Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Resumen

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Resumen

El transporte bidireccional de cargas a lo largo del axón es fundamental para mantener las sinapsis funcionales, la conectividad neuronal y las neuronas sanas. El transporte axonal se interrumpe en múltiples enfermedades neurodegenerativas, y las neuronas de proyección son particularmente vulnerables debido a la necesidad de transportar materiales celulares a largas distancias y mantener una masa axonal sustancial. Las modificaciones patológicas de varias proteínas relacionadas con la enfermedad afectan negativamente al transporte, como la tau, la β amiloide, la α-sinucleína, la superóxido dismutasa y la huntingtina, lo que proporciona un posible mecanismo común por el cual las proteínas patológicas ejercen toxicidad en la enfermedad. Los métodos para estudiar estos mecanismos tóxicos son necesarios para comprender los trastornos neurodegenerativos e identificar posibles intervenciones terapéuticas.

Aquí, las neuronas del hipocampo de roedores primarios cultivadas se transfectan conjuntamente con múltiples plásmidos para estudiar los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal rápido utilizando imágenes confocales de células vivas de proteínas de carga marcadas con fluorescencia. Comenzamos con la recolección, disociación y cultivo de neuronas primarias del hipocampo de roedores. A continuación, co-transfectamos las neuronas con construcciones de ADN plasmídico para expresar la proteína de carga marcada con fluorescencia y la tau de tipo salvaje o mutante (utilizada como ejemplo de proteínas patológicas). Los axones se identifican en células vivas utilizando un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de neurofascina, una proteína del segmento inicial del axón, y se obtienen imágenes de una región axonal de interés para medir el transporte de carga fluorescente.

Utilizando KymoAnalyzer, una macro ImageJ disponible gratuitamente, caracterizamos ampliamente la velocidad, la frecuencia de pausa y la densidad de carga direccional del transporte axonal, todo lo cual puede verse afectado por la presencia de proteínas patológicas. A través de este método, identificamos un fenotipo de aumento de la frecuencia de pausa de carga asociado con la expresión de la proteína tau patológica. Además, se pueden agregar construcciones de shRNA silenciadoras de genes a la mezcla de transfección para probar el papel de otras proteínas en la mediación de la interrupción del transporte. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otras proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas y es un método reproducible para estudiar los mecanismos de cómo esas proteínas interrumpen el transporte axonal.

Introducción

Las neuronas dependen del transporte bidireccional de carga a lo largo del axón para mantener las sinapsis funcionales y la conectividad neuronal. Se cree que los déficits de transporte axonal contribuyen de manera crítica a la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras tauopatías, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Huntington ^1,2,3. De hecho, las modificaciones patológicas de varias proteínas relacionadas con la enfermedad afectan negativamente al transporte (revisado en ⁴). El desarrollo de métodos para investigar los mecanismos por los cuales las proteínas patológicas ejercen toxicidad en la enfermedad es necesario para comprender los trastornos neurodegenerativos e identificar posibles objetivos para la intervención terapéutica.

Varias ideas importantes sobre el transporte de axones, incluido el descubrimiento de la kinesina convencional, las vías dependientes de quinasa y fosfatasa que regulan las proteínas motoras, y los mecanismos por los cuales las proteínas patológicas interrumpen la regulación del transporte de axones, se realizaron utilizando el modelo de axoplasma de calamar aislado ^4,5. La perfusión de axoplasma de calamar con formas patológicas de proteína tau inhibe el transporte axonal rápido anterógrado (FAT), un efecto dependiente de la exposición del dominio activador de la fosfatasa de tau, que activa la proteína fosfatasa 1 (PP1)^6,7,8. PP1 activa la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), que a su vez fosforila las cadenas ligeras de quinesina causando la liberación de la carga. Otra proteína patológica en la EA es la β amiloide. Las formas oligoméricas de β amiloide inhiben la grasa bidireccional a través de la caseína quinasa 2, que fosforila las cadenas ligeras de quinesina⁹. Además, la proteína huntingtina patológica que alberga una expansión de poliglutamina y un mutante SOD1 familiar ligado a la ELA interrumpen el transporte axonal en el axoplasma del calamar a través de la quinasa N-terminal c-Jun y la actividad de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, respectivamente^10,11.

