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기사 소개

요약

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

초록

축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 것은 기능적 시냅스, 신경 연결성 및 건강한 뉴런을 유지하는 데 중요합니다. 축삭 수송은 여러 신경 퇴행성 질환에서 방해를 받으며, 투영 뉴런은 세포 물질을 장거리로 운반하고 상당한 축삭 질량을 유지해야 하기 때문에 특히 취약합니다. 타우(tau), 아밀로이드-β, α-시누클레인(-synuclein), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase) 및 헌팅틴(huntingtin)을 포함한 여러 질병 관련 단백질의 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미치며, 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 잠재적인 공통 메커니즘을 제공합니다. 이러한 독성 메커니즘을 연구하는 방법은 신경 퇴행성 질환을 이해하고 잠재적인 치료 개입을 식별하는 데 필요합니다.

여기에서 배양된 1차 설치류 해마 뉴런을 여러 플라스미드와 함께 transfection하여 형광 태그가 부착된 화물 단백질의 생세포 공초점 이미징을 사용하여 병리학적 단백질이 빠른 축삭 수송에 미치는 영향을 연구합니다. 우리는 설치류에서 주요 해마 뉴런의 수확, 해리 및 배양으로 시작합니다. 그런 다음 뉴런을 플라스미드 DNA 구조와 함께 transfection하여 형광 태그가 지정된 화물 단백질과 야생형 또는 돌연변이 타우(병리학적 단백질의 예시로 사용됨)를 발현합니다. 축삭돌기는 축삭돌기 초기 분절 단백질인 neurofascin의 세포외 도메인과 결합하는 항체를 사용하여 살아있는 세포에서 식별되며, 축삭 관심 영역을 이미지화하여 형광 화물 수송을 측정합니다.

무료로 사용할 수 있는 ImageJ 매크로인 KymoAnalyzer를 사용하여 병리학적 단백질의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 축삭 이동의 속도, 일시 중지 빈도 및 방향성 화물 밀도를 광범위하게 특성화합니다. 이 방법을 통해 병리학적 타우 단백질의 발현과 관련된 화물 일시 중지 빈도 증가의 표현형을 식별합니다. 또한 유전자 침묵 shRNA 구조를 transfection mix에 추가하여 수송 중단을 매개하는 다른 단백질의 역할을 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 신경퇴행성 질환 관련 단백질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적용할 수 있으며 이러한 단백질이 축삭 수송을 방해하는 메커니즘을 연구하는 재현 가능한 방법입니다.

서문

뉴런은 기능적 시냅스와 신경 연결성을 유지하기 위해 축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 데 의존합니다. 축삭 수송 결핍은 알츠하이머병(AD) 및 기타 타우병증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및 헌팅턴병을 포함한 여러 신경퇴행성 질환의 발병에 중요한 기여를 하는 것으로 생각됩니다 1,2,3. 실제로, 여러 질병 관련 단백질에 대한 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미친다(4에서 검토). 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 메커니즘을 조사하는 방법을 개발하는 것은 신경퇴행성 질환을 이해하고 치료적 개입을 위한 잠재적 표적을 식별하는 데 필요합니다.

기존의 키네신(kinesin), 운동 단백질을 조절하는 키나아제(kinase) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 의존 경로, 병리학적 단백질이 축삭 이동의 조절을 방해하는 메커니즘의 발견을 포함하여 축삭 수송에 대한 몇 가지 중요한 통찰력은 분리된 오징어 축삭질 모델 4,5를 사용하여 이루어졌습니다. 병리학적 형태의 타우 단백질과 오징어 액소플라즘의 관류는 단백질 인산가수분해효소 1(PP1)6,7,8을 활성화하는 타우의 인산가수분해효소 활성화 도메인의 노출에 의존하는 효과인 전행성 고속 축삭 수송(FAT)을 억제합니다. PP1은 글리코겐 합성효소 키나아제 3(GSK3)를 활성화하여 키네신 경쇄를 인산화하여 화물을 방출합니다. 알츠하이머병의 또 다른 병리학적 단백질은 아밀로이드 β입니다. 올리고머 형태의 아밀로이드-β은 카제인 키나아제 2를 통해 양방향 지방을 억제하며, 이는 키네신 경쇄를 인산화합니다9. 또한, 폴리글루타민 확장을 품고 있는 병리학적 헌팅틴 단백질과 가족성 ALS 연관 SOD1 돌연변이는 각각 c-Jun N-말단 키나아제 및 p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제 활성을 통해 오징어 액소플라즘에서 축삭 수송을 방해합니다(각각10,11).

