Détection en temps réel de l’affinité dynamique entre les biomolécules à l’aide de la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR)

Résumé

La présente étude vise à élucider le principe et la méthodologie de la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR), qui trouve des applications polyvalentes dans de multiples domaines. Cet article décrit la technologie SPR, sa simplicité d’utilisation et son efficacité remarquable, dans le but de favoriser une sensibilisation et une adoption plus larges de cette technologie par les lecteurs.

Résumé

La technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sensible et précise pour détecter les virus, les protéines moléculaires pathogènes et les récepteurs, déterminer les groupes sanguins et détecter l’adultération des aliments, entre autres détections biomoléculaires. Cette technologie permet d’identifier rapidement les liaisons potentielles entre les biomolécules, ce qui permet un criblage rapide et convivial et non invasif de divers indicateurs sans qu’il soit nécessaire de les étiqueter. De plus, la technologie SPR facilite la détection en temps réel pour le dépistage de drogues à haut débit. Dans ce programme, le domaine d’application et les principes de base de la technologie SPR sont brièvement présentés. Le processus d’opération est décrit en détail, en commençant par l’étalonnage de l’instrument et le fonctionnement de base du système, suivis de la capture de ligands et de l’analyse multicycle de l’analyte. La courbe en temps réel et les résultats expérimentaux de liaison de la quercétine et de la calycosine à la protéine KCNJ2 ont été élaborés. Dans l’ensemble, la technologie SPR fournit une méthode très spécifique, simple, sensible et rapide pour le criblage de médicaments, la détection en temps réel de la pharmacocinétique associée, la détection de virus et l’identification de l’environnement et de la sécurité alimentaire.

Introduction

La technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) est une technique de détection optique qui élimine le besoin de marquer l’analyte. Il permet une surveillance dynamique et en temps réel de l’affinité de liaison quantitative, de la cinétique et de la thermodynamique. Cette capacité à haut débit est très sensible et reproductible, ce qui permet de mesurer divers taux d’ouverture, taux de désactivation et affinité. De plus, la petite quantité d’échantillon requise renforce encore l’utilité de cette méthode ^1,2. La méthode de détection biomoléculaire à réponse rapide³, qui surveille l’affinité de liaison entre les biomolécules, est devenue un domaine de recherche de premier plan.

La technologie SPR a diverses applications dans le domaine de la recherche et du développement de médicaments⁴. L’une de ses utilisations est de découvrir la base structurelle de cibles médicamenteuses spécifiques. Il peut également être utilisé pour identifier les ingrédients actifs des herbes chinoises qui possèdent des activités pharmacologiques importantes et étudier leurs mécanismes de dépistage et de vérification des médicaments. Gassner et al. ont établi une courbe dose-réponse linéaire pour les anticorps bispécifiques par détermination SPR, ce qui permet l’analyse de la concentration et le contrôle de la qualité⁵. De plus, la SPR peut être utilisée pour effectuer des tests d’immunogénicité cliniques dans la pharmacopée et le développement de vaccins⁶.

Il peut être utilisé dans la détection des résidus de pesticides, des résidus de médicaments vétérinaires, des additifs illégaux, des bactéries pathogènes et des métaux lourds 7,8,9,10 dans les produits agricoles et les tests de sécurité alimentaire. En utilisant la technologie SPR, la précision et l’efficacité de ces tests peuvent être améliorées.

La technologie SPR peut également être appliquée dans la détection rapide des toxines et des antibiotiques. Cette technologie permet de fixer des anticorps viraux, des composés à petites molécules et des aptamères à la puce du biocapteur SPR. La puce du biocapteur SPR détecte ensuite différentes concentrations d’ARN viral sous forme d’analyte¹¹. Cette méthode a été utilisée avec succès dans la détection rapide de virus tels que le virus H5N1, le virus de la grippe aviaire H7N9 et le nouveau coronavirus 12,13,14. En plus de ces applications, la technologie SPR est également utile en protéomique, en criblage de médicaments, en détection en temps réel de la pharmacocinétique associée et à l’étude des protéines et récepteurs viraux et pathogènes 15,16,17,18. Il est particulièrement adapté à la recherche scientifique et aux expériences d’enseignement dans les universités et les instituts de recherche et constitue un outil précieux dans divers contextes scientifiques et de recherche.

