Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) Teknolojisi Kullanılarak Biyomoleküller Arasındaki Dinamik Afinitenin Gerçek Zamanlı Tespiti

Özet

Bu çalışma, birden fazla alanda çok yönlü uygulamalar bulan yüzey plazmon rezonansı (SPR) teknolojisinin ilkesini ve metodolojisini aydınlatmayı amaçlamaktadır. Bu makale, okuyucular arasında bu teknolojinin daha geniş bir şekilde bilinmesini ve benimsenmesini teşvik etmek amacıyla SPR teknolojisini, operasyonel basitliğini ve olağanüstü etkinliğini açıklamaktadır.

Özet

Yüzey plazmon rezonansı (SPR) teknolojisi, diğer biyomoleküler tespitlerin yanı sıra virüsleri, patojenik moleküler proteinleri ve reseptörleri tespit etmek, kan gruplarını belirlemek ve gıda tağşişini tespit etmek için hassas bir hassas yöntemdir. Bu teknoloji, biyomoleküller arasındaki potansiyel bağlanmanın hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyarak, etiketlemeye gerek kalmadan çeşitli göstergelerin hızlı ve kullanıcı dostu, invaziv olmayan taramasını kolaylaştırır. Ek olarak, SPR teknolojisi, yüksek verimli ilaç taraması için gerçek zamanlı algılamayı kolaylaştırır. Bu programda SPR teknolojisinin uygulama alanı ve temel prensipleri kısaca tanıtılmaktadır. İşlem süreci, cihaz kalibrasyonu ve temel sistem çalışması ile başlayarak, ardından ligand yakalama ve analitin çok döngülü analizi ile ayrıntılı olarak özetlenmiştir. Kuersetin ve kalikosinin KCNJ2 proteinine bağlanmasının gerçek zamanlı eğrisi ve deneysel sonuçları detaylandırıldı. Genel olarak, SPR teknolojisi, ilaç taraması, ilgili farmakokinetiğin gerçek zamanlı tespiti, virüs tespiti ve çevre ve gıda güvenliği tanımlaması için son derece spesifik, basit, hassas ve hızlı bir yöntem sağlar.

Giriş

Yüzey plazmon rezonansı (SPR) teknolojisi, analiti etiketleme ihtiyacını ortadan kaldıran optik bir algılama tekniğidir. Kantitatif bağlanma afinitesi, kinetik ve termodinamiğin gerçek zamanlı ve dinamik olarak izlenmesini sağlar. Bu yüksek aktarım hızı kapasitesi son derece hassas ve tekrarlanabilir olup, çeşitli açık hızların, kapalı oranların ve benzeşimin ölçülmesine olanak tanır. Ek olarak, gereken küçük numune miktarı, bu yöntemin^faydasını daha da artırır ^1,2. Biyomoleküller arasındaki afinite bağlanmasını izleyen hızlı yanıtlı biyomoleküler tespit yöntemi³, öne çıkan bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır.

SPR teknolojisi, ilaç araştırma ve geliştirme alanında çeşitli uygulamalara sahiptir⁴. Kullanımlarından biri, belirli ilaç hedeflerinin yapısal temelini keşfetmektir. Ayrıca, önemli farmakolojik aktivitelere sahip Çin bitkilerinin aktif bileşenlerini tanımlamak ve ilaç taraması ve doğrulama mekanizmalarını incelemek için de kullanılabilir. Gassner ve ark. SPR tayini yoluyla bispesifik antikorlar için doğrusal bir doz-yanıt eğrisi oluşturmuşlardır, bu da konsantrasyon analizi ve kalite kontrolüne izin verir⁵. Ek olarak, SPR, farmakope ve aşı geliştirmede klinik immünojenisite testleri yapmak için kullanılabilir⁶.

Kullanılabileceği alanlardan biri de tarım ürünlerinde pestisit kalıntıları, veteriner ilaç kalıntısı, yasa dışı katkı maddeleri, patojenik bakteriler ve ağır metallerin ^7,8,9,10 tespiti ve gıda güvenliği testleridir. SPR teknolojisi kullanılarak, bu testlerin doğruluğu ve verimliliği artırılabilir.

