Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Riepilogo

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Abstract

Il trasporto bidirezionale dei carichi lungo l'assone è fondamentale per mantenere le sinapsi funzionali, la connettività neurale e i neuroni sani. Il trasporto assonale è interrotto in diverse malattie neurodegenerative e i neuroni di proiezione sono particolarmente vulnerabili a causa della necessità di trasportare materiali cellulari su lunghe distanze e sostenere una notevole massa assonale. Le modificazioni patologiche di diverse proteine correlate alla malattia influenzano negativamente il trasporto, tra cui tau, amiloide-β, α-sinucleina, superossido dismutasi e huntingtina, fornendo un potenziale meccanismo comune attraverso il quale le proteine patologiche esercitano tossicità nella malattia. I metodi per studiare questi meccanismi tossici sono necessari per comprendere i disturbi neurodegenerativi e identificare potenziali interventi terapeutici.

Qui, i neuroni dell'ippocampo primario di roditori in coltura vengono co-trasfettati con plasmidi multipli per studiare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale veloce utilizzando l'imaging confocale su cellule vive di proteine cargo marcate in fluorescenza. Iniziamo con la raccolta, la dissociazione e la coltura dei neuroni primari dell'ippocampo dai roditori. Quindi, co-trasfettiamo i neuroni con costrutti di DNA plasmidico per esprimere la proteina cargo marcata con fluorescenza e la tau wild-type o mutante (usata come esempio di proteine patologiche). Gli assoni vengono identificati nelle cellule vive utilizzando un anticorpo che lega un dominio extracellulare di neurofascina, una proteina del segmento iniziale dell'assone e una regione assonale di interesse viene visualizzata per misurare il trasporto di merci fluorescenti.

Utilizzando KymoAnalyzer, una macro ImageJ disponibile gratuitamente, caratterizziamo ampiamente la velocità, la frequenza di pausa e la densità di carico direzionale del trasporto assonale, che possono essere influenzate dalla presenza di proteine patologiche. Attraverso questo metodo, identifichiamo un fenotipo di aumento della frequenza di pausa del carico associato all'espressione della proteina tau patologica. Inoltre, i costrutti di shRNA di silenziamento genico possono essere aggiunti al mix di trasfezione per testare il ruolo di altre proteine nella mediazione dell'interruzione del trasporto. Questo protocollo è facilmente adattabile per l'uso con altre proteine correlate alla malattia neurodegenerativa ed è un metodo riproducibile per studiare i meccanismi di come tali proteine interrompono il trasporto assonale.

Introduzione

I neuroni dipendono dal trasporto bidirezionale del carico lungo l'assone per mantenere le sinapsi funzionali e la connettività neurale. Si ritiene che i deficit del trasporto assonale contribuiscano in modo critico alla patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e altre taupatie, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la malattia di Huntington ^1,2,3. Infatti, le modifiche patologiche di diverse proteine correlate alla malattia influenzano negativamente il trasporto (rivisto in ⁴). Lo sviluppo di metodi per studiare i meccanismi attraverso i quali le proteine patologiche esercitano tossicità nella malattia è necessario per comprendere i disturbi neurodegenerativi e identificare potenziali bersagli per l'intervento terapeutico.

