Detecção em tempo real de afinidade dinâmica entre biomoléculas usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

Resumo

O presente estudo tem como objetivo elucidar o princípio e a metodologia da tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR), que encontra aplicações versáteis em vários domínios. Este artigo descreve a tecnologia SPR, sua simplicidade operacional e sua notável eficácia, com o objetivo de promover uma maior conscientização e adoção dessa tecnologia entre os leitores.

Resumo

A tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) é um método preciso e sensível para detectar vírus, proteínas moleculares patogênicas e receptores, determinar tipos sanguíneos e detectar adulteração de alimentos, entre outras detecções biomoleculares. Essa tecnologia permite a identificação rápida de possíveis ligações entre biomoléculas, facilitando a triagem rápida e não invasiva de vários indicadores sem a necessidade de rotulagem. Além disso, a tecnologia SPR facilita a detecção em tempo real para triagem de drogas de alto rendimento. Neste programa, o campo de aplicação e os princípios básicos da tecnologia SPR são brevemente introduzidos. O processo de operação é descrito em detalhes, começando com a calibração do instrumento e a operação básica do sistema, seguida pela captura de ligantes e análise multiciclo do analito. A curva em tempo real e os resultados experimentais da ligação da quercetina e da calicosina à proteína KCNJ2 foram elaborados. No geral, a tecnologia SPR fornece um método altamente específico, simples, sensível e rápido para triagem de medicamentos, detecção em tempo real de farmacocinética relacionada, detecção de vírus e identificação ambiental e de segurança alimentar.

Introdução

A tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) é uma técnica de detecção óptica que elimina a necessidade de rotular o analito. Ele permite o monitoramento dinâmico e em tempo real da afinidade de ligação quantitativa, cinética e termodinâmica. Essa capacidade de alto rendimento é altamente sensível e reprodutível, permitindo a medição de várias taxas de abertura, taxas de desligamento e afinidade. Além disso, a pequena quantidade de amostra necessária aumenta ainda mais a utilidade desse método ^1,2. O método de detecção biomolecular de resposta rápida³, que monitora a ligação de afinidade entre biomoléculas, emergiu como uma área de pesquisa proeminente.

A tecnologia SPR tem várias aplicações no campo da pesquisa e desenvolvimento de medicamentos⁴. Um de seus usos é descobrir a base estrutural de alvos específicos de drogas. Também pode ser empregado para identificar os ingredientes ativos de ervas chinesas que possuem atividades farmacológicas significativas e estudar seus mecanismos para triagem e verificação de medicamentos. Gassner e col. estabeleceram uma curva dose-resposta linear para anticorpos biespecíficos por meio da determinação de SPR, o que permite a análise de concentração e controle de qualidade⁵. Além disso, a SPR pode ser utilizada para a realização de testes clínicos de imunogenicidade na farmacopeia e no desenvolvimento de vacinas⁶.

Uma área em que pode ser utilizado é na detecção de resíduos de pesticidas, resíduos de medicamentos veterinários, aditivos ilegais, bactérias patogênicas e metais pesados 7,8,9,10 em produtos agrícolas e testes de segurança alimentar. Ao usar a tecnologia SPR, a precisão e a eficiência desses testes podem ser melhoradas.

Outra área em que a tecnologia SPR pode ser aplicada é na detecção rápida de toxinas e antibióticos. Essa tecnologia permite a anexação de anticorpos virais, compostos de moléculas pequenas e aptâmeros ao chip biossensor SPR. O chip biossensor SPR detecta diferentes concentrações de RNA viral como o analito¹¹. Esse método tem sido usado com sucesso na detecção rápida de vírus como H5N1, vírus da gripe aviária H7N9 e novo coronavírus 12,13,14. Além dessas aplicações, a tecnologia SPR também é útil em proteômica, triagem de drogas, detecção em tempo real de farmacocinética relacionada e estudo de vírus e proteínas e receptores patogênicos 15,16,17,18. É particularmente adequado para pesquisa científica e experimentos de ensino em universidades e institutos de pesquisa e é uma ferramenta valiosa em vários ambientes científicos e de pesquisa.