SPR teknolojisinin uygulanabileceği bir diğer alan ise toksinlerin ve antibiyotiklerin hızlı bir şekilde tespit edilmesidir. Bu teknoloji, viral antikorların, küçük moleküllü bileşiklerin ve aptamerlerin SPR biyosensör çipine bağlanmasına izin verir. SPR biyosensör çipi daha sonra analit¹¹ olarak farklı viral RNA konsantrasyonlarını tespit eder. Bu yöntem H5N1, H7N9 kuş gribi virüsü ve yeni tip koronavirüs 12,13,14 gibi virüslerin hızlı tespitinde başarıyla kullanılmıştır. Bu uygulamalara ek olarak, SPR teknolojisi proteomik, ilaç taraması, ilgili farmakokinetiğin gerçek zamanlı tespiti ve virüs ve patojenik proteinlerin ve reseptörlerin incelenmesinde de yararlıdır 15,16,17,18. Özellikle üniversitelerde ve araştırma enstitülerinde bilimsel araştırma ve öğretim deneyleri için uygundur ve çeşitli bilimsel ve araştırma ortamlarında değerli bir araçtır.

SPR'nin prensibi, gelen ışık dalgalarının¹⁹ neden olduğu, bir metal film ile dielektrik arasındaki arayüzde serbest elektronların toplu salınım hareketidir. Esasen metal yüzeydeki buharlaşan dalga ile plazma dalgası arasındaki rezonanstır²⁰. Işık fotoyoğun bir ortamdan fotofobik bir ortama geçtiğinde, belirli koşullar altında toplam yansıma meydana gelir. Dalga optiği açısından bakıldığında, gelen ışık arayüze ulaştığında hemen yansıyan ışık üretmez. Bunun yerine, önce yaklaşık bir dalga boyu derinliğinde optik fobik ortamdan geçer. Daha sonra, optik olarak yoğun ortama geri dönmeden önce arayüz boyunca yaklaşık yarım dalga boyu boyunca akar. Optik fobik ortamdan geçen bu dalga, ışığın toplam enerjisi sabit kaldığı sürece kaçış dalgası olarak adlandırılır. Metal serbest elektron gazı içerdiğinden plazma olarak kabul edilebilir. Gelen ışık, elektron gazının uzunlamasına titreşimini uyararak, yüzey plazma dalgası olarak bilinen metal-dielektrik arayüz boyunca bir yük yoğunluğu dalgasının oluşmasına yol açar. Bu rezonans, her iki ortamda da üstel zayıflama şeklinde yayılır. Sonuç olarak, yansıyan ışığın enerjisi önemli ölçüde azalır. Yansıyan ışığın tamamen kaybolduğu karşılık gelen geliş açısı, rezonans açısı²¹ olarak bilinir. SPR, metal film yüzeyine²⁰ yapışan ortamın kırılma indisine karşı oldukça hassastır. SPR açısı, metal film yüzeyinin kırılma indisine göre değişir, kırılma indisi değişimi esas olarak metal film yüzeyinin²² moleküler kütlesi ile orantılıdır. Yüzey ortamının özelliklerinde veya yapışma miktarında herhangi bir değişiklik, farklı rezonans açılarına neden olacaktır. Böylece rezonans açısındaki değişiklikler incelenerek moleküler etkileşim analiz edilebilir.

Yukarıdaki ilkelere dayanan bu tahribatsız, etiketsiz, gerçek zamanlı optik SPR analizi, çeşitli alanlardaki araştırmalar için uygundur. Bu nedenle, örnek olarak kuersetin ve kalikozin ile KCNJ2 rekombinant proteini kombinasyonunu alarak, SPR eğrisinin açısal yer değiştirmesini ve deneysel sonuçları çok döngülü analizle gösterdik.

Protokol

NOT: Tam deneysel algılama eğrisi, deneysel sürecin sekiz farklı aşamaya ayrılabileceğini gösterir.

1. Numune ve tampon hazırlama

1. Deneyden önce sensör çiplerini hazırlayın.
   1. Cipslere piranha solüsyonu (%30 H_2O2: H₂S₄ = 1: 3; h / h) ile 2 dakika muamele edin. Daha sonra, çipi bol miktarda deiyonize su ile iyice temizleyin ve ardından susuz etanole batırın ve doğal olarak kurumasını bekleyin.
   2. Daha sonra, çipi gece boyunca 50 M'lik bir konsantrasyonda 11-merkapto-l-undekanol (MUOH) çözeltisine batırın. Daha sonra, çipi bir epiklorohidrin çözeltisine yerleştirin ve 4 saat boyunca 25 ° C'de reaksiyona girmesine izin verin.
   3. Çipi çözeltiden çıkarın ve damıtılmış su ve susuz etanol ile iyice yıkayın. Son olarak, dekstran bazik çözeltisini çipin altın film yüzeyine bırakın ve 20 saat boyunca 25 ° C'de reaksiyona girmesine izin verin. Çipi deiyonize su ile temizleyin ve ardından dekstran hidroksil karboksimetilasyon modifikasyonunu elde etmek için bir bromoasetik asit çözeltisine daldırın. Quercetin ve calycosin sırasıyla ≥98.5% ve% ≥99 saflıkta kullanın.
2. Çalışan tampon, aktivatör, immobilizasyon tamponu (10 mM sodyum asetat) ve rejenerasyon çözeltisi 10 mM Glisin-HCl, pH 1.5 içeren tüm tamponları hazırlayın. Aktivatör, pH 8.5'te 115 mg N-Hidroksisüksinamid (NHS), 750 mg 1-Etil-3- (3-dimetil aminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) ve 10.5 mL 1 M etanolamin hidroklorür-NaOH içerir. Her şişeye 10 mL filtrelenmiş deiyonize su ekleyerek EDC ve NHS'yi çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: EDC ve NHS alikotlarını -18 °C veya altında saklayın, alikotları 2 ay içinde kullanın. Tüm çözeltiler kullanılmadan önce gazdan arındırılmalıdır.