Si bien el modelo de axoplasma de calamar sigue siendo una herramienta valiosa para comprender los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal, el acceso limitado al equipo y a las muestras impide que se utilice más ampliamente. Desarrollamos un ensayo de transporte utilizando imágenes de microscopía confocal de células vivas de neuronas primarias de roedores (ratones y ratas). Este modelo representa un enfoque fácilmente adaptable y manipulable basado en neuronas de mamíferos que utiliza fuentes celulares y sistemas de microscopía ampliamente disponibles. Por ejemplo, se expresa una variedad de proteínas patológicas (por ejemplo, que albergan modificaciones relacionadas con la enfermedad) para identificar cómo las modificaciones específicas de estas proteínas afectan el transporte en los axones. De manera similar, se puede usar una variedad de proteínas de carga marcadas con fluorescencia para examinar los cambios específicos de la carga. Además, los mecanismos moleculares subyacentes se estudian con relativa facilidad mediante la expresión dirigida (es decir, knockdown o sobreexpresión) de proteínas seleccionadas que pueden mediar estos efectos. Este método también se adapta fácilmente para neuronas primarias derivadas de una amplia variedad de modelos animales.

Presentamos un protocolo detallado que describe el ensayo de transporte de axones de células vivas que se utilizó previamente en neuronas primarias del hipocampo para demostrar que las proteínas tau mutantes asociadas con las demencias lobares frontotemporales (FTLD; P301L o R5L tau) aumentan la frecuencia de pausa de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia bidireccionalmente¹². Además, la caída de la isoforma PP1γ rescató los efectos de pausa¹². Esto proporciona apoyo para el modelo de disrupción patológica inducida por tau que está mediada por la activación aberrante de una vía de señalización iniciada por PP1 como se describió anteriormente ^6,7,12. En un estudio separado, demostramos que la pseudofosforilación de tau en S199/S202/T205 (el fosfoepítopo patógeno AT8 relevante para las tauopatías) aumentó la frecuencia de pausa de la carga y la velocidad del segmento anterógrado. Estos efectos dependieron del dominio activador de la fosfatasa N-terminal de tau¹³. Estos ejemplos ponen de manifiesto la utilidad de este modelo para identificar los mecanismos de cómo las proteínas patológicas interrumpen el transporte de axones en neuronas de mamíferos.

Este artículo proporciona una descripción detallada del método, comenzando con la recolección, disociación y cultivo de neuronas primarias del hipocampo de ratón, seguido de la transfección de las neuronas con proteínas de carga fusionadas con una proteína fluorescente y, finalmente, el enfoque de imágenes de células vivas y análisis de imágenes. Demostramos cómo se utiliza este método para estudiar los efectos de la tau modificada en el transporte bidireccional de la proteína asociada a la vesícula, la sinaptofisina, por ejemplo. Sin embargo, existe flexibilidad en la proteína patógena y la proteína de carga de transporte de interés, lo que hace que este sea un enfoque versátil para estudiar el transporte axonal.

Protocolo

Estos protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. Este protocolo se ha aplicado con éxito a ratones Tau Knockout en el fondo C57BL/6J y a ratas Sprague Dawley de tipo salvaje. Otras cepas también deberían ser aceptables.

