Detección en tiempo real de la afinidad dinámica entre biomoléculas mediante la tecnología de resonancia de plasmones de superficie (SPR)

Resumen

El presente estudio tiene como objetivo dilucidar el principio y la metodología de la tecnología de resonancia de plasmones de superficie (SPR), que encuentra aplicaciones versátiles en múltiples dominios. Este artículo describe la tecnología SPR, su simplicidad operativa y su notable eficacia, con el objetivo de fomentar una mayor conciencia y adopción de esta tecnología entre los lectores.

Resumen

La tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) es un método sensible y preciso para detectar virus, proteínas moleculares patógenas y receptores, determinar grupos sanguíneos y detectar adulteración de alimentos, entre otras detecciones biomoleculares. Esta tecnología permite la identificación rápida de posibles enlaces entre biomoléculas, lo que facilita un cribado rápido, fácil de usar y no invasivo de varios indicadores sin necesidad de etiquetado. Además, la tecnología SPR facilita la detección en tiempo real para el cribado de fármacos de alto rendimiento. En este programa, se presenta brevemente el campo de aplicación y los principios básicos de la tecnología SPR. El proceso de operación se describe en detalle, comenzando con la calibración del instrumento y la operación básica del sistema, seguido de la captura de ligandos y el análisis multiciclo del analito. Se elaboró la curva en tiempo real y los resultados experimentales de la unión de quercetina y calicosina a la proteína KCNJ2. En general, la tecnología SPR proporciona un método altamente específico, simple, sensible y rápido para el cribado de medicamentos, la detección en tiempo real de la farmacocinética relacionada, la detección de virus y la identificación ambiental y de seguridad alimentaria.

Introducción

La tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) es una técnica de detección óptica que elimina la necesidad de etiquetar el analito. Permite el monitoreo dinámico y en tiempo real de la afinidad de unión cuantitativa, la cinética y la termodinámica. Esta capacidad de alto rendimiento es altamente sensible y reproducible, lo que permite la medición de varias tasas de apertura, tasas de apagado y afinidad. Además, la pequeña cantidad de muestra requerida mejora aún más la utilidad de este método ^1,2. El método de detección biomolecular de respuesta rápida³, que monitorea la unión por afinidad entre biomoléculas, se ha convertido en un área de investigación destacada.

La tecnología SPR tiene diversas aplicaciones en el campo de la investigación y el desarrollo de medicamentos⁴. Uno de sus usos es el descubrimiento de las bases estructurales de dianas farmacológicas específicas. También se puede emplear para identificar los ingredientes activos de las hierbas chinas que poseen actividades farmacológicas significativas y estudiar sus mecanismos para la detección y verificación de medicamentos. Gassner et al. han establecido una curva lineal dosis-respuesta para anticuerpos biespecíficos a través de la determinación de SPR, lo que permite el análisis de concentración y el control de calidad⁵. Además, la SPR puede utilizarse para la realización de pruebas clínicas de inmunogenicidad en farmacopea y desarrollo de vacunas⁶.

Un área donde se puede utilizar es en la detección de residuos de plaguicidas, residuos de medicamentos veterinarios, aditivos ilegales, bacterias patógenas y metales pesados 7,8,9,10 en productos agrícolas y pruebas de seguridad alimentaria. Mediante el uso de la tecnología SPR, se puede mejorar la precisión y la eficiencia de estas pruebas.

Otra área en la que se puede aplicar la tecnología SPR es en la detección rápida de toxinas y antibióticos. Esta tecnología permite la unión de anticuerpos virales, compuestos de moléculas pequeñas y aptámeros al chip biosensor SPR. A continuación, el chip biosensor SPR detecta diferentes concentraciones de ARN viral como el analito¹¹. Este método se ha utilizado con éxito en la detección rápida de virus como el H5N1, el virus de la gripe aviar H7N9 y el nuevo coronavirus 12,13,14. Además de estas aplicaciones, la tecnología SPR también es útil en proteómica, cribado de fármacos, detección en tiempo real de farmacocinética relacionada y estudio de proteínas y receptores virales y patógenos 15,16,17,18. Es particularmente adecuado para la investigación científica y los experimentos de enseñanza en universidades e institutos de investigación y es una herramienta valiosa en diversos entornos científicos y de investigación.