2. Cihaz kalibrasyonu

1. Çıplak altın üzerine farklı konsantrasyonlarda (%2, %1, %0,5, %0,2 ve %0,1 hacim oranı) alkol enjekte ederek ve alkolün maksimum tepe değerini karşılaştırarak standart bir alkol konsantrasyonu ve tepe değeri eğrisi çizin.
   NOT: 50 μL/dk akış hızında enjeksiyon, orijin veri analiz yazılımı ile standart bir eğri elde edildi.
2. Teknik kılavuza göre, aşağıdaki formülü kullanarak K ile temsil edilen cihazın düzeltme faktörünü hesaplayın:
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   Bu formülde A ve B, ilgili dedektörlerin sinyal değerlerini temsil eder. Kılavuzda belirtildiği gibi teorik eğim değeri 0,06'dır. Bu nedenle, düzeltme faktörü K, K=0.06/R olarak hesaplanabilir (burada R, standart eğriden elde edilen doğrusal regresyon denkleminin eğimidir).
3. Gerçek Δθ değerini elde etmek için ölçülen Δ[(A-B)/(A+B)] değerini düzeltme faktörü ile çarpın.

3. Temel sistem çalışması

1. Sistemi başlatmak için güç anahtarını açın ve algılama birimi önceden ayarlanmış sıcaklığa (genellikle 25 °C) ulaşana kadar bekleyin.
2. OpenSPRTM Kontrol Yazılımı > Başlat > Programına tıklayarak Kontrol Yazılımını açın, yazılım programı çalıştıktan sonra otomatik olarak ana bilgisayar sistemine bağlanacaktır.
3. COOH çipini (glukan bazlı çip) takmak için SPR cihazının standart çalıştırma prosedürünü izleyin. İlk olarak, SPR biyoçipinin arkasına bir damla sedir yağı koyun. Ardından, COOH çipini sensörün prizma yüzeyine takın ve çip ile prizma arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Son olarak, akış havuzunu kurun ve ışık noktasına kadar sıkın.
   NOT: Akış havuzunu belirlenen yuvaya yerleştirin ve sabitleme vidalarını kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Kanal boyutları 10 mm x 1 mm x 1 mm'dir.
4. Çip yerleştirme
   1. Çip kapağını açmak için, Araçlar menüsünden Çip Ekle seçeneğini seçin. Çip bölmesinde zaten bir çip varsa, Araçlar menüsünde Çipi Çıkar seçeneğine tıklayın.
   2. Yeni bir çip kullanıyorsanız, çip tipi açılır menüsünden ilgili Çip Tipini seçin ve çip ID'sini çip ile ilgili deneysel bilgilerle doldurun. Çip lot numarası doldurulabilir (isteğe bağlı). Kullanılmış bir çip ise, Çipi Yeniden Kullan'ı seçin ve çip kimliği açılır menüsünde ilgili çip bilgilerini bulun.
   3. Çipi, kelime tarafı yukarı bakacak şekilde tutun, çip üzerindeki ok yönünü takip ederek çipi yavaşça kart yuvasına itin ve son olarak çip bölmesinin kapağını kapatın.
   4. Dock Chip düğmesine tıklayın. Çip yerleştirildikten sonra sistem otomatik olarak bekleme durumuna geçecektir.
   5. Tüm dahili akış sistemini yüksek bir akış hızında yıkamak için Araçlar > Prime komutu > Başlat'ı seçin. Tüm işlem 6-7 dakika sürer. Sistemi otomatik olarak bekleme durumuna geçirmek için Kapat'ı tıklatın.
5. Tüp tutucunun sağ tarafındaki Siyah Düğmeyi basılı tutun ve soldaki metal kapağı açın. Uygun test tüpünü yerleştirdikten sonra metal kapağı yavaşça kapatın. Bir tıklama sesi duyarsanız, metal kapak kilitlenmiştir.
6. Test tüpü tutucusunu kart yuvası boyunca yavaşça s'ye itin.ampbölme ve test tüpü tutucusunun doğru konumda ve kilitli olduğunu gösteren bir tıklama sesi duyun.
7. Rafı otomatik olarak numune bölmesine beslemek ve kapağı kapatmak için Raf Tepsisini Çıkar iletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın.
   NOT: Numune kabin kapısının açılması için bir zaman sınırı vardır. Kapı açıldıktan 60 saniye sonra otomatik olarak kapanacaktır. Son 15 saniye içinde, iletişim kutusundaki geri sayım kırmızı yazı tipinde görünür ve yanıp söner. Elinizi sıkıştırmamak için yeniden açmadan önce kapının kapanmasını bekleyin.
8. Yanıt sinyallerinin normalleştirilmesi
   1. Araç > Diğer Araçlar'ı seçin, Bakım Araçları dizininde Normalleştir'i seçin ve Başlat > İleri'ye tıklayın.
   2. 7 mm'lik bir test tüpüne 120 μL %70 BIAnormalleştirme solüsyonu ekleyin. Test tüpünü programda (R2F6) gösterilen belirtilen konuma yerleştirin. Tüp tutucu kapağının düzgün bir şekilde kapatıldığını onayladıktan sonra, tüp tutucuyu s'ye yerleştirinampbölmeye yerleştirin ve kabin kapısını kapatın ve programı çalıştırmak için Başlat'a tıklayın.