Diverse importanti intuizioni sul trasporto degli assoni, tra cui la scoperta della chinesina convenzionale, le vie dipendenti dalla chinasi e dalla fosfatasi che regolano le proteine motorie e i meccanismi attraverso i quali le proteine patologiche interrompono la regolazione del trasporto degli assoni, sono state fatte utilizzando il modello^di assoplasma isolato del calamaro ^4,5. La perfusione dell'assoplasma di calamaro con forme patologiche della proteina tau inibisce il trasporto assonale veloce anterogrado (FAT), un effetto dipendente dall'esposizione del dominio attivante la fosfatasi della tau, che attiva la proteina fosfatasi 1 (PP1)^6,7,8. PP1 attiva la glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3), che a sua volta fosforila le catene leggere chinesine causando il rilascio di carico. Un'altra proteina patologica nell'AD è l'amiloide-β. Le forme oligomeriche di amiloide-β inibiscono la FAT bidirezionale attraverso la caseina chinasi 2, che fosforila le catene leggere della chinesina⁹. Inoltre, la proteina huntingtina patologica che ospita un'espansione della poliglutammina e un mutante SOD1 familiare legato alla SLA interrompono il trasporto assonale nell'assoplasma del calamaro attraverso l'attività della chinasi N-terminale c-Jun e della proteina chinasi attivata dal mitogeno p38, rispettivamente^10,11.

Mentre il modello dell'assoplasma del calamaro continua ad essere uno strumento prezioso per comprendere gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale, l'accesso limitato all'attrezzatura e ai campioni ne impedisce un uso più ampio. Abbiamo sviluppato un saggio di trasporto utilizzando l'imaging al microscopio confocale su cellule vive di neuroni primari di roditori (topo e ratto). Questo modello rappresenta un approccio basato sui neuroni dei mammiferi facilmente adattabile e manipolabile utilizzando sorgenti cellulari e sistemi di microscopia ampiamente disponibili. Ad esempio, una varietà di proteine patologiche (ad esempio, che ospitano modifiche correlate alla malattia) sono espresse per identificare come specifiche modifiche di queste proteine influenzano il trasporto negli assoni. Allo stesso modo, una varietà di proteine cargo marcate in fluorescenza possono essere utilizzate per esaminare i cambiamenti specifici del carico. Inoltre, i meccanismi molecolari sottostanti sono studiati in modo relativamente semplice prendendo di mira l'espressione (cioè knockdown o sovraespressione) di proteine selezionate che possono mediare questi effetti. Questo metodo è anche facilmente adattabile per i neuroni primari derivati da un'ampia varietà di modelli animali.

Presentiamo un protocollo dettagliato che descrive il saggio di trasporto degli assoni su cellule vive precedentemente utilizzato nei neuroni primari dell'ippocampo per dimostrare che le proteine tau mutanti associate alle demenze lobari frontotemporali (FTLD; P301L o R5L tau) aumentano bidirezionalmente la frequenza di pausa delle proteine cargo marcate in fluorescenza¹². Inoltre, il knockdown dell'isoforma PP1γ ha salvato gli effetti di pausa¹². Ciò fornisce supporto al modello di interruzione patologica indotta dalla tau che è mediata attraverso l'attivazione aberrante di una via di segnalazione avviata da PP1 come descritto sopra ^6,7,12. In uno studio separato, abbiamo dimostrato che la pseudofosforilazione di tau a S199/S202/T205 (il fosfoepitopo patogeno AT8 rilevante per le taupatie) aumenta la frequenza di pausa del carico e la velocità del segmento anterogrado. Questi effetti dipendevano dal dominio di attivazione della fosfatasi N-terminale della tau¹³. Questi esempi evidenziano l'utilità di questo modello per identificare i meccanismi di come le proteine patologiche interrompono il trasporto degli assoni nei neuroni dei mammiferi.

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del metodo a partire dalla raccolta, dissociazione e coltura dei neuroni primari dell'ippocampo di topo, seguita dalla trasfezione dei neuroni con proteine cargo fuse con una proteina fluorescente e, infine, l'approccio di imaging e analisi delle immagini su cellule vive. Dimostriamo come questo metodo venga utilizzato per studiare gli effetti della tau modificata sul trasporto bidirezionale della proteina associata alla vescicola, la sinaptofisina, ad esempio. Tuttavia, c'è flessibilità nella proteina patogena e nella proteina del carico di trasporto di interesse, il che rende questo approccio versatile per studiare il trasporto assonale.

