SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술을 사용한 생체 분자 간의 동적 친화도 실시간 검출

요약

본 연구는 여러 영역에서 다양한 응용 분야를 찾는 SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술의 원리와 방법론을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기사에서는 SPR 기술, 작동 단순성 및 놀라운 효율성에 대해 설명하며, 독자들 사이에서 이 기술에 대한 광범위한 인식과 채택을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

초록

SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술은 바이러스, 병원성 분자 단백질 및 수용체를 검출하고, 혈액형을 결정하고, 식품 변조를 검출하는 등 생체 분자 검출을 위한 민감하고 정밀한 방법입니다. 이 기술을 통해 생체 분자 간의 잠재적 결합을 신속하게 식별할 수 있으며, 라벨링할 필요 없이 다양한 지표에 대한 빠르고 사용자 친화적인 비침습적 스크리닝을 용이하게 합니다. 또한 SPR 기술은 고처리량 약물 스크리닝을 위한 실시간 검출을 용이하게 합니다. 이 프로그램에서는 SPR 기술의 응용 분야와 기본 원리를 간략하게 소개합니다. 작업 프로세스는 기기 보정 및 기본 시스템 작동부터 시작하여 리간드 캡처 및 분석물의 다중 주기 분석으로 자세히 설명되어 있습니다. 퀘르세틴과 칼리코신을 KCNJ2 단백질에 결합하는 실시간 곡선과 실험 결과가 정교화되었습니다. 전반적으로 SPR 기술은 약물 스크리닝, 관련 약동학의 실시간 검출, 바이러스 검출, 환경 및 식품 안전 식별을 위한 매우 특이적이고 간단하며 민감하고 신속한 방법을 제공합니다.

서문

표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술은 분석물을 라벨링할 필요가 없는 광학 검출 기술입니다. 이를 통해 정량적 결합 친화도, 동역학 및 열역학에 대한 실시간 및 동적 모니터링이 가능합니다. 이 높은 처리량 용량은 매우 민감하고 재현성이 뛰어나 다양한 개방률, 오프율 및 친화도를 측정할 수 있습니다. 또한, 필요한 소량의 샘플은 이 방법 ^1,2의 유용성을 더욱 향상시킵니다. 생체분자 간의 친화력 결합을 모니터링하는 속반응형 생체분자검출방법(Fast Response Biomolecular Detection^Method3)이 저명한 연구 분야로 떠오르고 있습니다.

SPR 기술은 약물 연구 및 개발 분야에서 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다⁴. 그 용도 중 하나는 특정 약물 표적의 구조적 기반을 발견하는 것입니다. 또한 중요한 약리학적 활성을 가진 한약의 활성 성분을 확인하고 약물 스크리닝 및 검증을 위한 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. Gassner 등은 SPR 측정을 통해 이중특이성 항체에 대한 선형 용량-반응 곡선을 확립했으며, 이를 통해 농도 분석 및 품질 관리가 가능합니다⁵. 또한 SPR은 약전 및 백신 개발에서 임상 면역원성 검사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다⁶.

활용 될 수있는 영역 중 하나는 농약 및 식품 안전 테스트에서 농약 잔류 물, 동물 용 의약품 잔류 물, 불법 첨가제, 병원성 박테리아 및 중금속 ^7,8,9,10을 검출하는 것입니다. SPR 기술을 사용하면 이러한 테스트의 정확성과 효율성을 향상시킬 수 있습니다.

SPR 기술이 적용될 수 있는 또 다른 영역은 독소와 항생제의 신속한 검출입니다. 이 기술을 통해 바이러스 항체, 저분자 화합물 및 압타머를 SPR 바이오센서 칩에 부착할 수 있습니다. 그런 다음 SPR 바이오센서 칩은 다양한 농도의 바이러스 RNA를 분석물¹¹로 검출합니다. 이 방법은 H5N1, H7N9 조류 인플루엔자 바이러스 및 신종 코로나 바이러스 12,13,14와 같은 바이러스의 신속한 검출에 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 응용 분야 외에도 SPR 기술은 단백질체학, 약물 스크리닝, 관련 약동학의 실시간 검출, 바이러스 및 병원성 단백질 및 수용체 연구에도 유용합니다 15,16,17,18. 특히 대학 및 연구 기관의 과학 연구 및 교육 실험에 적합하며 다양한 과학 및 연구 환경에서 유용한 도구입니다.