O princípio da SPR é o movimento oscilatório coletivo de elétrons livres na interface entre um filme metálico e o dielétrico, causado por ondas de luz incidentes¹⁹. É essencialmente a ressonância entre a onda evanescente e a onda de plasma na superfície do metal²⁰. Quando a luz faz a transição de um meio fotodenso para um meio fotofóbico, a reflexão total ocorre sob certas condições. Do ponto de vista da óptica de onda, quando a luz incidente atinge a interface, ela não gera imediatamente a luz refletida. Em vez disso, ele primeiro passa pelo meio opticamente fóbico a uma profundidade de aproximadamente um comprimento de onda. Em seguida, flui ao longo da interface por cerca de meio comprimento de onda antes de retornar ao meio opticamente denso. Essa onda que passa pelo meio opticamente fóbico é chamada de onda evasiva, desde que a energia total da luz permaneça constante. Como o metal contém gás de elétrons livre, ele pode ser considerado plasma. A luz incidente excita a vibração longitudinal do gás de elétrons, levando à geração de uma onda de densidade de carga ao longo da interface metal-dielétrico, conhecida como onda de plasma de superfície. Essa ressonância se propaga na forma de atenuação exponencial em ambos os meios. Consequentemente, a energia da luz refletida é significativamente reduzida. O ângulo de incidência correspondente no qual a luz refletida desaparece completamente é conhecido como ângulo de ressonância²¹. A SPR é altamente sensível ao índice de refração do meio aderente à superfície do filme metálico²⁰. O ângulo SPR varia com o índice de refração da superfície do filme metálico, sendo a mudança do índice de refração principalmente proporcional à massa molecular da superfície do filme metálico²². Quaisquer alterações nas propriedades do meio superficial ou na quantidade de adesão resultarão em diferentes ângulos de ressonância. Assim, a interação molecular pode ser analisada examinando as mudanças no ângulo de ressonância.

Esta análise óptica SPR não destrutiva, sem rótulos e em tempo real, baseada nos princípios acima, é adequada para pesquisas em vários campos. Portanto, demonstramos o deslocamento angular da curva SPR e os resultados experimentais por meio de análise multiciclo, tomando como exemplo a combinação de quercetina e calicosina com a proteína recombinante KCNJ2.

Protocolo

NOTA: A curva de detecção experimental completa indica que o processo experimental pode ser categorizado em oito estágios distintos.

1. Preparação da amostra e do tampão

1. Prepare os chips do sensor antes do experimento.
   1. Trate os chips com a solução de piranha (30% H₂O₂: H₂SO₄ = 1: 3; v / v) por 2 min. Em seguida, limpe bem o cavaco com uma grande quantidade de água deionizada e depois mergulhe-o em etanol anidro, deixando-o secar naturalmente.
   2. Em seguida, mergulhe o chip durante a noite em uma solução de 11-mercapto-l-undecanol (MUOH) com uma concentração de 50 M. Em seguida, coloque o chip em uma solução de epicloridrina e deixe-o reagir a 25 ° C por 4 h.
   3. Remova o chip da solução e lave-o bem com água destilada e etanol anidro. Finalmente, coloque a solução básica de dextrano na superfície do filme de ouro do chip e deixe-o reagir a 25 ° C por 20 h. Limpe o chip com água deionizada e, em seguida, mergulhe-o em uma solução de ácido bromoacético para obter a modificação da hidroxila carboximetilação do dextrano. Use quercetina e calicosina com pureza ≥98,5% e ≥99%, respectivamente.
2. Prepare todos os tampões contendo tampão de corrida, ativador, tampão de imobilização (acetato de sódio 10 mM) e solução de regeneração 10 mM de glicina-HCl, pH 1,5. O ativador contém 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 750 mg de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC) e 10,5 mL de cloridrato de etanolamina-NaOH 1 M em pH 8,5. Dissolva o EDC e o NHS adicionando 10 mL de água deionizada filtrada a cada frasco (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Armazene alíquotas EDC e NHS a -18 ° C ou menos, use alíquotas dentro de 2 meses. Todas as soluções devem ser desgaseificadas antes da utilização.

2. Calibração do instrumento

1. Desenhe uma curva padrão de concentração de álcool e valor de pico injetando álcool em diferentes concentrações (proporção de volume de 2%, 1%, 0,5%, 0,2% e 0,1%) em ouro nu e comparando o valor máximo de pico de álcool.
   NOTA: Injetando a uma taxa de fluxo de 50 μL/min, pelo software de análise de dados de origem obteve uma curva padrão.
2. De acordo com o manual técnico, calcule o fator de correção do instrumento, representado por K, usando a fórmula:
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   Nesta fórmula, A e B representam os valores de sinal dos respectivos detectores. O valor teórico da inclinação, conforme indicado no manual, é de 0,06. Portanto, o fator de correção, K, pode ser calculado como K=0,06/R, (onde R é a inclinação da equação de regressão linear obtida a partir da curva padrão).
3. Multiplique o valor Δ[(A-B)/(A+B)] medido pelo fator de correção para obter o valor Δθ real.

