Rilevamento in tempo reale dell'affinità dinamica tra biomolecole utilizzando la tecnologia SPR (Surface Plasmon Resonance)

Riepilogo

Il presente studio mira a chiarire il principio e la metodologia della tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR), che trova applicazioni versatili in più domini. Questo articolo descrive la tecnologia SPR, la sua semplicità operativa e la sua notevole efficacia, con l'obiettivo di promuovere una più ampia consapevolezza e adozione di questa tecnologia tra i lettori.

Abstract

La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è un metodo sensibile e preciso per rilevare virus, proteine molecolari patogene e recettori, determinare i gruppi sanguigni e rilevare l'adulterazione degli alimenti, tra le altre rilevazioni biomolecolari. Questa tecnologia consente la rapida identificazione del potenziale legame tra le biomolecole, facilitando uno screening rapido, facile da usare e non invasivo di vari indicatori senza la necessità di etichettatura. Inoltre, la tecnologia SPR facilita il rilevamento in tempo reale per lo screening dei farmaci ad alto rendimento. In questo programma vengono brevemente introdotti il campo di applicazione e i principi di base della tecnologia SPR. Il processo operativo è descritto in dettaglio, a partire dalla calibrazione dello strumento e dal funzionamento di base del sistema, seguito dalla cattura del ligando e dall'analisi multiciclo dell'analita. Sono stati elaborati la curva in tempo reale e i risultati sperimentali del legame tra quercetina e calicosina e proteina KCNJ2. Nel complesso, la tecnologia SPR fornisce un metodo altamente specifico, semplice, sensibile e rapido per lo screening dei farmaci, il rilevamento in tempo reale della farmacocinetica correlata, il rilevamento di virus e l'identificazione ambientale e di sicurezza alimentare.

Introduzione

La tecnologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è una tecnica di rilevamento ottico che elimina la necessità di marcare l'analita. Consente il monitoraggio dinamico e in tempo reale dell'affinità quantitativa di legame, della cinetica e della termodinamica. Questa capacità di produzione elevata è altamente sensibile e riproducibile, consentendo la misurazione di vari tassi di apertura, velocità di spegnimento e affinità. Inoltre, la piccola quantità di campione richiesta aumenta ulteriormente l'utilità di questo metodo ^1,2. Il metodo di rilevamento biomolecolare a risposta rapida³, che monitora il legame di affinità tra le biomolecole, è emerso come un'importante area di ricerca.

La tecnologia SPR ha varie applicazioni nel campo della ricerca e dello sviluppo di farmaci⁴. Uno dei suoi usi è quello di scoprire le basi strutturali di specifici bersagli farmacologici. Può anche essere impiegato per identificare i principi attivi delle erbe cinesi che possiedono attività farmacologiche significative e studiarne i meccanismi per lo screening e la verifica dei farmaci. Gassner et al. hanno stabilito una curva dose-risposta lineare per gli anticorpi bispecifici attraverso la determinazione dell'SPR, che consente l'analisi della concentrazione e il controllo di qualità⁵. Inoltre, l'SPR può essere utilizzato per condurre test di immunogenicità clinica in farmacopea e nello sviluppo di vaccini⁶.

Un'area in cui può essere utilizzato è il rilevamento di residui di pesticidi, residui di farmaci veterinari, additivi illegali, batteri patogeni e metalli pesanti 7,8,9,10 nei prodotti agricoli e nei test di sicurezza alimentare. Utilizzando la tecnologia SPR, l'accuratezza e l'efficienza di questi test possono essere migliorate.

Un'altra area in cui la tecnologia SPR può essere applicata è il rilevamento rapido di tossine e antibiotici. Questa tecnologia consente l'attacco di anticorpi virali, composti di piccole molecole e aptameri al chip del biosensore SPR. Il chip biosensore SPR rileva quindi diverse concentrazioni di RNA virale come analita¹¹. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel rilevamento rapido di virus come il virus dell'influenza aviaria H5N1, H7N9 e il nuovo coronavirus 12,13,14. Oltre a queste applicazioni, la tecnologia SPR è utile anche nella proteomica, nello screening dei farmaci, nel rilevamento in tempo reale della farmacocinetica correlata e nello studio di virus e proteine e recettori patogeni 15,16,17,18. È particolarmente adatto per la ricerca scientifica e gli esperimenti didattici in università e istituti di ricerca ed è uno strumento prezioso in diversi contesti scientifici e di ricerca.