SPR의 원리는 입사 광파¹⁹에 의해 발생하는 금속막과 유전체 사이의 계면에서 자유 전자의 집단 진동 운동입니다. 그것은 본질적으로 금속 표면(²⁰) 상의 소실파와 플라즈마파 사이의 공명이다. 빛이 광밀도가 높은 매체에서 광공포성 매체로 전환될 때 특정 조건에서 전체 반사가 발생합니다. 파동 광학의 관점에서 볼 때, 입사광이 계면에 도달했을 때, 즉시 반사광을 생성하지 않습니다. 대신, 먼저 약 1 파장의 깊이에서 광학 공포성 매질을 통과합니다. 그런 다음 광학적으로 조밀한 매체로 돌아가기 전에 약 절반 파장 동안 계면을 따라 흐릅니다. 광학 공포증 매질을 통과하는 이 파동은 빛의 총 에너지가 일정하게 유지되는 한 회피파라고 합니다. 금속에는 자유 전자 가스가 포함되어 있기 때문에 플라즈마로 간주 될 수 있습니다. 입사광은 전자 가스의 종방향 진동을 자극하여 표면 플라즈마파로 알려진 금속-유전체 계면을 따라 전하 밀도 파동을 생성합니다. 이 공명은 두 매체 모두에서 기하급수적 감쇠의 형태로 전파됩니다. 결과적으로 반사된 빛의 에너지가 크게 감소합니다. 반사광이 완전히 사라지는 대응하는 입사각은 공진각^{(resonance angle)21}로 알려져 있다. SPR은 금속막 표면⁽²⁰)에 부착하는 매체의 굴절률에 매우 민감하다. SPR 각도는 금속 필름 표면의 굴절률에 따라 변하며, 굴절률 변화는 주로 금속 필름 표면⁽²²)의 분자 질량에 비례합니다. 표면 매체의 특성이나 접착력의 변화는 다른 공진 각도를 초래합니다. 따라서 분자 상호 작용은 공진 각도의 변화를 검사하여 분석할 수 있습니다.

위의 원리를 기반으로 하는 이 비파괴, 라벨 없는 실시간 광학 SPR 분석은 다양한 분야의 연구에 적합합니다. 따라서 SPR 곡선의 각도 변위와 실험 결과를 다주기 분석을 통해 입증했으며, KCNJ2 재조합 단백질과 케르세틴과 칼리코신의 조합을 예로 들었습니다.

프로토콜

참고: 전체 실험 감지 곡선은 실험 과정을 8개의 개별 단계로 분류할 수 있음을 나타냅니다.

1. 샘플 및 완충액 준비

1. 실험 전에 센서 칩을 준비합니다.
   1. 칩을 피라냐 용액(30% H₂O₂: H₂SO₄=1:3; v/v)으로 2분 동안 처리합니다. 그런 다음 다량의 탈이온수로 칩을 철저히 세척한 다음 무수 에탄올에 담그어 자연 건조시킵니다.
   2. 다음으로, 칩을 50M 농도의 11-메르캅토-l-운데칸올(MUOH) 용액에 밤새 담가둡니다.그 후, 칩을 에피클로로히드린 용액에 넣고 25°C에서 4시간 동안 반응시킵니다.
   3. 용액에서 칩을 제거하고 증류수와 무수 에탄올로 철저히 씻으십시오. 마지막으로 dextran basic 용액을 칩의 금 필름 표면에 떨어뜨리고 25°C에서 20시간 동안 반응하도록 합니다. 탈이온수로 칩을 세척한 다음 브로모아세트산 용액에 담궈 덱스트란 하이드록실 카르복시메틸화 변형을 달성합니다. 순도가 각각 ≥98.5% 및 ≥99%인 케르세틴과 칼리코신을 사용하십시오.
2. 러닝 버퍼, 활성제, 고정 버퍼(10mM 아세트산 나트륨) 및 재생 용액 10mM 글리신-HCl, pH 1.5를 포함하는 모든 버퍼를 준비합니다. 활성제에는 115mg의 N-하이드록시숙신이미드(NHS), 750mg의 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC) 및 pH 8.5에서 1M 에탄올아민 염산염-NaOH 10.5mL가 포함되어 있습니다. 각 바이알에 여과된 탈이온수 10mL를 추가하여 EDC와 NHS를 용해합니다( 재료 표 참조).
   참고: EDC 및 NHS 부분 표본은 -18 °C 이하에서 보관하고 2개월 이내에 부분 표본을 사용하십시오. 모든 용액은 사용하기 전에 가스를 제거해야 합니다.