1. Recolección primaria de neuronas del hipocampo

1. Cubra un portaobjetos de 4 pocillos con cámara de fondo de vidrio con 0,5 mg/mL de poli-d-lisina (PDL) filtrada en tampón de borato (12,5 mM de borato de sodio decahidratado y 50 mM de ácido bórico). Añadir 750 μL/pocillo e incubar a temperatura ambiente durante la noche.
2. Lave el portaobjetos de la cámara 4 veces con agua desionizada estéril. Secar al aire después del último lavado y mantener a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (<1 semana).
   NOTA: No permita que el PDL se seque en el portaobjetos antes y entre lavados, ya que esto es tóxico para los cultivos. Descubrimos que el almacenamiento a largo plazo de los portaobjetos recubiertos con PDL puede afectar a la salud neuronal y que el mantenimiento de intervalos constantes entre el recubrimiento y el recubrimiento reduce la variabilidad entre corridas en la viabilidad del cultivo.
3. Consigue un ratón o rata con embarazo cronometrado.
   NOTA: Los animales con gestación programada se pueden pedir a varias empresas o criar internamente. El día cero embrionario se refiere al día en que se encuentra el tapón vaginal, y hemos tenido éxito cultivando neuronas primarias del hipocampo y corticales de ratón E16-18 con este enfoque. Las neuronas de rata también se cosechan en el día embrionario 18.
4. En E18, eutanasiar a la hembra embarazada mediante un método aprobado. Corta a través de la pared abdominal y retira los dos cuernos uterinos. Transfiéralos a una placa de Petri que contenga solución salina helada al 0,9%. Enjuague hasta que la solución salina esté limpia.
   NOTA: Administramos una sobredosis de pentobarbital sódico (al menos 100 mg/kg) por inyección intraperitoneal.
5. Decapita a los cachorros. Comenzando en el foramen magnum (la abertura en la parte posterior del cráneo), use tijeras de microdisección para cortar la piel y el cráneo a lo largo de la línea media, inclinando la punta inferior de las tijeras contra la parte interna del cráneo para evitar daños en el tejido cerebral.
6. Retire la piel suprayacente y retire con cuidado el cráneo para exponer el cerebro.
7. Use fórceps para sostener el área de la boca y la nariz y gire el cráneo de modo que el cerebro quede hacia abajo sobre una placa de Petri llena de solución salina al 0,9 %. Saca el cerebro del cráneo y corta los nervios y el tronco encefálico para liberar el cerebro en la solución salina.
8. Coloque la placa de Petri bajo un microscopio de disección para la disección del hipocampo. Inserte las tijeras en la línea media del cerebro, incline las tijeras de modo que la hoja superior empuje uno de los hemisferios cerebrales hacia afuera y corte para separar el hemisferio de las regiones subcorticales.
9. Haz un corte vertical a través de la corteza de modo que la corteza frontal sea anterior y el hipocampo sea posterior al sitio de la corte. Inserte la punta inferior de las tijeras en el orificio resultante y corte con cuidado a lo largo del ápice de la corteza, deteniéndose en el extremo posterior.
10. Con las pinzas, balancee con cuidado la corteza y termine el corte posterior. El hipocampo debe tener la forma de una media luna. Recorta con cuidado la corteza restante para que el hipocampo mantenga su forma redondeada de media luna.
11. Con fórceps y tijeras, retire suavemente las meninges del hipocampo.
    NOTA: Es importante extirpar todas las meninges del cerebro para reducir el número de células no neuronales que se recogen y evitar dañar o desgarrar el tejido del hipocampo.
12. Corta el hipocampo en cuatro pedazos iguales y coloca el tejido en un tubo cónico de 15 mL lleno de tampón frío sin calcio y magnesio (CMF; PBS de Dulbecco con 0,1% de glucosa, 2,5 μg/mL de anfotericina B y 50 μg/mL de gentamicina).
    NOTA: Para obtener los mejores resultados, recoja los hipocampos de 5 a 10 cachorros por disociación. Cada hipocampo debe proporcionar aproximadamente 300.000 células para ratones y 500.000 células para ratas.