Il principio di SPR è il movimento oscillatorio collettivo di elettroni liberi all'interfaccia tra un film metallico e un dielettrico, causato da onde luminose incidenti¹⁹. È essenzialmente la risonanza tra l'onda evanescente e l'onda di plasma sulla superficie metallica²⁰. Quando la luce passa da un mezzo fotodenso a un mezzo fotofobico, in determinate condizioni si verifica una riflessione totale. Dal punto di vista dell'ottica ondulatoria, quando la luce incidente raggiunge l'interfaccia, non genera immediatamente la luce riflessa. Invece, passa prima attraverso il mezzo otticamente fobico a una profondità di circa una lunghezza d'onda. Quindi scorre lungo l'interfaccia per circa mezza lunghezza d'onda prima di tornare al mezzo otticamente denso. Questa onda che passa attraverso il mezzo otticamente fobico è indicata come onda evasiva, purché l'energia totale della luce rimanga costante. Poiché il metallo contiene gas di elettroni liberi, può essere considerato come plasma. La luce incidente eccita la vibrazione longitudinale del gas di elettroni, portando alla generazione di un'onda di densità di carica lungo l'interfaccia metallo-dielettrico, nota come onda di plasma superficiale. Questa risonanza si propaga sotto forma di attenuazione esponenziale in entrambi i mezzi. Di conseguenza, l'energia della luce riflessa è notevolmente ridotta. L'angolo di incidenza corrispondente al quale la luce riflessa scompare completamente è noto come angolo di risonanza²¹. L'SPR è altamente sensibile all'indice di rifrazione del mezzo che aderisce alla superficie del film metallico²⁰. L'angolo SPR varia con l'indice di rifrazione della superficie del film metallico, con la variazione dell'indice di rifrazione che è principalmente proporzionale alla massa molecolare della superficie del film metallico²². Qualsiasi cambiamento nelle proprietà del mezzo superficiale o nella quantità di adesione si tradurrà in angoli di risonanza diversi. Pertanto, l'interazione molecolare può essere analizzata esaminando i cambiamenti nell'angolo di risonanza.

Questa analisi SPR ottica non distruttiva, senza marcatura e in tempo reale, basata sui principi di cui sopra, è adatta per la ricerca in vari campi. Pertanto, abbiamo dimostrato lo spostamento angolare della curva SPR e i risultati sperimentali mediante analisi multi-ciclo, prendendo come esempio la combinazione di quercetina e calicosina con la proteina ricombinante KCNJ2.

Protocollo

NOTA: La curva di rilevamento sperimentale completa indica che il processo sperimentale può essere classificato in otto fasi distinte.

1. Preparazione del campione e del tampone

1. Preparare i chip del sensore prima dell'esperimento.
   1. Trattare le patatine con la soluzione piranha (30% H₂O₂: H₂SO₄=1:3; v/v) per 2 min. Successivamente, pulire accuratamente il chip con una grande quantità di acqua deionizzata e poi immergerlo in etanolo anidro, lasciandolo asciugare naturalmente.
   2. Successivamente, immergere il chip per una notte in una soluzione di 11-mercapto-l-undecanol (MUOH) con una concentrazione di 50 M. Successivamente, immergere il chip in una soluzione di epicloridrina e lasciarlo reagire a 25 °C per 4 ore.
   3. Rimuovere il chip dalla soluzione e lavarlo accuratamente con acqua distillata ed etanolo anidro. Infine, far cadere la soluzione basica di destrano sulla superficie della pellicola d'oro del chip e lasciarla reagire a 25°C per 20 ore. Pulisci il chip con acqua deionizzata e poi immergilo in una soluzione di acido bromoacetico per ottenere la modifica della destrostan idrossicarbossimetilazione. Usa la quercetina e la calicosina con purezza rispettivamente ≥98,5% e ≥99%.
2. Preparare tutti i tamponi contenenti tampone di corsa, attivatore, tampone di immobilizzazione (10 mM di acetato di sodio) e soluzione di rigenerazione 10 mM di glicina-HCl, pH 1,5. L'attivatore contiene 115 mg di N-idrossisuccinimide (NHS), 750 mg di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) e 10,5 mL di 1 M etanolammina cloridrato-NaOH a pH 8,5. Sciogliere l'EDC e l'NHS aggiungendo 10 ml di acqua deionizzata filtrata a ciascuna fiala (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Conservare le aliquote EDC e NHS a una temperatura pari o inferiore a -18 °C, utilizzare le aliquote entro 2 mesi. Tutte le soluzioni devono essere degasate prima dell'uso.