2. 기기 교정

1. 금에 서로 다른 농도(2%, 1%, 0.5%, 0.2% 및 0.1% 부피 비율)로 알코올을 주입하여 알코올 농도와 피크 값의 표준 곡선을 그리고 알코올의 최대 피크 값을 비교합니다.
   참고: 50μL/min의 유속으로 주입하면 출처 데이터 분석 소프트웨어로 표준 곡선을 얻었습니다.
2. 기술 매뉴얼에 따르면 다음 공식을 사용하여 K로 표시되는 기기의 수정 계수를 계산합니다.
   K=Δθ/Δ[(AB)/(A+B)]
   이 공식에서 A와 B는 각 검출기의 신호 값을 나타냅니다. 설명서에 표시된 이론적 기울기 값은 0.06입니다. 따라서 수정 계수 K는 K=0.06/R로 계산할 수 있습니다(여기서 R은 표준 곡선에서 얻은 선형 회귀 방정식의 기울기입니다).
3. 측정된 Δ[(A-B)/(A+B)] 값에 보정 계수를 곱하여 실제 Δθ 값을 구합니다.

3. 기본 시스템 작동

1. 시스템을 시작하려면 전원 스위치를 켜고 감지 장치가 미리 설정된 온도(보통 25°C)에 도달할 때까지 기다립니다.
2. OpenSPRTM Control Software>> 프로그램 시작을 클릭하여 제어 소프트웨어를 열면 소프트웨어 프로그램이 실행 후 호스트 시스템에 자동으로 연결됩니다.
3. SPR 기기의 표준 작동 절차에 따라 COOH 칩(글루칸 기반 칩)을 설치하십시오. 먼저 SPR 바이오칩 뒷면에 삼나무 기름 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 COOH 칩을 센서의 프리즘 표면에 부착하여 칩과 프리즘 사이에 기포가 없는지 확인합니다. 마지막으로 플로우 풀을 설치하고 라이트 스폿까지 조입니다.
   알림: 플로우 풀을 지정된 슬롯에 놓고 고정 나사를 사용하여 단단히 고정합니다. 채널 치수는 10mm x 1mm x 1mm입니다.
4. 칩 배치
   1. 칩 해치를 열려면 도구 메뉴에서 칩 삽입 옵션을 선택합니다. 칩 베이에 이미 칩이 있는 경우 Tools(도구) 메뉴에서 Eject Chip(칩 추출) 옵션을 클릭합니다.
   2. 새 칩을 사용하는 경우 칩 유형 드롭다운 메뉴에서 해당 칩 유형을 선택하고 칩과 관련된 실험 정보로 칩 ID를 입력합니다. 칩 로트 번호를 채울 수 있습니다(선택 사항). 중고 칩인 경우 Reuse Chip(칩 재사용 )을 선택하고 Chip ID(칩 ID) 드롭다운 메뉴에서 해당 칩 정보를 찾습니다.
   3. 단어 면이 위를 향하도록 칩을 잡고 칩의 화살표 방향을 따라 칩을 카드 슬롯에 부드럽게 밀어 넣은 다음 마지막으로 칩 구획의 도어를 닫습니다.
   4. Dock Chip 버튼을 클릭합니다. 시스템은 칩이 배치된 후 자동으로 대기 상태로 전환됩니다.
   5. 전체 내부 흐름 시스템을 높은 유속으로 플러시하려면 도구 > 프라임 명령 > 시작을 선택합니다. 전체 프로세스는 6-7분 정도 소요됩니다. 닫기 를 클릭하면 시스템이 대기 상태로 자동 전환됩니다.
5. 튜브 홀더 오른쪽에 있는 검은색 버튼을 길게 누르고 왼쪽에 있는 금속 덮개를 엽니다. 적절한 시험관을 놓은 후 금속 뚜껑을 부드럽게 닫습니다. 딸깍 소리가 들리면 금속 덮개가 잠겨 있는 것입니다.
6. 카드 슬롯을 따라 시험관 홀더를 시료 격실에 부드럽게 밀어 넣고 딸깍 소리가 들리면 시험관 홀더가 올바른 위치에 있고 잠겨 있음을 나타냅니다.
7. Eject Rack Tray 대화 상자에서 OK(확인)를 클릭하여 랙을 샘플 격실에 자동으로 공급하고 도어를 닫습니다.
   참고: 샘플 캐빈 도어가 열릴 때 시간 제한이 있습니다. 문이 열린 지 60초 후에 자동으로 닫힙니다. 마지막 15초 동안 대화 상자의 카운트다운이 빨간색 글꼴로 나타나고 깜박입니다. 손이 끼지 않도록 문이 닫힐 때까지 기다렸다가 다시 열십시오.
8. 응답 신호의 정규화
   1. Tool > More Tools를 선택하고 Maintenance Tools 디렉토리에서 Normalize를 선택한 후 Start > Next를 클릭합니다.
   2. 7mm 시험관에 120μL의 70% BIA 정규화 용액을 추가합니다. 프로그램(R2F6)에 표시된 지정된 위치에 시험관을 놓습니다. 튜브 홀더 덮개가 제대로 닫혔는지 확인한 후 튜브 홀더를 샘플 컴파트먼트에 놓고 객실 도어를 닫은 다음 시작을 클릭하여 프로그램을 실행합니다.