오징어 축삭질 모델은 병리학적 단백질이 축삭 수송에 미치는 영향을 이해하는 데 유용한 도구로 계속 사용되고 있지만, 장비 및 표본에 대한 접근이 제한되어 있어 더 널리 사용되는 데 방해가 됩니다. 우리는 설치류(생쥐 및 쥐) 1차 뉴런의 생세포 공초점 현미경 이미징을 사용하여 수송 분석을 개발했습니다. 이 모델은 널리 사용 가능한 세포 소스와 현미경 시스템을 사용하여 쉽게 적응하고 조작할 수 있는 포유류 뉴런 기반 접근 방식을 나타냅니다. 예를 들어, 다양한 병리학적 단백질(예: 질병 관련 변형을 품고 있음)이 발현되어 이러한 단백질의 특정 변형이 축삭돌기의 수송에 어떻게 영향을 미치는지 식별합니다. 마찬가지로, 다양한 형광 표지 화물 단백질을 사용하여 화물 특이적 변화를 검사할 수 있습니다. 또한, 근본적인 분자 메커니즘은 이러한 효과를 매개할 수 있는 선택된 단백질의 발현(즉, knockdown 또는 과발현)을 표적화하여 비교적 쉽게 연구할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다양한 동물 모델에서 유래한 일차 뉴런에 쉽게 적용할 수 있습니다.

우리는 돌연변이 타우 단백질이 전두측두엽 엽 치매(FTLD; P301L 또는 R5L tau)는 형광 표지된 화물 단백질의 일시 중지 빈도를 양방향으로 증가시킵니다12. 또한, PP1γ 동형의 녹다운은 일시 중지 효과12를 구제했습니다. 이는위에서 설명한 바와 같이 PP1에 의해 시작된 신호전달 경로의 비정상적인 활성화를 통해 매개되는 병리학적 타우-유발 붕괴 모델에 대한 지지를 제공한다 6,7,12. 별도의 연구에서는 S199/S202/T205(타우병증과 관련된 병원성 AT8 인산회의사)에서 타우의 가성인인산화(pseudophosphorylation)가 화물 정지 빈도와 전방 세그먼트 속도를 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 이러한 효과는 타우13의 N-말단 인산가수분해효소 활성화 도메인에 의존하였다. 이러한 예는 병리학적 단백질이 포유류 뉴런에서 축삭 수송을 방해하는 메커니즘을 식별하기 위한 이 모델의 유용성을 강조합니다.

이 논문은 1차 마우스 해마 뉴런의 수확, 해리 및 배양으로 시작하여 형광 단백질과 융합된 화물 단백질로 뉴런을 transfection, 마지막으로 살아있는 세포 이미징 및 이미지 분석 접근 방식에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 예를 들어 이 방법을 사용하여 소포 관련 단백질인 synaptophysin의 양방향 수송에 대한 변형된 타우의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다. 그러나 관심 있는 병원성 단백질과 수송 화물 단백질에는 유연성이 있어 축삭 수송을 연구하는 데 다재다능한 접근 방식입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 배경의 Tau Knockout 마우스와 야생형 Sprague Dawley 마우스에 성공적으로 적용되었습니다. 다른 균주도 허용되어야 합니다.