3. Operação básica do sistema

1. Para iniciar o sistema, ligue o interruptor de alimentação e aguarde até que a unidade de detecção atinja a temperatura predefinida (geralmente 25 °C).
2. Abra o software de controle clicando em Iniciar > programa > software de controle OpenSPRTM e o programa de software se conectará automaticamente ao sistema host após a execução.
3. Siga o procedimento operacional padrão do instrumento SPR para instalar o chip COOH (chip à base de glucano). Em primeiro lugar, coloque uma gota de óleo de cedro na parte de trás do biochip SPR. Em seguida, conecte o chip COOH à superfície do prisma do sensor, garantindo que não haja bolhas de ar entre o chip e o prisma. Por fim, instale a piscina de fluxo e aperte-a no ponto de luz.
   NOTA: Posicione a poça de fluxo na ranhura designada e fixe-a firmemente usando os parafusos de fixação. As dimensões do canal são 10 mm x 1 mm x 1 mm.
4. Colocação de chips
   1. Para abrir a hachura de cavacos, selecione a opção Inserir cavaco no menu Ferramentas . Se já houver um chip no compartimento de chips, clique na opção Ejetar chip no menu Ferramentas .
   2. Selecione o tipo de chip correspondente no menu suspenso do tipo de chip se estiver usando um novo chip e preencha o ID do chip com as informações experimentais relacionadas ao chip. O número do lote do chip pode ser preenchido (opcional). Se for um chip usado, selecione Reutilizar chip e encontre as informações do chip correspondente no menu suspenso ID do chip.
   3. Segure o chip com a palavra lado voltado para cima, empurre suavemente o chip no slot do cartão seguindo a direção da seta no chip e, finalmente, feche a porta do compartimento do chip.
   4. Clique no botão Dock Chip . O sistema mudará automaticamente para o estado de espera depois que o chip for colocado.
   5. Para liberar todo o sistema de fluxo interno em uma alta taxa de fluxo, selecione o comando Ferramentas > Prime > Iniciar. Todo o processo leva de 6 a 7 minutos. Clique em Fechar para alternar automaticamente o sistema para o estado de espera.
5. Pressione e segure o botão preto no lado direito do suporte do tubo e abra a tampa de metal para a esquerda. Depois de colocar o tubo de ensaio apropriado, feche suavemente a tampa de metal. Se você ouvir um clique, a tampa de metal está travada.
6. Empurre suavemente o suporte do tubo de ensaio ao longo do slot do cartão no sample compartimento e ouça um clique, indicando que o suporte do tubo de ensaio está na posição correta e travado.
7. Clique em OK na caixa de diálogo Ejetar bandeja do rack para alimentar automaticamente o rack no compartimento de amostra e fechar a porta.
   NOTA: Há um limite de tempo quando a porta da cabine de amostra é aberta. A porta fechará automaticamente após 60 s de abertura. Nos últimos 15 s, a contagem regressiva na caixa de diálogo aparece em fonte vermelha e pisca. Aguarde o fechamento da porta antes de reabri-la para evitar apertar a mão.
8. Normalização de sinais de resposta
   1. Selecione Ferramenta > Mais Ferramentas, selecione Normalizar no diretório Ferramentas de Manutenção e clique em Iniciar > Avançar.
   2. Adicione 120 μL de solução normalizante de BIA a 70% a um tubo de ensaio de 7 mm. Coloque o tubo de ensaio na posição especificada mostrada no programa (R2F6). Depois de confirmar que a tampa do suporte do tubo está fechada corretamente, coloque o suporte do tubo no sample compartimento e feche a porta da cabine e clique em Iniciar para executar o programa.

4. Captura de ligante

1. Medição de pH
   1. Antes de fixar os ligantes no chip, selecione um pH de tampão de ligante adequado para enriquecer os ligantes próximos à superfície do chip por meio de adsorção eletrostática para obter um melhor efeito de acoplamento. A concentração geral do ligante é de 10-100 μg/mL e, para o primeiro experimento, tente usar 20 μg/mL.
   2. Filtre o ligante de acetato de sódio 10 mM com valores de pH de 5,5, 5,0, 4,5 e 4. Para definir os parâmetros do processo, selecione Assistente de execução, Preparação de superfície-Reconhecimento de pH de imobilização e clique em Novo.
   3. Selecione o canal do chip, que pode ser escolhido entre os canais 1, 2, 3 ou 4. O tampão tem quatro condições predefinidas: acetato de sódio de 10 mM, pH 5,5, 5,0, 4,5 e 4. Em seguida, insira o nome do ligante, o tempo de contato (180 s) e a taxa de fluxo (5 μL/min).
   4. Depois que a superfície for regenerada com 50 mM NaOH, defina a temperatura da superfície do cavaco e a temperatura da câmara de amostra. Em seguida, selecione sample e reagent rack1 à esquerda e coloque a solução de acordo com a posição correspondente no sample rack. Salve o método experimental e inicie o experimento clicando em Avançar.
2. Imobilização do ligante
   1. Selecione Assistente de execução, Preparação de superfície-imobilização e clique em Novo. Defina a capacidade de mobilização para quatro canais: FC1, FC2, FC3 e FC4. Geralmente, o canal 1 é usado como referência ao emparelhar os canais 1 e 2, e o canal 3 é a referência ao mobilizar todos os quatro canais.
   2. Use os canais de referência para contraste em branco ou fixação sem ligante fechada por ativação, usando os canais 1 e 2 para acoplar ligantes no canal 2.
      NOTA: Existem dois modos de acoplamento disponíveis: apontar para o nível imobilizado e especificar o tempo de contato. No modo de nível de mira imobilizado, insira o nível de acoplamento alvo e o software atingirá automaticamente o nível correspondente. O modo de tempo de contato requer a entrada de tempo de injeção e vazão e geralmente é usado com base em pré-experimentos.