2. Disociación y colocación de las neuronas primarias del hipocampo

1. Retire el CMF con una pipeta Pasteur y enjuague el pañuelo con CMF 4x fresco y frío, girando suavemente entre enjuagues.
2. Retire la CMF y agregue 3 mL de solución de tripsina filtrada al 0,125% (tripsina diluida al 2,5% en CMF precalentada [37 °C]). Incubar el tejido durante exactamente 15 minutos a 37 °C; Revuelva suavemente cada 5 minutos.
   NOTA: Prepare la solución de tripsina inmediatamente antes de usarla.
3. Prepare 5 mL de solución de inactivación de tripsina (TIS; Solución salina equilibrada de Hanks, 20% de suero para terneros recién nacidos y 1x solución de DNasa I [10x stock: 5 mM de acetato de sodio, 1 μM de cloruro de calcio, 0,5 mg/mL de DNasa I]).
4. Retire la solución de tripsina y lave 2 veces con CMF frío. Añadir 3 mL de TIS frío.
5. Disociar las células mediante la trituración con una jeringa de 3 mL con agujas de diámetro progresivamente más pequeño: triturar 30x con una aguja de 14 G, 30x con una aguja de 15 G, 20x con una aguja de 16 G, 20x con una aguja de 18 G y 15x con una aguja de 21 G. Utilice extracciones de 2 s con las primeras cuatro agujas y 3 tiradas con la aguja de 21 g.
   NOTA: También se pueden utilizar otros métodos de trituración (por ejemplo, pipetas de vidrio pulidas al fuego^14,15). Descubrimos que el uso de las agujas de jeringa metálicas estandarizadas reduce sustancialmente la variabilidad en la aglomeración y viabilidad de las células.
6. Con la aguja de 21 G, coloque una gota de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio y verifique si hay grumos de células. Si se observan varios grumos, triture tres veces más a través de una aguja de 22 G y vuelva a verificar. Repita este proceso hasta obtener una suspensión unicelular homogénea, teniendo cuidado de triturar suavemente durante todo el proceso.
7. Filtre 5 mL de suero fetal bovino (FBS) utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm. Coloque suavemente la suspensión celular en el FBS en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células (200 × g a 4 °C) durante 5 min.
8. Retire la mayor cantidad posible de FBS sin alterar el pellet. Vuelva a suspender en 1 mL de medio neurobasal (NBM) tibio (37 °C) libre de antibióticos; suplementado con 1x sustituto de glutamina y 1x B-27).
9. Diluir la suspensión celular en azul de tripán (0,4%) y obtener un recuento de células.
   NOTA: Una dilución 1:1 funciona bien para un contador automático de células y use una dilución 1:60 para el conteo manual con un hemacitómetro. Para continuar con la formación de células, la viabilidad de las neuronas debe ser superior al 90% en este punto. Esto aumenta significativamente la probabilidad de un cultivo de neuronas saludable después de la disociación.
10. Coloque las células a una densidad de 175.000 células/pocillo (70.000 células^/mm2) en un portaobjetos de cuatro pocillos precalentado recubierto de PDL en 750 μL de NBM libre de antibióticos. Además, platice 200.000 células/pocillo en cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos recubierta de PDL en 1,5 mL de NBM libre de antibióticos para su uso como medio acondicionado en la transfección descrita en la sección 3. Incubar las células en una cámara de humedad controlada, a 37 °C y 5% de CO₂ .
    NOTA: La densidad de las celdas se puede ajustar en función de los resultados. Las densidades altas pueden dificultar la obtención de imágenes de las neuronas, mientras que las densidades bajas pueden afectar negativamente la salud del cultivo y la supervivencia de las neuronas. En nuestra experiencia, las neuronas de rata se pueden colocar a una densidad más baja en comparación con las neuronas de ratón.

3. Transfección de neuronas

NOTA: Las neuronas se pueden transfectar en DIV 7 o DIV 8 sin cambios notables en la eficiencia de la transfección o en los resultados de transporte. Estos volúmenes corresponden a cuatro pocillos de un portaobjetos de cámara con fondo de vidrio de cuatro pocillos con un volumen de 750 μL/pocillo. Este protocolo describe la transfección mediante reactivos de transfección de lípidos. Permita que los medios y los reactivos de transfección se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.