1. 1차 해마 뉴런 수확

  1. 붕산염 완충액(12.5mM 붕산나트륨 데카하이드레이트 및 50mM 붕산)에 여과된 0.5mg/mL 폴리-d-라이신(PDL)으로 4웰 유리 하단 챔버 슬라이드를 코팅합니다. 750 μL/웰을 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 챔버 슬라이드를 멸균 탈이온수로 4번 세척합니다. 마지막 세탁 후 자연 건조하고 단기 보관(<1주)을 위해 4°C에서 보관하십시오.
    알림: PDL은 배양에 유독하므로 세척 전과 세척 사이에 슬라이드에서 건조되지 않도록 하십시오. PDL 코팅 슬라이드를 장기간 보관하면 신경 건강에 영향을 미칠 수 있으며, 코팅과 도금 사이의 간격을 일정하게 유지하면 배양 생존율의 실행 간 변동성이 줄어든다는 사실을 발견했습니다.
  3. 임신 한 시간 동안 임신 한 쥐 또는 쥐를 얻으십시오.
    참고: 임신 동물은 다양한 회사에서 주문하거나 사내에서 사육할 수 있습니다. 배아 0일차는 질 마개가 발견된 날을 의미하며, 우리는 이 접근법을 사용하여 E16-18 마우스의 주요 해마 및 피질 뉴런을 배양하는 데 성공했습니다. 쥐 뉴런은 또한 배아 18일째에 수확됩니다.
  4. E18에 승인된 방법으로 임신한 암컷을 안락사시킵니다. 복벽을 절개하고 두 개의 자궁 뿔을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.9% 식염수가 포함된 페트리 접시에 옮깁니다. 식염수가 깨끗해질 때까지 헹굽니다.
    참고: 당사는 복강 내 주사를 통해 펜토바르비탈 나트륨(최소 100mg/kg)을 과다 투여합니다.
  5. 새끼의 목을 베십시오. 유공(foramen magnum, 두개골 뒤쪽의 구멍)에서 시작하여 미세해부 가위를 사용하여 정중선을 따라 피부와 두개골을 자르고 가위의 아래쪽 끝을 두개골 내부 부분에 대고 위로 비스듬히 올려 뇌 조직의 손상을 방지합니다.
  6. 위에 있는 피부를 제거하고 두개골을 조심스럽게 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
  7. 집게를 사용하여 입/코 부위를 잡고 두개골을 돌려 0.9% 식염수로 채워진 페트리 접시 위로 뇌가 아래를 향하도록 합니다. 두개골에서 뇌를 빼내고 신경과 뇌간을 잘라 뇌를 식염수로 방출합니다.
  8. 해마를 해부하기 위해 Petri 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 뇌의 정중선에 가위를 삽입하고, 위쪽 칼날이 대뇌 반구 중 하나를 바깥쪽으로 밀어내도록 가위의 각도를 조정한 다음, 반구를 피질하 영역에서 분리하도록 자릅니다.
  9. 전두엽 피질이 절단 부위의 앞쪽에 있고 해마가 절단 부위의 뒤쪽에 있도록 피질을 수직으로 절단합니다. 가위의 아래쪽 끝을 결과 구멍에 삽입하고 뒤쪽 끝에서 멈추는 피질의 정점을 따라 조심스럽게 자릅니다.
  10. 집게를 사용하여 피질을 조심스럽게 휘두르고 후방 절단을 마무리합니다. 해마는 초승달 모양과 비슷해야 합니다. 해마가 둥글고 초승달 모양을 유지할 수 있도록 남아 있는 피질을 조심스럽게 다듬습니다.
  11. 집게와 가위를 사용하여 해마에서 수막을 부드럽게 제거합니다.
    참고: 해마 조직을 손상시키거나 찢는 것을 자제하면서 수집되는 비신경 세포의 수를 줄이기 위해 뇌에서 모든 수막을 제거하는 것이 중요합니다.
  12. 해마를 4등분으로 자르고 조직을 얼음처럼 차가운 칼슘 및 마그네슘이 없는 완충액(CMF; 0.1% 포도당, 2.5μg/mL 암포테리신 B 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 Dulbecco의 PBS).
    알림: 최상의 결과를 얻으려면 해리당 5-10마리의 새끼로부터 해마를 수집하십시오. 각 해마는 생쥐의 경우 약 300,000개의 세포를, 쥐의 경우 약 500,000개의 세포를 제공해야 합니다.