4. Ligand yakalama

1. pH ölçümü
   1. Ligandları çip üzerine sabitlemeden önce, daha iyi bir birleştirme etkisi elde etmek için elektrostatik adsorpsiyon yoluyla çipin yüzeyine yakın ligandları zenginleştirmek için uygun bir ligand tampon pH'ını tarayın. Genel ligand konsantrasyonu 10-100 μg/mL'dir ve ilk deney için 20 μg/mL kullanmayı deneyin.
   2. Ligandı 5.5, 5.0, 4.5 ve 4 pH değerlerine sahip 10 mM sodyum asetattan tarayın. Proses parametrelerini ayarlamak için Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization pH Scouting'i seçin ve Yeni'ye tıklayın.
   3. 1, 2, 3 veya 4 numaralı kanallardan seçilebilen çip kanalını seçin. Tamponun önceden ayarlanmış dört koşulu vardır: 10 mM sodyum asetat, pH 5.5, 5.0, 4.5 ve 4. Ardından, ligand adını, temas süresini (180 s) ve akış hızını (5 μL/dak) girin.
   4. Yüzey 50 mM NaOH ile yenilendikten sonra, talaş yüzey sıcaklığını ve numune odasının sıcaklığını ayarlayın. Ardından, soldaki numune ve reaktif rafını1 seçin ve çözeltiyi numune rafındaki ilgili konuma göre yerleştirin. Deneysel yöntemi kaydedin ve İleri'ye tıklayarak deneyi başlatın.
2. Ligand immobilizasyonu
   1. Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization (Yüzey Hazırlama-İmmobilizasyon) seçeneklerini seçin ve New'e tıklayın. Mobilizasyon yeteneğini dört kanala ayarlayın: FC1, FC2, FC3 ve FC4. Genel olarak, kanal 1 ve 2 eşleştirilirken kanal 1 referans olarak kullanılır ve kanal 3, dört kanalın tümü mobilize edilirken referans olarak kullanılır.
   2. Kanal 2'deki ligandları birleştirmek için kanal 1 ve 2'yi kullanarak boş kontrast veya aktivasyonla kapalı ligandsız sabitleme için referans kanallarını kullanın.
      NOT: Kullanılabilir iki bağlantı modu vardır: hareketsiz seviyeyi hedefleyin ve temas süresini belirtin. Hareketsiz seviye modu hedefinde, hedef bağlantı seviyesini girin ve yazılım otomatik olarak ilgili seviyeye ulaşacaktır. Temas süresi modu, enjeksiyon süresi ve akış hızının girilmesini gerektirir ve genellikle ön deneylere dayalı olarak kullanılır.