Protocollo

Questi protocolli sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Michigan State University. Questo protocollo è stato applicato con successo a topi Tau Knockout nel background C57BL/6J e a ratti Sprague Dawley wild-type. Anche altri ceppi dovrebbero essere accettabili.

1. Prelievo di neuroni primari dell'ippocampo

1. Rivestire un vetrino a 4 pozzetti con poli-d-lisina (PDL) filtrata da 0,5 mg/mL in tampone borato (12,5 mM di borato di sodio decaidrato e 50 mM di acido borico). Aggiungere 750 μL/pozzetto e incubare a temperatura ambiente per una notte.
2. Lavare il vetrino della camera 4 volte con acqua deionizzata sterile. Asciugare all'aria dopo l'ultimo lavaggio e conservare a 4 °C per una conservazione a breve termine (<1 settimana).
   NOTA: Non lasciare asciugare il PDL sul vetrino prima e tra un lavaggio e l'altro, poiché ciò è tossico per le colture. Scopriamo che la conservazione a lungo termine dei vetrini rivestiti con PDL può influire sulla salute neuronale e che il mantenimento di intervalli costanti tra il rivestimento e la placcatura riduce la variabilità tra le corse nella vitalità della coltura.
3. Ottieni un topo o un ratto con gravidanza a tempo.
   NOTA: Gli animali in gravidanza possono essere ordinati da varie aziende o allevati internamente. Il giorno zero embrionale si riferisce al giorno in cui viene trovato il tappo vaginale e abbiamo avuto successo nel coltivare neuroni ippocampali e corticali primari di topo E16-18 con questo approccio. Anche i neuroni di ratto vengono raccolti il giorno 18 dell'embrione.
4. Su E18, sopprimere la femmina incinta con un metodo approvato. Taglia la parete addominale e rimuovi le due corna uterine. Trasferirli in una capsula di Petri contenente soluzione salina ghiacciata allo 0,9%. Risciacquare fino a quando la soluzione salina non è pulita.
   NOTA: Somministriamo un sovradosaggio di pentobarbital sodico (almeno 100 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
5. Decapita i cuccioli. A partire dal forame magno (l'apertura nella parte posteriore del cranio), utilizzare le forbici da microdissezione per tagliare la pelle e il cranio lungo la linea mediana, inclinando la punta inferiore delle forbici contro la parte interna del cranio per evitare danni al tessuto cerebrale.
6. Rimuovere la pelle sovrastante e rimuovere con cura il cranio per esporre il cervello.
7. Usa una pinza per tenere l'area della bocca/naso e gira il cranio in modo che il cervello sia rivolto verso il basso su una capsula di Petri riempita con soluzione salina allo 0,9%. Estrarre il cervello dal cranio e tagliare i nervi e il tronco encefalico per rilasciare il cervello nella soluzione salina.
8. Posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio da dissezione per la dissezione dell'ippocampo. Inserisci le forbici nella linea mediana del cervello, inclina le forbici in modo che la lama superiore spinga uno degli emisferi cerebrali verso l'esterno e taglia per separare l'emisfero dalle regioni sottocorticali.
9. Fai un taglio verticale attraverso la corteccia in modo che la corteccia frontale sia anteriore e l'ippocampo sia posteriore al sito di taglio. Inserire la punta inferiore delle forbici nel foro risultante e tagliare con cura lungo l'apice della corteccia fermandosi all'estremità posteriore.
10. Usando il forcipe, fai oscillare con cautela la corteccia e termina il taglio posteriore. L'ippocampo dovrebbe assomigliare a una forma a mezzaluna. Taglia con cura la corteccia rimanente in modo che l'ippocampo mantenga la sua forma arrotondata e a mezzaluna.
11. Usando pinze e forbici, rimuovere delicatamente le meningi dall'ippocampo.
    NOTA: È importante rimuovere tutte le meningi dal cervello per ridurre il numero di cellule non neuronali che vengono raccolte, astenendosi dal danneggiare o strappare il tessuto ippocampale.
12. Tagliare l'ippocampo in quattro pezzi uguali e posizionare il tessuto in una provetta conica da 15 ml riempita con tampone ghiacciato privo di calcio e magnesio (CMF; PBS di Dulbecco con 0,1% di glucosio, 2,5 μg/mL di amfotericina B e 50 μg/mL di gentamicina).
    NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere l'ippocampo da 5-10 cuccioli per dissociazione. Ogni ippocampo dovrebbe fornire circa 300.000 cellule per i topi e 500.000 cellule per i ratti.