2. 1차 해마 뉴런 해리 및 도금

  1. 파스퇴르 피펫으로 CMF를 제거하고 헹굼 사이에 부드럽게 휘젓는 신선한 차가운 CMF 4x로 조직을 헹굽니다.
  2. CMF를 제거하고 여과된 0.125% 트립신 용액 3mL를 추가합니다(예열된[37°C] CMF에 2.5% 트립신 희석). 37 °C에서 정확히 15 분 동안 조직을 배양합니다. 5분마다 부드럽게 휘젓습니다.
    알림: 사용 직전에 트립신 용액을 만드십시오.
  3. 5mL의 트립신 불활성화 용액(TIS; Hanks의 균형 잡힌 소금 용액, 20% 신생아 송아지 혈청 및 1x DNase I 용액[10x 재고: 5mM 아세트산 나트륨, 1μM 염화칼슘, 0.5mg/mL DNase I]).
  4. 트립신 용액을 제거하고 차가운 CMF로 2회 세척합니다. 차가운 TIS 3mL를 추가합니다.
  5. 직경이 점점 작아지는 3mL 주사기를 사용하여 삼쇄를 통해 세포를 해리합니다: 14G 바늘을 사용하여 30배, 15G 바늘을 사용하여 30배, 16G 바늘을 사용하여 20배, 18G 바늘을 사용하여 20배, 21G 바늘을 사용하여 15배를 트리투레이트합니다. 처음 4개의 바늘로 2초 드로우를 사용하고 21G 바늘로 3초 드로우를 사용합니다.
    참고: 다른 분쇄 방법(예: 내화 연마된 유리 피펫14,15)도 사용할 수 있습니다. 표준화된 금속 주사기 바늘을 사용하면 세포 응집과 생존율의 변동성이 크게 줄어든다는 것을 발견했습니다.
  6. 21G 바늘을 사용하여 세포 현탁액의 물방울을 현미경 슬라이드에 놓고 세포 덩어리가 있는지 확인합니다. 여러 덩어리가 관찰되면 22G 바늘을 통해 세 번 더 삼중 추출하고 다시 확인하십시오. 균질한 단세포 현탁액이 얻어질 때까지 이 과정을 반복하고 과정 전반에 걸쳐 부드럽게 삼각 작용하도록 주의하십시오.
  7. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 소 태아 혈청(FBS) 5mL를 여과합니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브의 FBS에 부드럽게 층을 만듭니다. 세포를 5분 동안 원심분리합니다(4°C에서 200× g ).
  8. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 FBS를 제거하십시오. 1mL의 따뜻한(37°C) 무항생제 신경기저 배지(NBM, 1x 글루타민 대체물 및 1x B-27 보충)에 재현탁합니다.
  9. 세포 현탁액을 트리판 블루(0.4%)로 희석하고 세포 수를 얻습니다.
    참고: 1:1 희석은 자동 세포 계수기에 적합하며 혈구계를 사용한 수동 계수에는 1:60 희석을 사용합니다. 세포 도금을 계속하려면 이 시점에서 뉴런 생존율이 90% 이상이어야 합니다. 이는 해리 후 건강한 뉴런 배양의 가능성을 크게 향상시킵니다.
  10. 750 μL의 무항생제 NBM에서 사전 따뜻해진 PDL 코팅된 4웰 챔버 슬라이드에서 175,000 cells/well(70,000 cells/mm2)의 밀도로 세포를 플레이트합니다. 또한 섹션 3에 설명된 transfection에서 컨디셔닝 배지로 사용하기 위해 1.5mL의 무항생제 NBM에 있는 PDL 코팅 24웰 플레이트의 4개 웰에 있는 200,000개 세포/웰을 플레이트합니다. 습도가 조절되는 37 °C 및 5 % CO2 챔버에서 세포를 배양합니다.
    참고: 셀의 밀도는 결과에 따라 조정할 수 있습니다. 밀도가 높으면 뉴런을 이미지화하기가 더 어려워질 수 있으며, 밀도가 낮으면 배양 건강과 뉴런 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면, 쥐의 뉴런은 쥐의 뉴런에 비해 더 낮은 밀도로 도금될 수 있다.

3. 뉴런 형질주입

참고: 뉴런은 DIV 7 또는 DIV 8에서 transfection할 수 있으며, transfection 효율 또는 transport 결과의 현저한 변화 없이 가능합니다. 이 부피는 750 μL 부피/웰의 4웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 4웰에 대한 것입니다. 이 프로토콜은 지질 transfection 시약을 사용한 transfection에 대해 설명합니다. 배지와 transfection 시약을 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.