2. Taratura dello strumento

1. Disegna una curva standard della concentrazione di alcol e del valore di picco iniettando alcol a diverse concentrazioni (2%, 1%, 0,5%, 0,2% e 0,1% in volume) su oro nudo e confrontando il valore di picco massimo dell'alcol.
   NOTA: Iniettando a una velocità di flusso di 50 μL/min, il software di analisi dei dati di origine ha ottenuto una curva standard.
2. Secondo il manuale tecnico, calcolare il fattore di correzione dello strumento, rappresentato da K, utilizzando la formula:
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   In questa formula, A e B rappresentano i valori del segnale dei rispettivi rivelatori. Il valore teorico della pendenza, come indicato nel manuale, è 0,06. Pertanto, il fattore di correzione, K, può essere calcolato come K=0,06/R, (dove R è la pendenza dell'equazione di regressione lineare ottenuta dalla curva standard).
3. Moltiplicare il valore Δ[(A-B)/(A+B)] misurato per il fattore di correzione per ottenere il valore Δθ effettivo.

3. Funzionamento di base del sistema

1. Per avviare il sistema, accendere l'interruttore di alimentazione e attendere che l'unità di rilevamento raggiunga la temperatura preimpostata (solitamente 25 °C).
2. Aprire il software di controllo facendo clic su Avvia programma > > Software di controllo OpenSPRTM e il programma software si collegherà automaticamente al sistema host dopo l'esecuzione.
3. Seguire la procedura operativa standard dello strumento SPR per installare il chip COOH (chip a base di glucano). Per prima cosa, metti una goccia di olio di cedro sul retro del biochip SPR. Quindi, collegare il chip COOH alla superficie del prisma del sensore, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria tra il chip e il prisma. Infine, installare la piscina di flusso e serrarla al punto luce.
   NOTA: Posizionare la piscina di flusso nell'apposita fessura e fissarla saldamente utilizzando le viti di fissaggio. Le dimensioni del canale sono 10 mm x 1 mm x 1 mm.
4. Posizionamento del chip
   1. Per aprire il portello del chip, selezionare l'opzione Inserisci chip dal menu Strumenti . Se è già presente un chip nell'alloggiamento dei chip, fare clic sull'opzione Espelli chip dal menu Strumenti .
   2. Selezionare il tipo di chip corrispondente dal menu a discesa del tipo di chip se si utilizza un nuovo chip e inserire l'ID del chip con le informazioni sperimentali relative al chip. Il numero di lotto del chip può essere inserito (opzionale). Se si tratta di un chip usato, seleziona Riutilizza chip e trova le informazioni sul chip corrispondenti nel menu a discesa ID chip.
   3. Tieni il chip con il lato della parola rivolto verso l'alto, spingi delicatamente il chip nello slot della scheda seguendo la direzione della freccia sul chip e infine chiudi lo sportello dello scomparto del chip.
   4. Fare clic sul pulsante Dock Chip . Il sistema passerà automaticamente allo stato di standby dopo che il chip è stato posizionato.
   5. Per lavare l'intero sistema di flusso interno a una portata elevata, selezionare il comando Strumenti > Prime > Avvia. L'intero processo dura 6-7 minuti. Fare clic su Chiudi per passare automaticamente il sistema allo stato di standby.
5. Tenere premuto il pulsante nero sul lato destro del supporto del tubo e aprire il coperchio metallico a sinistra. Dopo aver posizionato l'apposita provetta, chiudere delicatamente il coperchio metallico. Se si sente un clic, il coperchio metallico è bloccato.
6. Spingere delicatamente il supporto della provetta lungo la fessura della scheda nello scomparto del campione e sentire un clic, che indica che il supporto della provetta è nella posizione corretta e bloccato.
7. Fare clic su OK nella finestra di dialogo Espulsione vassoio rack per inserire automaticamente il rack nello scomparto campioni e chiudere lo sportello.
   NOTA: C'è un limite di tempo quando la porta della cabina del campione viene aperta. La porta si chiuderà automaticamente dopo 60 s dall'apertura. Negli ultimi 15 s, il conto alla rovescia nella finestra di dialogo appare in rosso e lampeggia. Attendere che la porta si chiuda prima di riaprirla per evitare di pizzicarsi la mano.
8. Normalizzazione dei segnali di risposta
   1. Selezionare Strumento > Altri strumenti, selezionare Normalizza nella directory Strumenti di manutenzione e fare clic su Avvia > successivo.
   2. Aggiungere 120 μl di soluzione BIAnormalizzante al 70% a una provetta da 7 mm. Posizionare la provetta nella posizione specificata mostrata nel programma (R2F6). Dopo aver verificato che il coperchio del portaprovette sia chiuso correttamente, posizionare il portaprovette nel vano campioni e chiudere la porta della cabina, quindi fare clic su Avvia per eseguire il programma.