1. Prepare el reactivo madre de transfección añadiendo 4,4 μL de reactivo de transfección a 127,6 μL de medio sérico reducido. Agite suavemente con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Preparar las reservas de ADN durante la incubación de la transfección de lípidos. Añadir 200 ng de ADN de carga fluorescente (pFIN mApple-sinaptofisina; 12.112 pares de bases) y 200 ng de ADN para expresar la proteína de interés (los plásmidos tau utilizados fueron construcciones pCMV tau-Flag; 5.036 pares de bases) en medio sérico reducido o sin suero hasta un volumen final de 32 μL¹². Añadir 0,8 μL de reactivo potenciador de la transfección (2 μL por μg de ADN). Mezclar bien a mano.
   NOTA: Encontramos que un derivado de RFP funciona mejor (mApple o mCherry), pero también se puede usar GFP. Además, se puede incluir una construcción de ADN para expresar un ARN de horquilla pequeña silenciadora de genes (shRNA) para probar los mecanismos de los fenotipos observados con la expresión de la proteína de interés. Para hacer esto, incluya 150 ng de cada una de las tres construcciones de ADN en la mezcla de ADN y ajuste la cantidad de reactivo potenciador de la transfección en consecuencia. El cambio de los parámetros del reactivo de ADN o lipofección puede afectar la eficiencia de la transfección y se puede ajustar en función de la necesidad de transfecciones más o menos eficientes.
3. Agregue 32 μL de mezcla de transfección de lípidos a cada tubo de ADN. Balancee suavemente con la mano para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Añada lentamente 64 μL de mezcla de ADN/reactivo de transfección a las células colocando la punta de la pipeta justo debajo de la superficie del medio y moviéndola en forma de serpentina por todo el pocillo. Balancee suavemente el portaobjetos de la cámara con la mano 3 veces después de agregarlo a todos los pocillos para mezclar más y coloque el portaobjetos de la cámara en la incubadora. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 2 h.
   NOTA: Minimice la cantidad de tiempo que las neuronas están fuera de la incubadora, ya que son muy sensibles a los cambios de temperatura y pH, que pueden ocurrir rápidamente.
5. Realizar un medio cambio de medio 2 h después de la transfección con medio condicionado + anticuerpo Neurofascin. Inmediatamente antes del cambio de medio, agrupe 1,5 mL de NBM condicionado y libre de antibióticos de las células cultivadas en la placa de 24 pocillos. Añadir 0,75 μL de anticuerpo Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) al medio condicionado.
   NOTA: El anticuerpo NF-186 detecta un dominio extracelular de neurofascina que está enriquecido en el segmento inicial del axón (AIS) para identificar definitivamente el axón para la obtención de imágenes.
6. Realizar un cambio completo del medio 18 h después de la transfección con medio condicionado que contenga el anticuerpo secundario. Agregue 1 μL de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con AlexaFluor 647 a 3 mL de NBM condicionado (libre de antibióticos) combinado de la placa de 24 pocillos. Mezclar bien.