Le principe de la SPR est le mouvement oscillatoire collectif des électrons libres à l’interface entre un film métallique et un diélectrique, provoqué par des ondes lumineuses incidentes¹⁹. Il s’agit essentiellement de la résonance entre l’onde évanescente et l’onde plasma sur la surface métallique²⁰. Lorsque la lumière passe d’un milieu photodense à un milieu photophobe, une réflexion totale se produit dans certaines conditions. Du point de vue de l’optique ondulatoire, lorsque la lumière incidente atteint l’interface, elle ne génère pas immédiatement de lumière réfléchie. Au lieu de cela, il traverse d’abord le milieu optiquement phobique à une profondeur d’environ une longueur d’onde. Il s’écoule ensuite le long de l’interface sur environ une demi-longueur d’onde avant de retourner dans le milieu optiquement dense. Cette onde traversant le milieu optiquement phobique est appelée onde évasive, tant que l’énergie totale de la lumière reste constante. Étant donné que le métal contient du gaz d’électrons libres, il peut être considéré comme du plasma. La lumière incidente excite la vibration longitudinale du gaz d’électrons, conduisant à la génération d’une onde de densité de charge le long de l’interface métal-diélectrique, connue sous le nom d’onde plasma de surface. Cette résonance se propage sous la forme d’une atténuation exponentielle dans les deux milieux. Par conséquent, l’énergie de la lumière réfléchie est considérablement réduite. L’angle d’incidence correspondant auquel la lumière réfléchie disparaît complètement est connu sous le nom d’angle de résonance²¹. Le SPR est très sensible à l’indice de réfraction du milieu adhérant à la surface du film métallique²⁰. L’angle SPR varie avec l’indice de réfraction de la surface du film métallique, le changement de l’indice de réfraction étant principalement proportionnel à la masse moléculaire de la surface du film métallique²². Toute modification des propriétés du milieu de surface ou de la quantité d’adhérence entraînera des angles de résonance différents. Ainsi, l’interaction moléculaire peut être analysée en examinant les changements dans l’angle de résonance.

Cette analyse SPR optique non destructive, sans marquage et en temps réel, basée sur les principes ci-dessus, convient à la recherche dans divers domaines. Par conséquent, nous avons démontré le déplacement angulaire de la courbe SPR et les résultats expérimentaux par analyse multi-cycles, en prenant l’exemple de la combinaison de la quercétine et de la calycosine avec la protéine recombinante KCNJ2.

Protocole

REMARQUE : La courbe de détection expérimentale complète indique que le processus expérimental peut être classé en huit étapes distinctes.

1. Préparation de l’échantillon et du tampon

1. Préparez les puces des capteurs avant l’expérience.
   1. Traitez les copeaux avec la solution de piranha (30 % H₂O₂ : H₂SO₄=1:3 ; v/v) pendant 2 min. Ensuite, nettoyez soigneusement la puce avec une grande quantité d’eau déminéralisée, puis trempez-la dans de l’éthanol anhydre, en lui permettant de sécher naturellement.
   2. Ensuite, faites tremper la puce pendant la nuit dans une solution de 11-mercapto-l-undécanol (MUOH) à une concentration de 50 M. Ensuite, placez la puce dans une solution d’épichlorhydrine et laissez-la réagir à 25 °C pendant 4 h.
   3. Retirez la puce de la solution et lavez-la soigneusement avec de l’eau distillée et de l’éthanol anhydre. Enfin, déposez la solution de base de dextran sur la surface du film d’or de la puce et laissez-la réagir à 25 °C pendant 20 h. Nettoyez la puce avec de l’eau désionisée, puis plongez-la dans une solution d’acide bromoacétique pour obtenir la modification de la carboxyméthylation de l’hydroxyle de dextran. Utilisez de la quercétine et de la calycosine d’une pureté ≥98,5 % et ≥99 %, respectivement.
2. Préparez tous les tampons contenant un tampon courant, un activateur, un tampon d’immobilisation (10 mM d’acétate de sodium) et une solution de régénération 10 mM de glycine-HCl, pH 1,5. L’activateur contient 115 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS), 750 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) et 10,5 mL de chlorhydrate d’éthanolamine-NaOH à 1 M à un pH de 8,5. Dissoudre l’EDC et le NHS en ajoutant 10 mL d’eau désionisée filtrée dans chaque flacon (voir le tableau des matières).
   REMARQUE : Conservez les aliquotes EDC et NHS à -18 °C ou moins, utilisez les aliquotes dans les 2 mois. Toutes les solutions doivent être dégazées avant utilisation.