4. 리간드 포획

1. pH 측정
   1. 칩에 리간드를 고정하기 전에 적절한 리간드 완충액 pH를 스크리닝하여 정전기 흡착을 통해 칩 표면 근처의 리간드를 풍부하게 하여 더 나은 결합 효과를 달성합니다. 일반적인 리간드 농도는 10-100 μg/mL이며, 첫 번째 실험에서는 20 μg/mL를 사용해 보십시오.
   2. pH 값이 5.5, 5.0, 4.5 및 4인 10mM 아세트산 나트륨에서 리간드를 스크리닝합니다. 프로세스 매개변수를 설정하려면 Run-Wizard(실행-마법사), Surface Preparation-Immobilization(표면 처리-고정) pH Scouting(pH 스카우팅)을 선택하고 New(새로 만들기)를 클릭합니다.
   3. 채널 1, 2, 3 또는 4에서 선택할 수 있는 칩 채널을 선택합니다. 버퍼에는 10mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 5.0, 4.5 및 4의 네 가지 사전 설정 조건이 있습니다. 그런 다음 리간드 이름, 접촉 시간(180초) 및 유속(5μL/분)을 입력합니다.
   4. 표면이 50mM NaOH로 재생된 후 칩 표면 온도와 샘플 챔버의 온도를 설정합니다. 다음으로, 왼쪽에서 샘플과 시약 rack1을 선택하고 샘플 랙의 해당 위치에 따라 용액을 놓습니다. 실험 방법을 저장하고 다음을 클릭하여 실험을 시작합니다.
2. 리간드 고정화
   1. Run-Wizard(실행-마법사), Surface Preparation-Immobilization(표면 준비-고정)을 선택하고 New(새로 만들기)를 클릭합니다. 동원 기능을 FC1, FC2, FC3 및 FC4의 4개 채널로 설정합니다. 일반적으로 채널 1은 채널 1과 2를 페어링할 때 참조로 사용되며 채널 3은 4개의 채널을 모두 동원할 때 참조로 사용됩니다.
   2. 블랭크 콘트라스트 또는 활성화 폐쇄 리간드가 없는 고정을 위해 참조 채널을 사용하고, 채널 1과 2를 사용하여 채널 2의 리간드를 커플링합니다.
      참고: 두 가지 커플링 모드를 사용할 수 있습니다: 고정 수준을 목표로 하고 접촉 시간을 지정합니다. 고정 레벨 모드를 목표로 목표 커플링 레벨을 입력하면 소프트웨어가 자동으로 해당 레벨을 달성합니다. 접촉 시간 모드는 사출 시간과 유량을 입력해야 하며 일반적으로 사전 실험을 기반으로 사용됩니다.