  1. 127.6 μL의 환혈 배지에 4.4 μL의 transfection 재고 시약을 첨가하여 transfection stock 시약을 준비합니다. 손으로 부드럽게 흔들어 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 지질 transfection 배양 중에 DNA 스톡을 준비합니다. 200 ng의 형광 화물 DNA(pFIN mApple-synaptophysin; 12,112 염기쌍)와 200 ng의 DNA를 발현하기 위해 관심 단백질(사용된 타우 플라스미드는 pCMV 타우-플래그 구조체, 5,036 염기쌍)을 감소된 혈청 또는 무혈청 배지에 넣고 최종 부피가 32 μL가 되도록한다 12. 0.8μL의 transfection enhancer 시약(DNA μg당 2μL)을 추가합니다. 손으로 잘 섞는다.
    참고 : RFP의 파생 상품 (mApple 또는 mCherry)이 가장 잘 작동하지만 GFP도 사용할 수 있습니다. 또한, 유전자를 침묵시키는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 DNA 구조를 포함하여 관심 단백질의 발현으로 관찰되는 표현형의 메커니즘을 테스트할 수 있습니다. 이를 위해 DNA 혼합물에 3개의 DNA 구조체 각각을 150ng씩 포함시키고 그에 따라 transfection enhancer 시약의 양을 조정합니다. DNA 또는 lipofection 시약의 파라미터 변경은 transfection 효율에 영향을 미칠 수 있으며 더 효율적이거나 덜 효율적인 transfections의 필요성에 따라 조정할 수 있습니다.
  3. DNA의 각 튜브에 32μL의 지질 transfection 혼합물을 추가합니다. 손으로 부드럽게 흔들어 섞습니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  4. 피펫의 끝을 배지 표면 바로 아래에 놓고 웰 전체에서 구불구불한 움직임으로 움직여 64μL의 DNA/transfection 시약 혼합물을 세포에 천천히 추가합니다. 모든 웰을 추가한 후 챔버 슬라이드를 손으로 3번 부드럽게 흔들어 더 섞고 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 넣습니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 2 시간 동안 배양합니다.
    참고: 뉴런이 빠르게 발생할 수 있는 온도 및 pH 변화에 매우 민감하므로 인큐베이터 외부에 있는 시간을 최소화하십시오.
  5. 컨디셔닝된 배지 + Neurofascin 항체로 transfection 2시간 후 반 배지 변경을 수행합니다. 배지 변경 직전에 24웰 플레이트에서 배양된 세포에서 1.5mL의 조절된 무항생제 NBM을 풀링합니다. 조절된 배지에 0.75μL의 Neurofascin 186(NF-186) 항체(500ng/mL)를 추가합니다.
    참고: NF-186 항체는 이미징을 위해 축삭돌기를 명확하게 식별하기 위해 축삭 초기 세그먼트(AIS)에 풍부한 neurofascin의 세포외 도메인을 감지합니다.
  6. transfection 후 18시간 후에 2차 항체를 포함하는 컨디셔닝된 배지로 전체 배지 교체를 수행합니다. AlexaFluor 647에 접합된 염소 항 토끼 2차 항체 1μL를 24웰 플레이트에서 풀링된 3mL의 조절된 NBM(무항생제)에 추가합니다. 잘 섞는다.