2. Étalonnage de l’instrument

1. Tracez une courbe standard de la concentration d’alcool et de la valeur maximale en injectant de l’alcool à différentes concentrations (rapport volumique de 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % et 0,1 %) sur de l’or nu et en comparant la valeur maximale maximale de l’alcool.
   REMARQUE : L’injection à un débit de 50 μL/min, par un logiciel d’analyse des données d’origine, a obtenu une courbe standard.
2. Selon le manuel technique, calculez le facteur de correction de l’instrument, représenté par K, à l’aide de la formule :
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   Dans cette formule, A et B représentent les valeurs de signal des détecteurs respectifs. La valeur théorique de la pente, telle qu’indiquée dans le manuel, est de 0,06. Par conséquent, le facteur de correction, K, peut être calculé comme suit : K=0,06/R, (où R est la pente de l’équation de régression linéaire obtenue à partir de la courbe standard).
3. Multipliez la valeur Δ[(A-B)/(A+B)] mesurée par le facteur de correction pour obtenir la valeur réelle de Δθ.

3. Fonctionnement de base du système

1. Pour démarrer le système, allumez l’interrupteur d’alimentation et attendez que l’unité de détection atteigne la température prédéfinie (généralement 25 °C).
2. Ouvrez le logiciel de contrôle en cliquant sur Démarrer > programme > logiciel de contrôle OpenSPRTM, et le logiciel se connectera automatiquement au système hôte après son exécution.
3. Suivez la procédure de fonctionnement standard de l’instrument SPR pour installer la puce COOH (puce à base de glucane). Tout d’abord, mettez une goutte d’huile de cèdre à l’arrière de la biopuce SPR. Ensuite, fixez la puce COOH à la surface du prisme du capteur, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air entre la puce et le prisme. Enfin, installez la piscine à flux et serrez-la sur le point lumineux.
   REMARQUE : Positionnez la piscine d’écoulement dans la fente prévue à cet effet et fixez-la solidement à l’aide des vis de fixation. Les dimensions du canal sont de 10 mm x 1 mm x 1 mm.
4. Placement des puces
   1. Pour ouvrir les hachures de puce, sélectionnez l’option Insérer une puce dans le menu Outils . S’il y a déjà une puce dans la baie de puces, cliquez sur l’option Éjecter la puce dans le menu Outils .
   2. Sélectionnez le type de puce correspondant dans le menu déroulant du type de puce si vous utilisez une nouvelle puce et remplissez l’ID de la puce avec les informations expérimentales relatives à la puce. Le numéro de lot de la puce peut être renseigné (facultatif). S’il s’agit d’une puce usagée, sélectionnez Réutiliser la puce et recherchez les informations sur la puce correspondante dans le menu déroulant ID de la puce.
   3. Tenez la puce avec le mot vers le haut, poussez doucement la puce dans la fente pour carte en suivant le sens de la flèche sur la puce, et enfin fermez la porte du compartiment à puce.
   4. Cliquez sur le bouton Dock Chip . Le système passe automatiquement en mode veille une fois la puce placée.
   5. Pour vider l’ensemble du système de flux interne à un débit élevé, sélectionnez Outils > la commande Prime > Démarrer. L’ensemble du processus prend 6-7 min. Cliquez sur Fermer pour faire passer automatiquement le système en état de veille.
5. Appuyez sur le bouton noir situé sur le côté droit du support de tube et maintenez-le enfoncé et ouvrez le couvercle métallique vers la gauche. Après avoir placé le tube à essai approprié, fermez doucement le couvercle métallique. Si vous entendez un clic, le couvercle métallique est verrouillé.
6. Poussez doucement le support de tube à essai le long de la fente de la carte dans le compartiment à échantillon et entendez un clic, indiquant que le support de tube à essai est dans la bonne position et verrouillé.
7. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue Éjecter le plateau de rack pour introduire automatiquement le rack dans le compartiment à échantillons et fermer la porte.
   REMARQUE : Il y a une limite de temps à l’ouverture de la porte de la cabine d’échantillon. La porte se fermera automatiquement après 60 s d’ouverture. Au cours des 15 dernières secondes, le compte à rebours de la boîte de dialogue apparaît en rouge et clignote. Attendez que la porte se referme avant de la rouvrir pour éviter de vous pincer la main.
8. Normalisation des signaux de réponse
   1. Sélectionnez Outil > Autres outils, sélectionnez Normaliser dans le répertoire Outils de maintenance , puis cliquez sur Démarrer > Suivant.
   2. Ajouter 120 μL de solution de normalisation BIA à 70 % dans un tube à essai de 7 mm. Placez le tube à essai dans la position spécifiée indiquée dans le programme (R2F6). Après avoir vérifié que le couvercle du porte-tube est correctement fermé, placez le porte-tube dans le compartiment à échantillons et fermez la porte de la cabine, puis cliquez sur Démarrer pour exécuter le programme.