2. Dissociazione e placcatura dei neuroni dell'ippocampo primario

1. Rimuovere il CMF con una pipetta Pasteur e sciacquare il fazzoletto con CMF freddo fresco 4x, agitando delicatamente tra un risciacquo e l'altro.
2. Rimuovere il CMF e aggiungere 3 ml di soluzione filtrata di tripsina allo 0,125% (diluire il 2,5% di tripsina in CMF preriscaldato [37 °C]). Incubare il tessuto per esattamente 15 minuti a 37 °C; Agitare delicatamente ogni 5 minuti.
   NOTA: Preparare la soluzione di tripsina immediatamente prima dell'uso.
3. Preparare 5 mL di soluzione per l'inattivazione della tripsina (TIS; Soluzione salina bilanciata di Hanks, 20% di siero di vitello neonato e 1 soluzione di DNasi I [10 stock: 5 mM di acetato di sodio, 1 μM di cloruro di calcio, 0,5 mg/mL di DNasi I]).
4. Rimuovere la soluzione di tripsina e lavare 2 volte con CMF freddo. Aggiungere 3 ml di TIS freddo.
5. Dissociare le cellule mediante triturazione utilizzando una siringa da 3 ml con aghi di diametro progressivamente più piccolo: triturare 30 volte utilizzando un ago da 14 G, 30 volte utilizzando un ago da 15 G, 20 volte utilizzando un ago da 16 G, 20 volte utilizzando un ago da 18 G e 15 volte utilizzando un ago da 21 G. Utilizzare 2 tiri di s con i primi quattro ferri e 3 s di tiri con il ferro da 21 g.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche altri metodi di triturazione (ad es. pipette in vetro lucidato a fuoco^14,15). Scopriamo che l'uso degli aghi per siringhe in metallo standardizzati riduce sostanzialmente la variabilità nell'aggregazione e nella vitalità delle cellule.
6. Utilizzando l'ago da 21 G, posizionare una gocciolina della sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e verificare la presenza di grumi di cellule. Se si osservano più grumi, triturare altre tre volte con un ago da 22 G e ricontrollare. Ripetere questo processo fino ad ottenere una sospensione monocellulare omogenea, facendo attenzione a triturare delicatamente durante tutto il processo.
7. Filtrare 5 mL di siero fetale bovino (FBS) utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm. Sovrapporre delicatamente la sospensione cellulare sull'FBS in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le celle (200 × g a 4 °C) per 5 minuti.
8. Rimuovere quanto più FBS possibile senza interrompere il pellet. Risospendere in 1 mL di terreno neurobasale caldo (37 °C) privo di antibiotici (NBM; integrato con 1x sostituto della glutammina e 1x B-27).
9. Diluire la sospensione cellulare in blu di tripano (0,4%) e ottenere una conta cellulare.
   NOTA: Una diluizione 1:1 funziona bene per un contatore automatico di cellule e utilizzare una diluizione 1:60 per il conteggio manuale con un ematocitometro. Per continuare con la placcatura cellulare, la vitalità dei neuroni dovrebbe essere superiore al 90% a questo punto. Ciò aumenta significativamente la probabilità di una coltura neuronale sana dopo la dissociazione.
10. Piastra le cellule a una densità di 175.000 cellule/pozzetto (70.000 cellule/mm²) in un vetrino a quattro pozzetti preriscaldato rivestito in PDL in 750 μL di NBM privo di antibiotici. Inoltre, piastra 200.000 cellule/pozzetto in quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti rivestita in PDL in 1,5 mL di NBM privo di antibiotici da utilizzare come terreno condizionato nella trasfezione descritta nella sezione 3. Incubare le cellule in una camera a umidità controllata, a 37 °C e CO₂ al 5%.
    NOTA: La densità delle celle può essere regolata in base ai risultati. Densità elevate possono rendere più difficile l'imaging dei neuroni, mentre densità basse possono influire negativamente sulla salute della coltura e sulla sopravvivenza dei neuroni. Nella nostra esperienza, i neuroni di ratto possono essere placcati a una densità inferiore rispetto ai neuroni di topo.