4. 뉴런 이미징

  1. transfection 2일 후에 이미징을 준비합니다. 컨포칼 현미경의 라이브 셀 챔버 부착물을 37°C(60x 대물렌즈 오일 포함)로 예열하고 챔버를 5% CO2로 평형화합니다.
  2. 고배율 대물렌즈와 live-cell chamber를 사용하여 세포를 이미지화합니다.
    참고: 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에는 60x 1.40 NA 대물렌즈를 사용하지만 높은 이미징 프레임 속도를 달성할 수 있는 경우 다른 컨포칼(예: 스피닝 디스크) 또는 광시야 형광 현미경 시스템도 사용할 수 있습니다.
  3. 접안렌즈를 사용하여 cargo protein을 포함하는 채널에서 transfection된 뉴런을 시각적으로 식별합니다. 다음으로, 뉴런을 이미지화하여 Cy5 채널의 AIS를 식별합니다(그림 1).
  4. 시야를 32 x 128 픽셀 의 직사각형 상자로 설정하고 AIS에 대한 원위 ~ 50-150 μm 축삭 영역을 이미지로 이동합니다. 화물 운송의 방향과 ROI의 방향을 기록하고 기록합니다. 상자의 점은 각각 후속 이미지와 영화의 상단과 오른쪽으로 나타납니다. 이미지의 어느 쪽이 세포체에 가장 가깝고 어느 쪽이 축삭 말단에 가장 가까운지 기록하여 5.1단계의 키모그래프 폴리라인을 올바른 방향으로 그릴 수 있습니다.
    알림: 관심 영역을 선택할 때 고립된 축삭의 이미징 영역은 상대적으로 직선이어야 하며 각 끝에서 시야와 교차해야 합니다. 전체 세그먼트는 동일한 초점면 내에 있어야 합니다. 해당 지역은 화물의 활성 운송을 명확하게 표시해야 합니다. 과도하게 밝은 뉴런은 일반적으로 화물 단백질과 관심 단백질을 뉴런에 독성이 있을 수 있는 수준으로 발현하므로 피해야 합니다.
  5. 561 레이저 출력을 1.40으로, 핀홀을 7.8로, 크기를 128px2로, 속도를 32프레임/초로 설정합니다. 배경 신호에 의해 가려지지 않고 개별 화물 소포의 운송을 시각화하기 위해 게인을 조정합니다(일반적으로 고품질 카이모그래프에서 10에서 50 사이).
    참고: 매우 민감한 GaAsP 검출기 덕분에 매우 낮은 레이저 출력을 달성할 수 있으며 움직이는 화물의 잠재적인 광독성 효과 및 광표백을 방지합니다. 핀홀 크기는 축삭이 슬라이드 표면에 완벽하게 평평하게 놓이지 않을 수 있으므로 전체 ROI가 이미지화되도록 초점 깊이를 늘리기 위해 가능한 한 넓게 설정됩니다.
  6. ROI 드롭다운 메뉴에서 Draw Rectangular ROI...를 선택하여 ROI를 설정합니다. 전체 시야를 포함하도록 ROI를 그립니다. ROI를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Use as Stimulation ROI: S1을 선택합니다.
  7. ND 설정 탭에 다음 단계를 포함하여 ND 설정을 준비합니다.
    참고: 이것은 한 번 설정되는 5단계 획득 프로토콜로, 영화가 수집될 때마다 소프트웨어에 의해 수행됩니다.
    1. Acquire Image 를 사용하여 프레스티뮬레이션 참조 이미지를 수집합니다.
    2. 자극; ROI: 에스1; 간격: NoDelay; 지속 시간 1.64초, 루프: 7. 이 단계는 레이저의 여러 펄스로 배경 형광을 표백합니다.
    3. 이미지를 획득합니다. 이 단계에서는 자극 후 참조 이미지를 수집합니다.
    4. 기다림; 조치 없음; 2분 이 단계는 형광 화물이 표백된 ROI를 다시 채울 수 있는 회수 기간을 제공합니다.
    5. 획득; 간격: NoDelay; 소요 시간 5 분, 루프 : 8,615. 이 단계에서는 5분의 이미징 기간 동안 최대 속도로 이미지를 수집합니다.
  8. ND 설정 프로토콜을 설정한 후 ND 설정 탭에서 자극 설정 적용 버튼을 클릭합니다. 화물 운송을 이미지화할 준비가 되면 Run Now(지금 실행)를 클릭합니다. 그러면 4.7단계부터 ND 획득 프로토콜이 시작됩니다.
    참고: 프레임 속도가 32 frames/s로 설정되어 있지만 실제 프레임 속도는 더 느릴 수 있습니다(~28.7 frames/s). 이 값은 섹션 5에서 정확한 카이모그래프 분석을 위해 기록해야 합니다. 이상적으로는 화물의 움직임을 더 잘 판독하기 위해 가능한 가장 빠른 프레임 속도(예: >25 프레임/초)로 라이브 셀 전송 이미징을 수행하는 것이 좋습니다.
  9. 시야를 전체 이미지로 재설정합니다. 그런 다음, ROI 상자가 포함된 561 및 647 채널에서 전체 뉴런의 이미지를 수집하고 저장합니다. 관심 단백질의 발현을 사후 확인하기 위해 이미지를 촬영한 XY 좌표를 기록합니다.
  10. 분석을 위해 두 개 이상의 뉴런에서 transport video를 수집합니다. 각 독립 반복실험이 개별 1차 뉴런 수확(즉, 개별 뉴런이 아님)에서 측정된 변수의 평균에서 나오는지 확인합니다.
    참고: 주어진 1차 뉴런 수확을 위해 조건당 2-4개의 뉴런에서 비디오를 수집합니다.
  11. 배지를 제거하고 미리 데워진 4% 파라포름알데히드로 실온에서 20분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 버퍼를 제거하고 TBS에서 각각 3 x 5분 동안 셀을 세척합니다.
    참고: 파라포름알데히드 고정을 위해 세포골격 구조를 유지하는 일반적인 완충액인 세포골격 완충액을 사용합니다(10mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl2 및 4 mM EGTA, pH 6.1). 다른 완충액(예: TBS, PBS)도 고정에 사용할 수 있습니다.
  12. 분석된 뉴런이 면역세포 형광 염색을 통해 관심 단백질과 형광 태그가 부착된 cargo protein을 모두 발현하는지 확인합니다. 인간 타우(Tau12)를 염색하여 외인성 타우 발현을 확인하고 β-III 튜불린(Tuj1)을 통해 이미징 과정 전반에 걸쳐 뉴런이 건강하게 유지되었는지 확인합니다.
    참고: 이러한 방법을 사용하여 거의 모든 transfection된 세포에서 두 DNA 구조체의 동시 발현을 관찰합니다.