El principio de SPR es el movimiento oscilatorio colectivo de electrones libres en la interfaz entre una película metálica y un dieléctrico, causado^{por ondas de} luz incidentes. Es esencialmente la resonancia entre la onda evanescente y la onda de plasma en la superficie del metal²⁰. Cuando la luz pasa de un medio fotodenso a un medio fotofóbico, se produce una reflexión total bajo ciertas condiciones. Desde la perspectiva de la óptica ondulatoria, cuando la luz incidente llega a la interfaz, no genera inmediatamente la luz reflejada. En cambio, primero pasa a través del medio ópticamente fóbico a una profundidad de aproximadamente una longitud de onda. Luego fluye a lo largo de la interfaz durante aproximadamente media longitud de onda antes de regresar al medio ópticamente denso. Esta onda que pasa a través del medio ópticamente fóbico se denomina onda evasiva, siempre que la energía total de la luz permanezca constante. Dado que el metal contiene gas electrón libre, puede considerarse como plasma. La luz incidente excita la vibración longitudinal del gas de electrones, lo que lleva a la generación de una onda de densidad de carga a lo largo de la interfaz metal-dieléctrico, conocida como onda de plasma superficial. Esta resonancia se propaga en forma de atenuación exponencial en ambos medios. En consecuencia, la energía de la luz reflejada se reduce significativamente. El ángulo de incidencia correspondiente en el que la luz reflejada desaparece por completo se conoce como ángulo de resonancia²¹. SPR es altamente sensible al índice de refracción del medio que se adhiere a la superficie de la película metálica²⁰. El ángulo SPR varía con el índice de refracción de la superficie de la película metálica, siendo el cambio del índice de refracción principalmente proporcional a la masa molecular de la superficie de la película metálica²². Cualquier cambio en las propiedades del medio superficial o en la cantidad de adherencia dará lugar a diferentes ángulos de resonancia. Por lo tanto, la interacción molecular se puede analizar examinando los cambios en el ángulo de resonancia.

Este análisis SPR óptico no destructivo, sin etiquetas y en tiempo real, basado en los principios anteriores, es adecuado para la investigación en diversos campos. Por lo tanto, demostramos el desplazamiento angular de la curva SPR y los resultados experimentales mediante análisis multiciclo, tomando como ejemplo la combinación de quercetina y calicosina con la proteína recombinante KCNJ2.

Protocolo

NOTA: La curva completa de detección experimental indica que el proceso experimental se puede clasificar en ocho etapas distintas.

1. Preparación de muestras y tampones

1. Prepare los chips sensores antes del experimento.
   1. Tratar las patatas fritas con la solución de piraña (30% H₂O₂: H₂SO₄=1:3; v/v) durante 2 min. Posteriormente, limpie a fondo el chip con una gran cantidad de agua desionizada y luego sumérjalo en etanol anhidro, permitiendo que se seque de forma natural.
   2. A continuación, remoje el chip durante la noche en una solución de 11-mercapto-l-undecanol (MUOH) con una concentración de 50 M. A continuación, coloque el chip en una solución de epiclorhidrina y deje que reaccione a 25 °C durante 4 h.
   3. Retire la viruta de la solución y lávela bien con agua destilada y etanol anhidro. Por último, deje caer la solución básica de dextrano sobre la superficie de la película de oro del chip y deje que reaccione a 25 °C durante 20 h. Limpie el chip con agua desionizada y luego sumérjalo en una solución de ácido bromoacético para lograr la modificación de la carboximetilación de hidroxilo dextrano. Utiliza quercetina y calicosina con pureza ≥98,5% y ≥99%, respectivamente.
2. Prepare todos los tampones que contengan tampón de funcionamiento, activador, tampón de inmovilización (acetato de sodio 10 mM) y solución de regeneración 10 mM de glicina-HCl, pH 1,5. El activador contiene 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 750 mg de clorhidrato de carbodiimida (EDC) de 1-etil-3-(3-dimetil aminopropilo) y 10,5 mL de clorhidrato de etanolamina-NaOH 1 M a pH 8,5. Disuelva el EDC y el NHS agregando 10 mL de agua desionizada filtrada a cada vial (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: Almacene las alícuotas de EDC y NHS a -18 °C o menos, use las alícuotas dentro de los 2 meses. Todas las soluciones deben desgasificarse antes de su uso.