4. Capture de ligand

1. Mesure du pH
   1. Avant de fixer les ligands sur la puce, tamisez un tampon de ligand approprié pour enrichir les ligands près de la surface de la puce par adsorption électrostatique afin d’obtenir un meilleur effet de couplage. La concentration générale du ligand est de 10 à 100 μg/mL, et pour la première expérience, essayez d’utiliser 20 μg/mL.
   2. Tamisez le ligand à partir d’acétate de sodium de 10 mM avec des valeurs de pH de 5,5, 5,0, 4,5 et 4. Pour définir les paramètres du processus, sélectionnez Exécuter-Assistant, Préparation de surface-Immobilisation Reconnaissance du pH, puis cliquez sur Nouveau.
   3. Sélectionnez le canal de la puce, qui peut être choisi parmi les canaux 1, 2, 3 ou 4. Le tampon dispose de quatre conditions prédéfinies : 10 mM d’acétate de sodium, pH 5,5, 5,0, 4,5 et 4. Ensuite, entrez le nom du ligand, le temps de contact (180 s) et le débit (5 μL/min).
   4. Une fois la surface régénérée avec 50 mM de NaOH, réglez la température de surface de la puce et la température de la chambre d’échantillonnage. Ensuite, sélectionnez le rack d’échantillons et de réactifs1 sur la gauche et placez la solution en fonction de la position correspondante dans le rack d’échantillons. Enregistrez la méthode expérimentale et démarrez-la en cliquant sur Suivant.
2. Immobilisation du ligand
   1. Sélectionnez Exécuter-Assistant, Préparation de surface-Immobilisation et cliquez sur Nouveau. Réglez la capacité de mobilisation sur quatre canaux : FC1, FC2, FC3 et FC4. En général, le canal 1 est utilisé comme référence lors de l’appariement des canaux 1 et 2, et le canal 3 est la référence lors de la mobilisation des quatre canaux.
   2. Utilisez les canaux de référence pour la fixation sans contraste à blanc ou sans ligand fermé par activation, en utilisant les canaux 1 et 2 pour coupler les ligands sur le canal 2.
      REMARQUE : Deux modes d’accouplement sont disponibles : visez le niveau immobilisé et spécifiez le temps de contact. Dans le mode objectif du niveau immobilisé, entrez le niveau de couplage cible, et le logiciel atteindra automatiquement le niveau correspondant. Le mode temps de contact nécessite la saisie du temps d’injection et du débit et est généralement utilisé sur la base de pré-expériences.