3. Trasfezione neuronale

NOTA: I neuroni possono essere trasfettati su DIV 7 o DIV 8 senza cambiamenti notevoli nell'efficienza di trasfezione o nei risultati del trasporto. Questi volumi sono per quattro pozzetti di un vetrino a camera con fondo in vetro a quattro pozzetti in volume di 750 μl/pozzetto. Questo protocollo descrive la trasfezione utilizzando reagenti di trasfezione lipidica. Lasciare che i terreni e i reagenti di trasfezione si riscaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.

1. Preparare il reagente stock di trasfezione aggiungendo 4,4 μl di reagente di trasfezione a 127,6 μl di terreno sierico ridotto. Scuotere delicatamente a mano per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Preparare le scorte di DNA durante l'incubazione della trasfezione lipidica. Aggiungere 200 ng di DNA fluorescente (pFIN mApple-sinaptofisina; 12.112 coppie di basi) e 200 ng di DNA per esprimere la proteina di interesse (i plasmidi tau utilizzati erano costrutti tau-Flag di pCMV; 5.036 coppie di basi) in siero ridotto o terreno privo di siero fino a un volume finale di 32 μL¹². Aggiungere 0,8 μl di reagente potenziatore di trasfezione (2 μl per μg di DNA). Mescolate bene a mano.
   NOTA: Troviamo che un derivato di RFP funziona meglio (mApple o mCherry), ma può essere utilizzato anche GFP. Inoltre, un costrutto di DNA per esprimere un piccolo RNA a forcina con silenziamento genico (shRNA) può essere incluso per testare i meccanismi dei fenotipi osservati con l'espressione della proteina di interesse. Per fare ciò, includere 150 ng di ciascuno dei tre costrutti di DNA nella miscela di DNA e regolare di conseguenza la quantità di reagente potenziatore di trasfezione. La modifica dei parametri del DNA o del reagente di lipofezione può influire sull'efficienza della trasfezione e può essere regolata in base alla necessità di trasfezioni più o meno efficienti.
3. Aggiungere 32 μL di miscela di trasfezione lipidica a ciascuna provetta di DNA. Scuotere delicatamente a mano per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
4. Aggiungere lentamente 64 μl di miscela di DNA/reagente di trasfezione alle cellule posizionando la punta della pipetta appena sotto la superficie del terreno e muovendosi con un movimento a serpentina in tutto il pozzetto. Far oscillare delicatamente il vetrino della camera a mano 3 volte dopo averlo aggiunto a tutti i pozzetti per mescolare ulteriormente e posizionare il vetrino della camera nell'incubatore. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 2 ore.
   NOTA: Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui i neuroni sono fuori dall'incubatrice poiché sono molto sensibili alle variazioni di temperatura e pH, che possono verificarsi rapidamente.
5. Eseguire un cambio di mezzo mezzo 2 ore dopo la trasfezione con terreno condizionato + anticorpo Neurofascin. Immediatamente prima del cambio del terreno, raccogliere 1,5 mL di NBM condizionato privo di antibiotici dalle cellule coltivate sulla piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 0,75 μL di anticorpo Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) al terreno condizionato.
   NOTA: L'anticorpo NF-186 rileva un dominio extracellulare di neurofascina che si arricchisce nel segmento iniziale dell'assone (AIS) per identificare definitivamente l'assone per l'imaging.
6. Eseguire un cambio completo del terreno 18 ore dopo la trasfezione con un terreno condizionato contenente l'anticorpo secondario. Aggiungere 1 μL di anticorpo secondario capra-anti-coniglio coniugato ad AlexaFluor 647 a 3 mL di NBM condizionato (privo di antibiotici) raggruppato dalla piastra a 24 pozzetti. Mescola bene.