5. Kymographs 생성 및 분석

참고: Kymographs는 다양한 프로그램을 사용하여 생성하고 분석할 수 있습니다. 6개의 ImageJ(v. 1.51n) 플러그인16을 사용하여 무료로 사용할 수 있는 KymoAnalyzer(v. 1.01) 소프트웨어에 대해 간략하게 설명합니다. 이 플러그인은 Encalada lab 웹 사이트 (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer)에서 개발자로부터 다운로드 할 수 있습니다. 이 소프트웨어 사용에 대한 자세한 지침은 이 사이트에서 찾을 수 있습니다.

  1. 4.9단계에서 생성된 동영상을 실험 조건에 따라 그룹화하고 복제합니다. BatchKymographGeneration 매크로 를 실행하고 적절한 폴더를 선택합니다. kymograph 폴리라인을 그려 특정 이미지의 근위 끝에서 시작하는 축삭을 추적합니다. 결과 kymographs는 선택한 폴더에 저장됩니다(그림 2).
  2. 트랙 매크로를 실행하고, 개별 동영상 폴더를 선택하고, 예를 선택하여 트랙을 추가한 다음, 각 파티클의 궤적을 클릭하여 추적하여 트랙을 수동으로 할당합니다. 트랙 상단에서 초기 클릭을 수행하고 파티클의 속도 또는 방향이 변경되는 모든 지점에서 다시 클릭하여 폴리라인이 카이모그래프에서 파티클의 추적을 오버레이하도록 합니다. 폴리선을 전체 트랙 위에 놓은 후 확인을 클릭합니다. 모든 트랙이 할당될 때까지 반복합니다.
  3. 나머지 매크로를 실행하여 이미징 매개변수에 따라 프레임 속도와 픽셀 크기를 할당합니다. 먼저 CargoPopulation, NetCargoPopulation, 세그먼트를 차례로 실행합니다. 메시지가 표시되면 동영상의 픽셀 크기와 프레임 속도를 입력합니다(이 설정 사용 시 각각 0.22 μm 및 28.7 frames/s). 마지막으로 poolData 매크로 를 실행하여 선택한 폴더의 모든 kymographs에서 전송 매개 변수 데이터를 계산하고 풀링합니다.
  4. 데이터 파일의 결과를 플로팅하고 개별 뉴런 수확에 대한 실험 조건 내에서 분석된 모든 뉴런의 평균값으로 표시되는 독립 반복실험과 다양한 조건을 비교합니다.

결과

이러한 방법을 사용하여 질병12,13에서 병리학적 타우 유발 신경독성의 잠재적 메커니즘을 조사하기 위해 야생형 또는 질병 관련 형태의 타우 단백질이 있는 상태에서 축삭 수송을 특성화했습니다. KymoAnalyzer 소프트웨어는 주어진 폴더 내의 모든 카이모그래프에서 다양한 파라미터를 계산하고 풀링합니다. 운송 요금은 화물이 ?...