2. Calibración del instrumento

1. Dibuje una curva estándar de concentración de alcohol y valor máximo inyectando alcohol a diferentes concentraciones (2%, 1%, 0.5%, 0.2% y 0.1% de relación de volumen) en oro desnudo y comparando el valor máximo máximo de alcohol.
   NOTA: Inyectando a un caudal de 50 μL/min, mediante el software de análisis de datos de origen se obtuvo una curva estándar.
2. De acuerdo con el manual técnico, calcule el factor de corrección del instrumento, representado por K, utilizando la fórmula:
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   En esta fórmula, A y B representan los valores de señal de los detectores respectivos. El valor teórico de la pendiente, como se indica en el manual, es de 0,06. Por lo tanto, el factor de corrección, K, se puede calcular como K=0.06/R, (donde R es la pendiente de la ecuación de regresión lineal obtenida de la curva estándar).
3. Multiplique el valor medido de Δ[(A-B)/(A+B)] por el factor de corrección para obtener el valor real de Δθ.

3. Funcionamiento básico del sistema

1. Para iniciar el sistema, encienda el interruptor de encendido y espere hasta que la unidad de detección alcance la temperatura preestablecida (generalmente 25 °C).
2. Abra el software de control haciendo clic en Iniciar > programa > el software de control OpenSPRTM, y el programa de software se conectará automáticamente al sistema host después de ejecutarse.
3. Siga el procedimiento operativo estándar del instrumento SPR para instalar el chip COOH (chip a base de glucano). En primer lugar, coloque una gota de aceite de cedro en la parte posterior del biochip SPR. Luego, conecte el chip COOH a la superficie del prisma del sensor, asegurándose de que no haya burbujas de aire entre el chip y el prisma. Finalmente, instale la piscina de flujo y afírela al punto de luz.
   NOTA: Coloque la piscina de flujo en la ranura designada y fíjela firmemente con los tornillos de fijación. Las dimensiones del canal son 10 mm x 1 mm x 1 mm.
4. Colocación de fichas
   1. Para abrir la escotilla de chips, seleccione la opción Insertar chip en el menú Herramientas . Si ya hay un chip en la bahía de chips, haga clic en la opción Expulsar chip en el menú Herramientas .
   2. Seleccione el tipo de chip correspondiente en el menú desplegable de tipo de chip si utiliza un chip nuevo y complete el ID del chip con la información experimental relacionada con el chip. Se puede rellenar el número de lote de la ficha (opcional). Si se trata de un chip usado, seleccione Reutilizar chip y busque la información del chip correspondiente en el menú desplegable ID de chip.
   3. Sostenga el chip con el lado de la palabra hacia arriba, empuje suavemente el chip en la ranura de la tarjeta siguiendo la dirección de la flecha en el chip y finalmente cierre la puerta del compartimiento del chip.
   4. Haga clic en el botón Dock Chip . El sistema cambiará automáticamente al estado de espera después de colocar el chip.
   5. Para enjuagar todo el sistema de flujo interno a un caudal alto, seleccione Herramientas > comando Prime > Inicio. Todo el proceso dura entre 6 y 7 minutos. Haga clic en Cerrar para cambiar automáticamente el sistema al estado de espera.
5. Mantenga presionado el botón negro en el lado derecho del soporte del tubo y abra la tapa metálica hacia la izquierda. Después de colocar el tubo de ensayo adecuado, cierre suavemente la tapa metálica. Si escucha un clic, la cubierta metálica está bloqueada.
6. Empuje suavemente el soporte del tubo de ensayo a lo largo de la ranura de la tarjeta en el compartimento de muestras y escuche un sonido de clic, lo que indica que el soporte del tubo de ensayo está en la posición correcta y bloqueado.
7. Haga clic en OK en el cuadro de diálogo Expulsar bandeja de rack para introducir automáticamente la bandeja en el compartimento de muestras y cerrar la puerta.
   NOTA: Hay un límite de tiempo cuando se abre la puerta de la cabina de muestras. La puerta se cerrará automáticamente después de 60 segundos de apertura. En los últimos 15 segundos, la cuenta regresiva en el cuadro de diálogo aparece en fuente roja y parpadea. Espere a que la puerta se cierre antes de volver a abrirla para evitar pellizcarse la mano.
8. Normalización de las señales de respuesta
   1. Seleccione Herramienta > Más herramientas, seleccione Normalizar en el directorio Herramientas de mantenimiento y haga clic en Iniciar > Siguiente.
   2. Añadir 120 μL de solución normalizante de BIA al 70% en un tubo de ensayo de 7 mm. Coloque el tubo de ensayo en la posición especificada que se muestra en el programa (R2F6). Después de confirmar que la tapa del soporte del tubo está cerrada correctamente, coloque el soporte del tubo en el compartimiento de muestra y cierre la puerta de la cabina, y haga clic en Iniciar para ejecutar el programa.