5. Méthode de l’analyte à cycles multiples

1. Exécutez Prime et remplissez la seringue et la chambre avec un tampon fixe. Sélectionnez Exécuter-Exécution manuelle , sélectionnez Canaux 1-2 en série sur le chemin d’écoulement, puis cliquez sur Démarrer.
2. Commencer à fonctionner au débit maximal (150 μL/min) et détecter le tampon qui est HEPES (pH 7,4). Lorsqu’une ligne de base stable est atteinte, rincez l’anneau d’échantillonnage avec un tampon et videz l’anneau d’échantillonnage.
   REMARQUE : Si la ligne de base (une ligne d’équilibre formée sur la courbe de détection lors de l’exécution du tampon) n’est pas atteinte dans les 10 minutes, essayez d’injecter 10 mM d’hydroxyde de sodium pendant 30 s.
3. Activez la puce avec la solution EDC/NHS (1:1, 50 μL chacune).
4. Exécutez 200 μL de ligand dilué avec le tampon activé sur l’échantillon pendant 4 min. Une fois la liaison stabilisée, lavez l’anneau d’échantillonnage avec un tampon.
5. Prélever 200 μL de solution bloquante, rincer l’anneau d’échantillonnage avec un tampon et le vider à l’air. Observez la ligne de base pendant 5 minutes pour assurer la stabilité.
6. Diluez les analytes avec une solution tampon, puis prélevez de la quercétine de 3,9 μM, 7,8 μM, 15,625 μM et 31,25 μM, et 15,625 μM, 31,25 μM, 62,5 μM, 125 μM et 250 μM de calycosine, comme échantillons à 20 μL/min.
7. Le temps de liaison de la protéine (10 μg/mL-50 μg/mL) et du ligand est de 240 s, avec un temps de dissociation naturelle de 360 s. Augmenter le débit à 150 μL/min et injecter un tampon de régénération approprié pour éliminer l’analyte.

6. Régénération

1. Pour la régénération, utilisez 10 mM de glycine-HCl, des solutions à haute teneur en sel ou des solutions acido-basiques de différents niveaux de pH (par exemple, 2,5, 4,5, 5,0, 5,5, etc.).
2. Pour filtrer les conditions de régénération, utilisez run-wizard-assay development-regeneration scouting et cliquez sur Nouveau. Sélectionnez 1 à 2 canaux en série sur le chemin d’écoulement, sélectionnez la puce et cliquez sur Suivant.
3. Pour réchauffer la puce, cliquez sur Démarrage, ce qui doit être fait plus de 3 fois. Entrez le nom de l’analyte et réglez le débit de la solution régénérée à 150 μL/min.

7. Analyse des données

1. Analysez les résultats expérimentaux à l’aide d’un logiciel d’analyse de données SPR, à l’aide du modèle d’analyse One to One.
   REMARQUE : L’ensemble du processus est effectué dans la mémoire tampon en cours d’exécution. Les autres tampons utilisés dans le processus de test SPR sont les mêmes que le tampon d’injection.

8. Maintenance du système

1. Une fois l’expérience terminée, retirez la puce de détection et remplacez-la par la puce de maintenance. Remplacez le tampon de fonctionnement par suffisamment d’eau pure fraîche et rincez le système avec un amorçage. Une fois amorcé, le système passera automatiquement en mode veille pour nettoyer la bouteille de liquide usé et changer l’eau de l’aiguille.

Résultats

Pour déterminer si la protéine est fixée à la surface de la puce, l’ordonnée (signal de réponse) de la carte du capteur SPR (Figure 1) est utilisée, tandis que le déplacement angulaire de la courbe SPR est obtenu. Les figures 2 et 3 illustrent la courbe SPR de l’interaction entre la quercétine et la calycosine avec la protéine recombinante KCNJ2 sur la surface immobilisée de la proté...

Discussion

Le cycle d’analyse SPR est divisé en quatre étapes. La première étape, la ligne de base, implique l’injection du tampon. Vient ensuite la deuxième étape, la capture de ligands. La puce du capteur COOH est activée avec EDC/NHS (1:1) à un débit de 20 μL/min. La puce est ensuite désactivée à l’aide de 1 M de chlorhydrate d’éthanolamine-NaOH à un débit de 20 μL/min. Passons à la troisième étape, la méthode de l’analyte à cycles multiples. L’analyte est injec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873