5. Método de analito multiciclo

1. Execute o Prime e encha a seringa e a câmara com um tampão fixo. Selecione Executar-Execução manual , selecione Canais 1-2 em série no caminho do fluxo e clique em Iniciar.
2. Comece a funcionar na vazão máxima (150 μL/min) e detecte o tampão que é HEPES (pH 7,4). Quando uma linha de base estável for atingida, lave o anel de amostra com tampão e esvazie o anel de amostra.
   NOTA: Se a linha de base (uma linha de equilíbrio formada na curva de detecção quando o tampão é executado) não for alcançada em 10 min, tente injetar 10 mM de hidróxido de sódio por 30 s.
3. Ative o chip com solução EDC/NHS (1:1, 50 μL cada).
4. Execute 200 μL de ligante diluído com o tampão ativado na amostra por 4 min. Assim que a ligação estiver estabilizada, lave o anel de amostra com tampão.
5. Colher 200 μL de solução de bloqueio, enxaguar o anel de amostra com tampão e esvaziá-lo com ar. Observe a linha de base por 5 min para garantir a estabilidade.
6. Dilua os analitos com solução tampão e, em seguida, pegue 3,9 μM, 7,8 μM, 15,625 μM e 31,25 μM de quercetina e 15,625 μM, 31,25 μM, 62,5 μM, 125 μM e 250 μM de calicosina, como amostras a 20 μL / min.
7. O tempo de ligação da proteína (10 μg/mL-50 μg/mL) e do ligante é de 240 s, com um tempo de dissociação natural de 360 s. Aumente a taxa de fluxo para 150 μL / min e injete o tampão de regeneração apropriado para remover o analito.

6. Regeneração

1. Para regeneração, use 10 mM de glicina-HCl, alto teor de sal ou soluções ácido-base de vários níveis de pH (por exemplo, 2,5, 4,5, 5,0, 5,5, etc.).
2. Para filtrar as condições de regeneração, use run-wizard-assay development-regeneration scouting e clique em New. Selecione 1-2 canais em série no caminho do fluxo, selecione o chip e clique em Avançar.
3. Para aquecer o chip, clique em Inicialização, o que deve ser feito mais de 3x. Digite o nome do analito e defina a taxa de fluxo da solução regenerada para 150 μL/min.

7. Análise dos dados

1. Analise os resultados experimentais usando um software de análise de dados SPR, usando o modelo de análise One to One.
   NOTA: Todo o processo é conduzido no buffer em execução. Os outros tampões usados no processo de ensaio SPR são os mesmos que o tampão de injeção.

8. Manutenção do sistema

1. Depois de concluir o experimento, remova o chip de detecção e substitua-o pelo chip de manutenção. Substitua o buffer de corrida por água pura e fresca suficiente e lave o sistema com escorva. Uma vez preparado, o sistema mudará automaticamente para o modo de espera para limpar a garrafa de líquido residual e trocar a água da agulha.

Resultados

Para determinar se a proteína está fixada na superfície do chip, a ordenada (sinal de resposta) do mapa do sensor SPR (Figura 1) é usada, enquanto o deslocamento angular da curva SPR é obtido. A Figura 2 e a Figura 3 mostram a curva SPR da interação entre quercetina e calicosina com a proteína recombinante KCNJ2 na superfície imobilizada da proteína recombinante KCNJ2 após a redução do ...

Discussão

O ciclo de análise da SPR é dividido em quatro etapas. O primeiro estágio, a linha de base, envolve a injeção do tampão. Em seguida, vem o segundo estágio, a captura de ligantes. O chip sensor COOH é ativado com EDC/NHS (1:1) a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. O chip é então desativado usando cloridrato de etanolamina-NaOH 1 M a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. Passando para o terceiro estágio, o método de analito multiciclo. O analito é injetado no canal a uma taxa de fluxo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
Anhydrous ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blocking solution	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd., Shanghai, China	110050
Bromoacetic acid	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.,Shanghai, China	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	492515
Ethanolamine hydrochloride	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873