4. Captura de ligandos

1. Medición de pH
   1. Antes de fijar los ligandos en el chip, cribar un pH tampón de ligando adecuado para enriquecer los ligandos cerca de la superficie del chip a través de la adsorción electrostática para lograr un mejor efecto de acoplamiento. La concentración general de ligando es de 10-100 μg/mL, y para el primer experimento, intente usar 20 μg/mL.
   2. Cribar el ligando con acetato de sodio de 10 mM con valores de pH de 5,5, 5,0, 4,5 y 4. Para establecer los parámetros del proceso, seleccione Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization pH Scouting y haga clic en Nuevo.
   3. Seleccione el canal del chip, que se puede elegir entre los canales 1, 2, 3 o 4. El tampón tiene cuatro condiciones preestablecidas: acetato de sodio de 10 mM, pH 5,5, 5,0, 4,5 y 4. A continuación, introduzca el nombre del ligando, el tiempo de contacto (180 s) y el caudal (5 μL/min).
   4. Después de que la superficie se regenere con 50 mM de NaOH, configure la temperatura de la superficie del chip y la temperatura de la cámara de muestra. A continuación, seleccione el bastidor de muestras y reactivos1 a la izquierda y coloque la solución de acuerdo con la posición correspondiente en el bastidor de muestras. Guarde el método experimental e inicie el experimento haciendo clic en Siguiente.
2. Inmovilización de ligandos
   1. Seleccione Ejecutar-Asistente, Preparación-Inmovilización de superficies y haga clic en Nuevo. Establezca la capacidad de movilización en cuatro canales: FC1, FC2, FC3 y FC4. Generalmente, el canal 1 se utiliza como referencia cuando se emparejan los canales 1 y 2, y el canal 3 es la referencia cuando se movilizan los cuatro canales.
   2. Utilice los canales de referencia para el contraste en blanco o la fijación sin ligandos cerrada por activación, utilizando los canales 1 y 2 para acoplar ligandos en el canal 2.
      NOTA: Hay dos modos de acoplamiento disponibles: apuntar al nivel inmovilizado y especificar el tiempo de contacto. En el modo de objetivo de nivel inmovilizado, ingrese el nivel de acoplamiento objetivo y el software alcanzará automáticamente el nivel correspondiente. El modo de tiempo de contacto requiere la entrada del tiempo de inyección y el caudal y generalmente se usa en base a experimentos previos.