토론

다양한 신경 퇴행성 질환과 관련된 여러 병리학적 단백질이 뉴런의 빠른 축삭 수송을 방해한다는 증거가 증가하고 있습니다. 이는 이러한 질병 전반에 걸쳐 신경독성의 잠재적인 공통 메커니즘을 나타냅니다. 이러한 단백질이 수송을 방해하는 과정을 더 잘 이해하려면 특정 질문을 해결할 수 있는 도구와 모델이 필요합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 설치류의 일?...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이러한 프로토콜의 여러 측면을 개발하고 최적화하기 위해 노력한 Chelsea Tiernan과 Kyle Christensen에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금 R01 NS082730(N.M.K.), R01 AG044372(N.M.K.), R01 AG067762(N.M.K.) 및 F31 AG074521(R.L.M.)의 지원을 받았습니다. NIH/National Institute on Aging, Michigan Alzheimer's Disease Research Center Grant 5P30AG053760(NMK 및 BC); Peer Reviewed Alzheimer's Research Program Award W81XWH-20-1-0174 (BC)를 통한 국방부 보건 담당 차관보실; 알츠하이머 협회 연구 보조금 20-682085(BC); 그리고 Secchia Family Foundation (NMK).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blueGibco15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubesDOTRN1700-GMT
2.5% trypsinGibco15090-046
3 mL syringe with 21 G needleFisher14-826-84
10 mL plastic syringeFisher14-823-2A
14 G needleFisher14-817-203
15 G needleMedlineSWD200029Z
16 G needleFisher14-817-104
18 G needleFisher14-840-97
22 G needleFisher14-840-90
32% paraformaldehydeFisher50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenA21244RRID:AB_2535813
Amphotericin BGibco15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4" RobozRS-5163autoclave
B-27 Supplement (50x), serum freeGibcoA3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates Fisher08-774-124
boric acidSigmaB6768-1KG
Calcium chlorideSigmaC7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp ScissorsRobozRS-5658autoclave
Cell counting deviceautomatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DNase I (Worthington)FisherNC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco14200-075
EGTAFisherO2783-100
Fatal-Plus SolutionVortech Pharmaceuticals, LTDNDC 0298-9373-68sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used 
Fetal bovine serumInvitrogen16000044
Gentamicin Reagent SolutionGibco15710-072
GlutaMAXGibco35050-061glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco24020-117
ImageJ version 1.51nImageJLife-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)Encalada LabPackage includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000Invitrogen100022050Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chlorideFisherAC223211000
MES hydrateSigmaM8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/SharpRobozRS-5910autoclave
Neurobasal Plus mediumGibcoA3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2aUC Davis/NIH NeuroMab75-172RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgGCell Signaling15034RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serumGibco16010-167
Opti-MEMGibco31985-062
P3000Invitrogen100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glassFisher08-748BFor dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glassFisher08-748DTo place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysineSigmaP7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)Fisher14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)Fisher14-955-238
Potassium chlorideFisherP217-500
Sodium acetateSigmaS5636
sodium borate decahydrateVWRMK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/SharpFisher13-810-2autoclave
Syringe Filters, 0.22 µmVWR514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"RobozRS-8100autoclave
µ-Slide 4 Well Glass BottomIbidi80427

참고문헌

  1. Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms. Front Neurosci. 11, 572 (2017).
  2. Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. Tau and axonal transport misregulation in tauopathies. Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).
  3. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  4. Morfini, G. A., et al. Axonal transport defects in neurodegenerative diseases. J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).
  5. Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon. Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).
  6. LaPointe, N. E., et al. The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity. J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).
  7. Kanaan, N. M., et al. Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases. J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).
  8. Kanaan, N. M., et al. Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport. Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).
  9. Pigino, G., et al. Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).
  10. Morfini, G. A., et al. Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin. Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).
  11. Morfini, G. A., et al. Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase. PLoS One. 8 (6), e65235 (2013).
  12. Combs, B., et al. Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism. J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).
  13. Christensen, K. R., et al. Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons. Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. (65), 3634 (2012).
  16. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  17. Cox, K., et al. Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition. Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).
  18. Tiernan, C. T., et al. Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport. Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).
  19. Mueller, R. L., et al. Tau: a signaling hub protein. Front Mol Neurosci. 14, 647054 (2021).
  20. Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity. J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).
  21. Basu, H., Schwarz, T. L. QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance. Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108 (2020).

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