Использование визуализации живых клеток для измерения влияния патологических белков на аксональный транспорт в первичных нейронах гиппокампа

Резюме

В этой статье мы демонстрируем, как сочетать трансфекцию первичных нейронов гиппокампа грызунов с конфокальной визуализацией живых клеток для анализа патологических белковых эффектов на аксональный транспорт и выявления механистических путей, опосредующих эти эффекты.

Аннотация

Двунаправленная транспортировка грузов по аксону имеет решающее значение для поддержания функциональных синапсов, нейронных связей и здоровых нейронов. При множественных нейродегенеративных заболеваниях аксональный транспорт нарушается, и проекционные нейроны особенно уязвимы из-за необходимости транспортировки клеточных материалов на большие расстояния и поддержания значительной аксональной массы. Патологические модификации нескольких белков, связанных с заболеванием, негативно влияют на транспорт, включая тау, амилоид-β, α-синуклеин, супероксиддисмутазу и хантингтин, обеспечивая потенциальный общий механизм, с помощью которого патологические белки оказывают токсичность при заболевании. Методы изучения этих токсических механизмов необходимы для понимания нейродегенеративных расстройств и определения потенциальных терапевтических вмешательств.

Здесь культивируемые первичные нейроны гиппокампа грызунов котрансфицируются с несколькими плазмидами для изучения влияния патологических белков на быстрый аксональный транспорт с использованием конфокальной визуализации живых клеток флуоресцентно меченных грузовых белков. Мы начнем с сбора, диссоциации и культивирования первичных нейронов гиппокампа у грызунов. Затем мы совместно трансфицируем нейроны с плазмидными конструкциями ДНК для экспрессии флуоресцентно меченного грузового белка и дикого типа или мутантного тау (используемого в качестве образца патологических белков). Аксоны идентифицируются в живых клетках с помощью антитела, которое связывается с внеклеточным доменом нейрофасцина, белком начального сегмента аксона, и визуализируется интересующая область аксона для измерения флуоресцентного транспорта груза.

Используя KymoAnalyzer, свободно доступный макрос ImageJ, мы подробно охарактеризовали скорость, частоту пауз и направленную плотность груза аксонального транспорта, на которые может влиять присутствие патологических белков. С помощью этого метода мы идентифицируем фенотип повышенной частоты паузы в грузе, связанный с экспрессией патологического тау-белка. Кроме того, в трансфекционную смесь могут быть добавлены конструкции shRNA, подавляющие подавление генов, чтобы проверить роль других белков в опосредовании нарушения транспорта. Этот протокол легко адаптируется для использования с другими белками, связанными с нейродегенеративными заболеваниями, и является воспроизводимым методом изучения механизмов того, как эти белки нарушают аксональный транспорт.

Введение

Нейроны зависят от двунаправленного транспорта груза вдоль аксона для поддержания функциональных синапсов и нейронных связей. Считается, что дефицит аксонального транспорта является важнейшим фактором патогенеза нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и другие таупатии, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона ^1,2,3. Действительно, патологические модификации нескольких белков, связанных с заболеванием, негативно влияют на транспорт (рассмотрено в ^{пункте 4<....}

протокол

Эти протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Мичиганского государственного университета. Этот протокол был успешно применен к мышам Tau Knockout в фоновом диапазоне C57BL/6J и крысам дикого типа Sprague Dawley. Другие штаммы также должны быть приемлемыми.

1. Забор первичных нейронов гиппокампа

1. Покройте предметное стекло 4-луночной нижней камеры фильтрованным 0,5 мг/мл поли-d-лизином (PDL) в боратном буфере (12,5 мМ декагидрата бората натрия и 50 мМ борной кислоты). Добавьте 750 μл/лунку и инкубируйте при комнатной температуре в ....

Результаты

Используя эти методы, мы охарактеризовали аксональный транспорт в присутствии дикого типа или связанных с заболеванием форм тау-белка для изучения потенциальных механизмов патологической нейротоксичности, вызванной тау-индуцированием при^{заболевании 12,13<.......}

Обсуждение

Появляется все больше доказательств того, что множественные патологические белки, связанные с различными нейродегенеративными расстройствами, нарушают быстрый аксональный транспорт в нейронах. Это представляет собой потенциальный общий механизм нейротоксичности.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427