4. Cattura del ligando

1. Misura di pH
   1. Prima di fissare i ligandi sul chip, eseguire lo screening di un tampone ligando adatto al pH per arricchire i ligandi vicino alla superficie del chip attraverso l'adsorbimento elettrostatico per ottenere un migliore effetto di accoppiamento. La concentrazione generale del ligando è di 10-100 μg/mL e, per il primo esperimento, provare a utilizzare 20 μg/mL.
   2. Screening del ligando da 10 mM di acetato di sodio con valori di pH di 5,5, 5,0, 4,5 e 4. Per impostare i parametri di processo, selezionare Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization pH Scouting e fare clic su Nuovo.
   3. Selezionare il canale del chip, che può essere scelto tra i canali 1, 2, 3 o 4. Il tampone ha quattro condizioni preimpostate: 10 mM di acetato di sodio, pH 5,5, 5,0, 4,5 e 4. Quindi, inserire il nome del ligando, il tempo di contatto (180 s) e la velocità di flusso (5 μL/min).
   4. Dopo che la superficie è stata rigenerata con 50 mM di NaOH, impostare la temperatura della superficie del chip e la temperatura della camera del campione. Quindi, selezionare il rack per campioni e reagenti1 a sinistra e posizionare la soluzione in base alla posizione corrispondente nel rack per campioni. Salvare il metodo sperimentale e avviare l'esperimento facendo clic su Avanti.
2. Immobilizzazione del ligando
   1. Selezionare Esegui guidata, Preparazione superficiale-Immobilizzazione e fare clic su Nuovo. Impostare la capacità di mobilizzazione su quattro canali: FC1, FC2, FC3 e FC4. In genere, il canale 1 viene utilizzato come riferimento per l'associazione dei canali 1 e 2 e il canale 3 è il riferimento per la mobilizzazione di tutti e quattro i canali.
   2. Utilizzare i canali di riferimento per il contrasto in bianco o la fissazione senza ligando chiuso per attivazione, utilizzando i canali 1 e 2 per accoppiare i ligandi sul canale 2.
      NOTA: Sono disponibili due modalità di accoppiamento: puntare al livello immobilizzato e specificare il tempo di contatto. Nella modalità di mira al livello immobilizzato, inserire il livello di accoppiamento target e il software raggiungerà automaticamente il livello corrispondente. La modalità del tempo di contatto richiede l'inserimento del tempo di iniezione e della portata e viene generalmente utilizzata sulla base di pre-esperimenti.