4. Imágenes neuronales

1. Prepárese para la toma de imágenes 2 días después de la transfección. Caliente el accesorio de la cámara de células vivas para el microscopio confocal a 37 °C (incluido el objetivo de 60x y el aceite de la lente) y equilibre la cámara al 5% de CO₂.
2. Utilice un objetivo de gran aumento y una cámara de células vivas para obtener imágenes de las células.
   NOTA: Utilizamos un objetivo de 60x 1,40 NA en un microscopio confocal de barrido láser, pero también se pueden utilizar otros sistemas de microscopía de fluorescencia confocal (por ejemplo, disco giratorio) o de campo amplio si son capaces de alcanzar altas velocidades de fotogramas de imagen.
3. Identifique visualmente las neuronas transfectadas en el canal que contiene la proteína de carga utilizando los oculares. A continuación, tome una imagen de las neuronas para identificar el AIS en el canal Cy5 (Figura 1).
4. Establezca el campo de visión en un cuadro rectangular de 32 píxeles por 128 píxeles y muévalo para obtener una imagen de una región del axón ~ 50-150 μm distal al AIS. Anote y registre la direccionalidad del transporte de carga y la orientación del ROI. Los puntos del cuadro aparecerán en la parte superior y derecha, respectivamente, de las imágenes y vídeos posteriores. Registre qué lado de la imagen está más cerca del cuerpo de la célula y cuál está más cerca del extremo del axón para que la polilínea del cimograma en el paso 5.1 se pueda dibujar con la orientación correcta.
   NOTA: Al seleccionar la región de interés, el área de imagen de un axón aislado debe ser relativamente recta e intersectar el campo de visión en cada extremo. Todo el segmento debe estar dentro del mismo plano focal. El área debe mostrar claramente el transporte activo de carga. Las neuronas excesivamente brillantes suelen expresar la proteína de carga y las proteínas de interés a niveles que probablemente sean tóxicos para la neurona y que deben evitarse.
5. Establece la potencia del láser 561 en 1,40, el agujero de alfiler en 7,8, el Tamaño en 128 px² y la Velocidad en 32 fotogramas/s. Ajuste la ganancia para visualizar el transporte de vesículas de carga individuales sin que se vea oscurecido por la señal de fondo (normalmente entre 10 y 50 da como resultado kymographs de alta calidad).
   NOTA: La potencia láser extremadamente baja se puede lograr gracias a los detectores de GaAsP altamente sensibles y evita posibles efectos fototóxicos y fotoblanqueo de la carga en movimiento. El tamaño del orificio se establece lo más ancho posible para aumentar la profundidad focal y garantizar que se obtenga una imagen de todo el retorno de la inversión, ya que es posible que el axón no quede perfectamente plano en la superficie del portaobjetos.
6. Establezca el ROI seleccionando Dibujar ROI rectangular... en el menú desplegable ROI . Dibuja el ROI para que cubra todo el campo de visión. Haga clic con el botón derecho del ratón en el ROI y seleccione Usar como estímulo ROI: S1.
7. Prepare la configuración de ND incluyendo los siguientes pasos en la pestaña Configuración de ND.
   NOTA: Este es el protocolo de adquisición de cinco pasos que se configura una vez y luego será realizado por el software cada vez que se recopilen las películas.
   1. Adquirir imagen para recoger la imagen de referencia de la preestimulación.
   2. Estimulación; Retorno de la inversión: S1; Intervalo: NoDelay; Duración 1,64 s, bucles: 7. Este paso blanquea la fluorescencia de fondo con varios pulsos del láser.
   3. Adquirir imagen. En este paso se recopila una imagen de referencia posterior a la estimulación.
   4. Esperando; Sin acción; 2 min. Este paso proporciona un período de recuperación para que la carga fluorescente vuelva a poblar el ROI blanqueado.
   5. Adquisición; Intervalo: NoDelay; Duración 5 min, Bucles: 8,615. Este paso recopila imágenes a la velocidad máxima durante el período de imágenes de 5 minutos.
8. Una vez configurado el protocolo de configuración de ND, haga clic en el botón Aplicar configuración de estimulación en la pestaña Configuración de ND . Haga clic en Ejecutar ahora cuando esté listo para visualizar el transporte de carga. Esto iniciará el protocolo de adquisición de ND desde el paso 4.7.
   NOTA: Aunque la velocidad de fotogramas está configurada en 32 fotogramas/s, la velocidad de fotogramas práctica puede ser más lenta (~28,7 fotogramas/s). Este valor debe registrarse para un análisis preciso del quimógrafo en la sección 5. Idealmente, las imágenes de transporte de células vivas se realizan con la velocidad de fotogramas más rápida posible (por ejemplo, >25 fotogramas por segundo) para descifrar mejor los movimientos de la carga.
9. Restablezca el campo de visión a toda la imagen; luego, recopile y guarde una imagen de la neurona completa en los canales 561 y 647 con la caja ROI incluida. Registre las coordenadas XY donde se tomó la imagen para la confirmación de la posfijación de la expresión de la proteína de interés.
10. Recopile videos de transporte de al menos dos neuronas para su análisis. Asegúrese de que cada réplica independiente provenga de las medias de las variables medidas a partir de una cosecha de neuronas primarias individuales (es decir, no de neuronas individuales).
    NOTA: Para una cosecha de neuronas primarias dada, recolectamos videos de 2 a 4 neuronas por condición.
11. Fije las células retirando el medio e incubando con paraformaldehído precalentado al 4% durante 20 min a temperatura ambiente. Retire el tampón y lave las celdas durante 3 x 5 minutos cada una en TBS.
    NOTA: Para la fijación de paraformaldehído, utilizamos tampón de citoesqueleto, un tampón común que mantiene la estructura del citoesqueleto (10 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ y 4 mM EGTA, pH 6,1). También se pueden utilizar otros tampones (por ejemplo, TBS, PBS) para la fijación.
12. Confirmar que las neuronas analizadas expresan tanto la proteína de interés como la proteína de carga marcada con fluorescencia mediante tinción de inmunocitofluorescencia. Tinción para tau humana (Tau12) para confirmar la expresión exógena de tau y tubulina β-III (Tuj1) para verificar que las neuronas se mantuvieron sanas durante todo el proceso de imagen.
    NOTA: Observamos la coexpresión de ambas construcciones de ADN en casi todas las células transfectadas utilizando estos métodos.

