

2. נוהל לטיפול ידני בחולדות מודל CNLBP (איור 3)

1. לפני MT, בצע תרגילי יציבות כוח אצבעות על שולחן שקילה (ראה טבלת חומרים) למשך שבועיים. במהלך התרגיל, שמרו על כוח לישה מבוקר של האצבע בכ-600 גרם בתדירות של פעמיים בשנייה. ערכו את התרגיל פעם ביום למשך 10 דקות בכל פעם.
2. לפני MT, התאקלמו את חולדות המודל לכיס החולדה למשך שבוע. הנח את פלג הגוף העליון של החולדה לתוך השקית, כשאזור המותניים והגפיים התחתונות חשופים. במקביל, לטפו בעדינות את האזור המותני של החולדות כדי לעודד אותן לקבל את המגע בין האצבעות לאזור המותני.
   הערה: חותכים את צורת פיסת הבד לצורת מניפה עם זווית עליונה של 90° ורדיוס של 12 ס"מ. לאחר מכן, תפרו את שני הצדדים של הבד המסולסל יחד כדי ליצור נרתיק חולדה (ראו איור משלים S1).
3. הניחו את החולדה בשקית חולדות. בשלב זה, המחצית העליונה של גוף החולדה מכוסה בכיס החולדה, ורק המותניים והגפיים התחתונות חשופות. החזיקו את פלג הגוף העליון של החולדה בצורת "C" באמצעות היד הלא דומיננטית, תוך ביצוע MT על אזור המותני של החולדה עם היד הדומיננטית.
   הערה: אל תחזיק את פלג הגוף העליון של החולדה חזק מדי כאשר אתה מחזיק אותו ביד הלא דומיננטית. בית החזה של החולדה יידחס והנשימה תיפגע אם החולדה מוחזקת חזק מדי. זה גם יגרום לחולדה להיות עמידה מאוד.
4. מצא את המיקום המדויק של נקודות הדיקור של Jiaji (EX-B2). ראשית, קבע את מיקום התהליך הקוצני L4-6 של החולדה. נקודות הדיקור של Jiaji ממוקמות משני צידי L4-6, 0.5 ס"מ מהתהליך הקוצני החולייתי. ישנן שש נקודות דיקור של ג'יאג'י בסך הכל.
   הערה: בחולדות, הקוצים של L6 נמצאים על הקו של שני הקוצים הכסליים העליונים הקדמיים, וניתן למצוא את מיקומם של L4 ו-L5 על ידי ספירה לאורך הקוצים של L6.
5. הנח את האגודל על נקודת הדיקור של ג'יאג'י של קטע L4-6 של החולדה והגביר בהדרגה את עוצמת הלישה. כאשר חולדות המודל מראות התנהגויות התנגדות כמו התפתלות גפיים, צרחות חזקות ומאבק חזק במצב שקט, כוח הלישה באותו זמן הוא ערך הלחץ המקסימלי. ודא שהלחץ המתאים ביותר הוא מעט פחות מערך הלחץ המקסימלי, שהוא ערך הלחץ המקסימלי שהחולדות יכולות לסבול מבלי להראות התנהגויות התנגדות.
6. התחל עם נקודת הדיקור של ג'יאג'י בצד שמאל של L6. לאחר מציאת רמת הלחץ המתאימה ביותר לנקודת הדיקור של הג'יאג'י של החולדה, החזק את האגודל ברמת הלחץ הזו זמן רב ככל האפשר תוך ביצוע פעולת לישה בתדירות של פעמיים בשנייה למשך דקה אחת. חזור על הפעולה עבור חמש נקודות הדיקור הנותרות של Jiaji.
7. אם נצפתה התנהגות עמידה בחולדות במהלך הליך הלישה, הפסק את לחץ האגודל עד שהחולדה נרגעת, ולאחר מכן המשך את ההליך. ודא שתהליך הלישה נמשך דקה אחת לכל נקודת דיקור, גם אם יש הפרעה במהלך התהליך.