5. Metodo dell'analita multiciclo

1. Eseguire Prime e riempire la siringa e la camera con un tampone fisso. Selezionare Esegui-Esecuzione manuale , selezionare Canali 1-2 in serie nel percorso del flusso e fare clic su Avvia.
2. Iniziare l'esecuzione alla velocità di flusso massima (150 μL/min) e rilevare il tampone che è HEPES (pH 7,4). Quando viene raggiunta una linea di base stabile, lavare l'anello del campione con il tampone e svuotare l'anello del campione.
   NOTA: Se la linea di base (una linea di equilibrio formata sulla curva di rilevamento quando viene eseguito il tampone) non viene raggiunta entro 10 minuti, provare a iniettare 10 mM di idrossido di sodio per 30 s.
3. Attivare il chip con la soluzione EDC/NHS (1:1, 50 μL ciascuno).
4. Eseguire 200 μl di ligando diluito con il tampone attivato sul campione per 4 minuti. Una volta stabilizzato il legame, lavare l'anello del campione con il tampone.
5. Campionare 200 μl di soluzione bloccante, sciacquare l'anello del campione con il tampone e svuotarlo con aria. Osservare la linea di base per 5 minuti per garantire la stabilità.
6. Diluire gli analiti con una soluzione tampone, quindi prelevare 3,9 μM, 7,8 μM, 15,625 μM e 31,25 μM di quercetina e 15,625 μM, 31,25 μM, 62,5 μM, 125 μM e 250 μM di calicosina, come campioni a 20 μL/min.
7. Il tempo di legame della proteina (10 μg/mL-50 μg/mL) e del ligando è di 240 s, con un tempo di dissociazione naturale di 360 s. Aumentare la portata a 150 μl/min e iniettare il tampone di rigenerazione appropriato per rimuovere l'analita.

6. Rigenerazione

1. Per la rigenerazione, utilizzare 10 mM di glicina-HCl, soluzioni ad alto contenuto di sale o acido-base con livelli di pH variabili (ad es. 2,5, 4,5, 5,0, 5,5, ecc.).
2. Per esaminare le condizioni di rigenerazione, utilizzare run-wizard-assay development-regeneration scouting e fare clic su Nuovo. Selezionare 1-2 canali in serie sul percorso del flusso, selezionare il chip e fare clic su Avanti.
3. Per riscaldare il chip, fai clic su Avvio, che dovrebbe essere fatto più di 3 volte. Inserire il nome dell'analita e impostare la portata della soluzione rigenerata a 150 μL/min.

7. Analisi dei dati

1. Analizzare i risultati sperimentali utilizzando un software di analisi dei dati SPR, utilizzando il modello di analisi One to One.
   NOTA: l'intero processo viene eseguito nel buffer in esecuzione. Gli altri tamponi utilizzati nel processo di analisi SPR sono gli stessi del tampone di iniezione.

8. Manutenzione del sistema

1. Dopo aver completato l'esperimento, rimuovere il chip di rilevamento e sostituirlo con il chip di manutenzione. Sostituire il tampone di scorrimento con acqua fresca e pura a sufficienza e lavare il sistema con adescamento. Una volta innescato, il sistema passerà automaticamente alla modalità standby per pulire il flacone del liquido di scarto e cambiare l'acqua dell'ago.

Risultati

Per determinare se la proteina è fissata sulla superficie del chip, viene utilizzata l'ordinata (segnale di risposta) della mappa del sensore SPR (Figura 1), mentre si ottiene lo spostamento angolare della curva SPR. La Figura 2 e la Figura 3 illustrano la curva SPR dell'interazione tra quercetina e calicosina con la proteina ricombinante KCNJ2 sulla superficie immobilizzata della proteina ricombin...

Discussione

Il ciclo di analisi SPR è suddiviso in quattro fasi. La prima fase, la linea di base, prevede l'iniezione del tampone. Segue la seconda fase, la cattura del ligando. Il chip del sensore COOH viene attivato con EDC/NHS (1:1) a una portata di 20 μL/min. Il chip viene quindi disattivato utilizzando 1 M di etanolammina cloridrato-NaOH a una velocità di flusso di 20 μL/min. Passando alla terza fase, il metodo dell'analita multiciclo. L'analita viene iniettato nel canale a una velocità di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873