5. Çok döngülü analit yöntemi

1. Prime'ı çalıştırın ve şırıngayı ve hazneyi sabit bir tamponla doldurun. Çalıştır-El ile çalıştırma'yı seçin, akış yolunda Kanallar 1-2'yi seri olarak seçin ve Başlat'a tıklayın.
2. Maksimum akış hızında (150 μL/dk) çalışmaya başlayın ve HEPES (pH 7.4) olan tamponu tespit edin. Kararlı bir taban çizgisine ulaşıldığında, numune halkasını tamponla yıkayın ve numune halkasını boşaltın.
   NOT: Taban çizgisine (tampon çalıştırıldığında algılama eğrisi üzerinde oluşan bir denge çizgisi) 10 dakika içinde ulaşılmazsa, 30 saniye boyunca 10 mM sodyum hidroksit enjekte etmeyi deneyin.
3. Çipi EDC/NHS (1:1, her biri 50 μL) solüsyonu ile etkinleştirin.
4. Numune üzerinde aktif tampon ile seyreltilmiş 200 μL ligandı 4 dakika boyunca çalıştırın. Bağlanma stabilize olduktan sonra, numune halkasını tampon ile yıkayın.
5. 200 μL bloke edici çözelti örnekleyin, örnek halkasını tampon ile durulayın ve hava ile boşaltın. Stabiliteyi sağlamak için taban çizgisini 5 dakika boyunca gözlemleyin.
6. Analitleri tampon çözeltisi ile seyreltin, daha sonra 3.9 μM, 7.8 μM, 15.625 μM ve 31.25 μM kuersetin ve 15.625 μM, 31.25 μM, 62.5 μM, 125 μM ve 250 μM kalisin, 20 μL / dk'da numune olarak.
7. Protein (10 μg/mL-50 μg/mL) ve ligandın bağlanma süresi 240 s, doğal ayrışma süresi ise 360 s'dir. Akış hızını 150 μL/dk'ya yükseltin ve analiti çıkarmak için uygun rejenerasyon tamponu enjekte edin.

6. Yenilenme

1. Rejenerasyon için 10 mM Glisin-HCl, yüksek tuz veya değişen pH seviyelerine sahip asit-baz çözeltileri kullanın (örn., 2.5, 4.5, 5.0, 5.5, vb.).
2. Rejenerasyon koşullarını taramak için run-wizard-assay development-regeneration scouting'i kullanın ve Yeni'ye tıklayın. Akış yolunda seri olarak 1-2 kanal seçin, çipi seçin ve İleri'ye tıklayın.
3. Çipi ısıtmak için, 3 kattan fazla yapılması gereken Başlangıç'a tıklayın. Analitin adını girin ve rejenere çözeltinin akış hızını 150 μL/dk olarak ayarlayın.

7. Veri analizi

1. Bire Bir analiz modelini kullanarak bir SPR veri analiz yazılımı kullanarak deneysel sonuçları analiz edin.
   NOT: Tüm işlem çalışan arabellekte gerçekleştirilir. SPR tahlil işleminde kullanılan diğer tamponlar, enjeksiyon tamponu ile aynıdır.

8. Sistem bakımı

1. Deneyi tamamladıktan sonra, algılama çipini çıkarın ve bakım çipi ile değiştirin. Çalışan tamponu yeterince taze saf su ile değiştirin ve sistemi prime ile yıkayın. Hazırlandıktan sonra, atık sıvı şişesini temizlemek ve iğne suyunu değiştirmek için sistem otomatik olarak bekleme moduna geçecektir.

Sonuçlar

Proteinin çip yüzeyine sabitlenip sabitlenmediğini belirlemek için, SPR sensör haritasının (Şekil 1) ordinatı (yanıt sinyali) kullanılırken, SPR eğrisinin açısal yer değiştirmesi elde edilir. Şekil 2 ve Şekil 3 , 3.9 μM ila 250 μM arasında değişen konsantrasyonlarda kontrol indirgemesinden sonra KCNJ2 rekombinant proteinin hareketsizleştirilmiş yüzeyinde KCNJ2 rekombinant ...

Tartışmalar

SPR analiz döngüsü dört aşamaya ayrılmıştır. İlk aşama olan taban çizgisi, tamponun enjeksiyonunu içerir. Bunu takiben ikinci aşama olan ligand yakalamadır. COOH sensör çipi, 20 μL/dk akış hızında EDC/NHS (1:1) ile etkinleştirilir. Çip daha sonra 20 μL/dk'lık bir akış hızında 1 M etanolamin hidroklorür-NaOH kullanılarak devre dışı bırakılır. Üçüncü aşama olan çok çevrimli analit yöntemine geçiliyor. Analit, 240 s'lik bir birleşme fazı içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873