5. 다주기 분석물 방법

1. Prime을 실행하고 주사기와 챔버를 고정 버퍼로 채웁니다. Run-Manual run(실행-수동 실행)을 선택하고 흐름 경로에서 Channels 1-2 in series(직렬로 채널 1-2)를 선택한 다음 Start(시작)를 클릭합니다.
2. 최대 유속(150μL/min)에서 실행을 시작하고 HEPES(pH 7.4)인 버퍼를 검출합니다. 안정적인 기준선에 도달하면 버퍼로 샘플 링을 플러시하고 샘플 링을 비웁니다.
   참고: 기준선(버퍼가 실행될 때 감지 곡선에 형성된 평형선)에 10분 이내에 도달하지 않으면 10mM의 수산화나트륨을 30초 동안 주입해 보십시오.
3. EDC/NHS(1:1, 각 50μL) 솔루션으로 칩을 활성화합니다.
4. 활성화된 완충액으로 희석된 200μL의 리간드를 샘플에서 4분 동안 실행합니다. 결합이 안정화되면 버퍼로 샘플 링을 세척합니다.
5. 200μL의 차단 용액을 샘플링하고 샘플 링을 버퍼로 헹구고 공기로 비웁니다. 안정성을 보장하기 위해 5분 동안 기준선을 관찰합니다.
6. 완충 용액으로 분석물을 희석한 다음 3.9μM, 7.8μM, 15.625μM, 31.25μM 케르세틴과 15.625μM, 31.25μM, 62.5μM, 125μM 및 250μM 칼리코신을 20μL/분의 샘플로 채취합니다.
7. 단백질(10μg/mL-50μg/mL)과 리간드의 결합 시간은 240초이며 자연 해리 시간은 360초입니다. 유속을 150μL/min으로 높이고 적절한 재생 버퍼를 주입하여 분석물을 제거합니다.

6. 재생

1. 재생을 위해 10mM 글리신-HCl, 고염 또는 다양한 pH 수준(예: 2.5, 4.5, 5.0, 5.5 등)의 산-염기 용액을 사용하십시오.
2. 재생 조건을 스크리닝하려면 run-wizard-assay development-regeneration scouting을 사용하고 New를 클릭합니다. 흐름 경로에서 직렬로 1-2개의 채널을 선택하고 칩을 선택한 후 다음을 클릭합니다.
3. 칩을 워밍업하려면 3번 이상 수행해야 하는 시작을 클릭하십시오. 분석물의 이름을 입력하고 재생된 용액의 유속을 150μL/분으로 설정합니다.

7. 데이터 분석

1. 일대일 분석 모델을 사용하여 SPR 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 실험 결과를 분석합니다.
   참고: 전체 프로세스는 실행 중인 버퍼에서 수행됩니다. SPR 분석 공정에 사용되는 다른 완충액은 주입 완충액과 동일합니다.

8. 시스템 유지 보수

1. 실험을 완료한 후 감지 칩을 제거하고 유지 관리 칩으로 교체하십시오. 흐르는 버퍼를 충분한 양의 깨끗한 물로 교체하고 시스템을 프라임으로 세척합니다. 프라이밍이 완료되면 시스템이 자동으로 대기 모드로 전환되어 폐액 병을 청소하고 바늘 물을 교체합니다.

결과

단백질이 칩 표면에 고정되어 있는지 여부를 확인하기 위해 SPR 센서 맵(그림 1)의 세로좌표(응답 신호)가 사용되며 SPR 곡선의 각도 변위가 얻어집니다. 그림 2 및 그림 3 은 3.9μM에서 250μM 범위의 농도에서 대조군 감소 후 KCNJ2 재조합 단백질의 고정된 표면에서 케르세틴과 칼리코신과 KCNJ2 재조합 단백질 ?...

토론

SPR 분석 주기는 4단계로 나뉩니다. 첫 번째 단계인 기준선에는 버퍼 주입이 포함됩니다. 그 다음은 두 번째 단계인 리간드 포획입니다. 센서 칩 COOH는 20μL/min의 유속으로 EDC/NHS(1:1)로 활성화됩니다. 그런 다음 칩은 20μL/min의 유속으로 1M 에탄올아민 염산염-NaOH를 사용하여 비활성화됩니다. 세 번째 단계인 다중 주기 분석물 분석법으로 이동합니다. 분석물은 240초의 결합상 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873