5. Generar y analizar kymographs

NOTA: Los zimógrafos se pueden generar y analizar utilizando una variedad de programas diferentes. Describimos brevemente el software gratuito KymoAnalyzer (v. 1.01) utilizando seis complementos ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. Estos plugins se pueden descargar de los desarrolladores en el sitio web de Encalada lab (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Puede encontrar instrucciones más detalladas sobre el uso de este software en este sitio.

1. Agrupe las películas generadas en el paso 4.9 en función de las condiciones experimentales y repítelas. Ejecute la macro BatchKymographGeneration y seleccione la carpeta adecuada. Dibuja una polilínea de cimograma para trazar el axón comenzando con el extremo proximal en esa imagen en particular. Los kymographs resultantes se almacenan en la carpeta seleccionada (Figura 2).
2. Asigne pistas manualmente ejecutando la macro Pistas, seleccionando una carpeta de película individual, seleccionando Sí para agregar una pista y, a continuación, haciendo clic para realizar un seguimiento de la trayectoria de cada partícula. Realice el clic inicial en la parte superior de la pista y vuelva a hacer clic en cada punto en que la partícula cambie de velocidad o dirección para que la polilínea se superponga a la traza de la partícula en el quimógrafo. Una vez colocada la polilínea sobre toda la pista, haga clic en Aceptar. Repita hasta que se asignen todas las pistas.
3. Ejecute las macros restantes, asignando la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel en función de los parámetros de imagen. En primer lugar, ejecute CargoPopulation, luego NetCargoPopulation y, a continuación, Segments. Introduzca el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas de los vídeos cuando se le solicite (0,22 μm y 28,7 fotogramas/s, respectivamente, con estos ajustes). Por último, ejecute la macro poolData para calcular y agrupar los datos de los parámetros de transporte de todos los kymographs de la carpeta seleccionada.
4. Grafique los resultados de los archivos de datos y compare las diversas condiciones con las réplicas independientes representadas por los valores medios de todas las neuronas analizadas dentro de una condición experimental para una cosecha de neuronas individuales.

Resultados

Utilizando estos métodos, caracterizamos el transporte axonal en presencia de formas de proteína tau de tipo salvaje o relacionadas con la enfermedad para examinar los posibles mecanismos de la neurotoxicidad patológica inducida por tau en la enfermedad^12,13. El software KymoAnalyzer calcula y agrupa una variedad de parámetros diferentes de todos los kymographs dentro de una carpeta determinada. Las tarifas de transporte se c...

Discusión

Cada vez hay más pruebas de que múltiples proteínas patológicas asociadas a una variedad de trastornos neurodegenerativos interrumpen el transporte axonal rápido en las neuronas. Esto representa un posible mecanismo común de neurotoxicidad en estas enfermedades. Para comprender mejor el proceso por el cual estas proteínas interrumpen el transporte, necesitamos herramientas y modelos que nos permitan abordar preguntas específicas. El método descrito aquí permite examinar los mec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427