5. Método de analito multiciclo

1. Ejecute Prime y llene la jeringa y la cámara con un tampón fijo. Seleccione Ejecución-Ejecución manual , seleccione Canales 1-2 en serie en la ruta de flujo y haga clic en Iniciar.
2. Comience a funcionar al caudal máximo (150 μL/min) y detecte el tampón que es HEPES (pH 7,4). Cuando se alcance una línea de base estable, enjuague el anillo de muestra con tampón y vacíe el anillo de muestra.
   NOTA: Si la línea de base (una línea de equilibrio formada en la curva de detección cuando se ejecuta el tampón) no se alcanza dentro de los 10 minutos, intente inyectar 10 mM de hidróxido de sodio durante 30 s.
3. Active el chip con la solución EDC/NHS (1:1, 50 μL cada uno).
4. Ejecute 200 μL de ligando diluido con el tampón activado en la muestra durante 4 min. Una vez estabilizada la unión, lave el anillo de muestra con tampón.
5. Muestree 200 μL de solución de bloqueo, enjuague el anillo de muestra con tampón y vacíelo con aire. Observe la línea de base durante 5 minutos para garantizar la estabilidad.
6. Diluya los analitos con una solución tampón, luego tome 3,9 μM, 7,8 μM, 15,625 μM y 31,25 μM de quercetina, y 15,625 μM, 31,25 μM, 62,5 μM, 125 μM y 250 μM de calicosina, como muestras a 20 μL/min.
7. El tiempo de unión de la proteína (10 μg/mL-50 μg/mL) y el ligando es de 240 s, con un tiempo de disociación natural de 360 s. Aumente el caudal a 150 μL/min e inyecte el tampón de regeneración adecuado para eliminar el analito.

6. Regeneración

1. Para la regeneración, use 10 mM de glicina-HCl, soluciones con alto contenido de sal o ácido-base de diferentes niveles de pH (por ejemplo, 2.5, 4.5, 5.0, 5.5, etc.).
2. Para examinar las condiciones de regeneración, utilice la exploración de desarrollo-regeneración run-wizard-assay y haga clic en Nuevo. Seleccione 1-2 canales en serie en la ruta de flujo, seleccione el chip y haga clic en Siguiente.
3. Para calentar el chip, haga clic en Inicio, lo que debe hacerse más de 3 veces. Introduzca el nombre del analito y ajuste el caudal de la solución regenerada a 150 μL/min.

7. Análisis de datos

1. Analice los resultados experimentales utilizando un software de análisis de datos SPR, utilizando el modelo de análisis One to One.
   NOTA: Todo el proceso se lleva a cabo en el búfer en ejecución. Los otros tampones utilizados en el proceso de ensayo SPR son los mismos que el tampón de inyección.

8. Mantenimiento del sistema

1. Después de completar el experimento, retire el chip de detección y reemplácelo con el chip de mantenimiento. Reemplace el tampón de funcionamiento con suficiente agua pura fresca y enjuague el sistema con cebado. Una vez cebado, el sistema cambiará automáticamente al modo de espera para limpiar la botella de líquido residual y cambiar el agua de la aguja.

Resultados

Para determinar si la proteína está fija en la superficie del chip, se utiliza la ordenada (señal de respuesta) del mapa del sensor SPR (Figura 1), mientras se obtiene el desplazamiento angular de la curva SPR. La Figura 2 y la Figura 3 muestran la curva SPR de la interacción entre la quercetina y la calicosina con la proteína recombinante KCNJ2 en la superficie inmovilizada de la proteína rec...

Discusión

El ciclo de análisis SPR se divide en cuatro etapas. La primera etapa, la línea de base, implica la inyección del tampón. A continuación se encuentra la segunda etapa, la captura de ligandos. El chip sensor COOH se activa con EDC/NHS (1:1) a un caudal de 20 μL/min. A continuación, el chip se desactiva utilizando clorhidrato de etanolamina-NaOH 1 M a un caudal de 20 μL/min. Pasando a la tercera etapa, el método del analito multiciclo. El analito se inyecta en el canal a un caudal...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873