3. סף משיכת כפות (PWT)

1. הניחו את החולדות בקופסת פרספקס שקופה על רשת תיל למשך 30 דקות לפני הבדיקה הרשמית כדי להתאקלם בסביבה.
2. השתמש בגדלים שונים של חוטי פון פריי (0.6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 גרם) (ראה טבלת חומרים), לאחר שהחולדות הפסיקו לחקור ולטפח, לעורר אנכית את אמצע הכף האחורית השמאלית, להגביר לאט את הלחץ עד שהחוטים כפופים מעט, ואז להפסיק את הלחץ ולשמור על ערך הלחץ למשך 5 שניות.
   הערה: הימנע מאזור העור העבה יותר באמצע הכף האחורית בעת גירוי הכפות האחוריות עם הנימה.
3. רשום התנהגות חיובית כ-X אם החולדה מראה נסיגת רגליים או תגובת ליקוק כף הרגל ותן רמה נמוכה יותר של חוט גירוי. רשום את היעדר ההתנהגות החיובית כ-O ותן רמה גבוהה יותר של נימה גירוי.
   הערה: המרווח בין שני גירויים סמוכים צריך להיות גדול מ-30 שניות.
4. זהה 4x ברצף כאשר X ולאחר מכן מתקבל רצף של X O עוקב, ולאחר מכן המר את הרצף לערך ה-PWT המתאים לפי השיטה של צ'פלן¹⁸.

4. חביון משיכת כפות (PWL)

1. הנח את החולדות במנגנון הרגריבס (ראה טבלת חומרים) למשך 30 דקות לפני המבחן הרשמי כדי לאפשר להן להתאקלם בסביבה.
2. הגדר את פרמטרי המכשיר כדלקמן: זמן חשיפה מרבי לאור 20 שניות; עוצמת החשיפה לאור 50% (ראה איור משלים S2).
   הערה: זמן החשיפה המרבי לאור לא יעלה על 20 שניות כדי למנוע שריפת כפות החולדה, מה שישפיע על הדיוק של ערכי הבדיקה הבאים.
3. יישר את ה-+ על ממריץ החום עם מרכז כף הרגל האחורית השמאלית של החולדה לאחר שהחולדה הפסיקה לחקור ולטפח. לחץ על התחל, וכאשר החולדה מפגינה התנהגות הרמת רגל והמכשיר מפסיק אוטומטית את התזמון, רשום את ערך הזמן המתקבל. בצע בסך הכל חמש בדיקות לכל חולדה.
   הערה: המרווח בין כל בדיקה לאותה חולדה הוא לפחות 5 דקות כדי למנוע צריבה בעור הכף האחורית של החולדה.
4. הסר את ערכי המקסימום והמינימום מחמשת הערכים שנמדדו עבור כל חולדה, וקח את הממוצע של שלושת הערכים הנותרים כערך ה-PWL של החולדה.

5. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

1. להרדים חולדות עם נתרן פנטוברביטל בתום שבועיים של MT ולהמית את כל החולדות על ידי זלוף לב לאחר הרדמה מלאה.
2. הסר את שריר הפסואס השמאלי מהחולדה L5 וטבול ב-4% פרפורמלדהיד (ראה טבלת חומרים) למשך 48 שעות.
3. חתוך את הטישו לגודל המתאים והנח אותה בקופסת הטבעה (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן השתמש במייבש האוטומטי (ראה טבלת חומרים) להתייבשות.
4. השתמש בשעוות פרפין כדי להטמיע את הרקמה, ולאחר מכן חתוך את הרקמה לחלקים בעובי 5 מיקרומטר.
5. הרכיבו את החלקים על שקופיות ואפו במשך 4 שעות.
6. הנח רקמות במכתים האוטומטיים (ראה טבלת חומרים) להסרת שעווה, צביעת המטוקסילין, התמיינות, הכחולה, צביעת אאוזין, התייבשות ושקיפות¹⁹.
7. אטמו את החלקים בשרף ניטרלי (ראה טבלת חומרים) והשאירו במקום מאוורר למשך 24 שעות.
8. סרוק את השקופיות באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

במחקר זה, המטרה הייתה לחקור את ההשפעה משכך הכאבים של MT על חולדות מודל CNLBP. למטרה זו, 24 חולדות הוקצו באופן אקראי לארבע קבוצות, כלומר קבוצות ריקות, המופעלות על ידי דמה, מודל ו-MT, שכל אחת מהן מכילה שש חולדות. הקבוצה הריקה לא קיבלה כל התערבות, בעוד שהקבוצה שנותחה בדמה עברה רק הליך...

Discussion

נכון לעכשיו, חסר קונצנזוס על מודל בעלי חיים המשחזר במדויק כאבי גב תחתון כרוניים לא ספציפיים (CNLBP). קיימים מודלים מרובים של בעלי חיים של CNLBP, כגון מודלים שמקורם בדיסק, נוירוגניים, נגזרים אוסטאוארטיקולרים ומודלים שמקורם בשרירים²³. עם זאת, למודלים אלה יש מגבלות בש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B