4. Imaging neuronale

1. Prepararsi per l'imaging 2 giorni dopo la trasfezione. Riscaldare l'attacco della camera delle cellule vive per il microscopio confocale a 37 °C (incluso l'olio per obiettivo e lente 60x) ed equilibrare la camera al 5% di CO₂.
2. Utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento e una camera a cellule vive per visualizzare le cellule.
   NOTA: Utilizziamo un obiettivo 60x 1,40 NA su un microscopio confocale a scansione laser, ma possono essere utilizzati anche altri sistemi di microscopia a fluorescenza confocale (ad es. disco rotante) o a campo largo se sono in grado di raggiungere frame rate di imaging elevati.
3. Identificare visivamente i neuroni trasfettati nel canale contenente la proteina cargo utilizzando gli oculari. Quindi, visualizza i neuroni per identificare l'AIS nel canale Cy5 (Figura 1).
4. Impostare il campo visivo su un riquadro rettangolare di 32 pixel per 128 pixel e spostarlo per visualizzare una regione dell'assone ~50-150 μm distale all'AIS. Annotare e registrare la direzionalità del trasporto merci e l'orientamento del ROI. I punti sulla casella appariranno rispettivamente in alto e a destra di tutte le immagini e i filmati successivi. Registrare quale lato dell'immagine è più vicino al corpo cellulare e quale è più vicino all'estremità dell'assone in modo che la polilinea del chimografo nel passaggio 5.1 possa essere disegnata con l'orientamento corretto.
   NOTA: Quando si seleziona la regione di interesse, l'area dell'immagine di un assone isolato deve essere relativamente diritta e intersecare il campo visivo a ciascuna estremità. L'intero segmento deve trovarsi all'interno dello stesso piano focale. L'area dovrebbe mostrare chiaramente il trasporto attivo di merci. I neuroni eccessivamente luminosi in genere esprimono la proteina cargo e le proteine di interesse a livelli che potrebbero essere tossici per il neurone e dovrebbero essere evitati.
5. Impostate la potenza del laser 561 su 1,40, il foro stenopeico su 7,8, la dimensione su 128 px² e la velocità su 32 fotogrammi/s. Regola il guadagno per visualizzare il trasporto delle singole vescicole del carico senza che venga oscurato dal segnale di fondo (in genere tra 10 e 50 risultati in chimografi di alta qualità).
   NOTA: La potenza laser estremamente bassa è ottenibile grazie ai rilevatori GaAsP altamente sensibili e previene potenziali effetti fototossici e fotosbiancamento del carico in movimento. La dimensione del foro stenopeico è impostata il più ampia possibile per aumentare la profondità focale e garantire che l'intera ROI venga ripresa, poiché l'assone potrebbe non essere perfettamente piatto sulla superficie del vetrino.
6. Imposta il ROI selezionando Disegna ROI rettangolare... dal menu a discesa ROI . Disegna il ROI in modo che copra l'intero campo visivo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul ROI e selezionare Usa come ROI di stimolazione: S1.
7. Preparare l'impostazione ND includendo i seguenti passaggi nella scheda ND Setup.
   NOTA: Questo è il protocollo di acquisizione in cinque fasi che viene impostato una volta e quindi verrà eseguito dal software ogni volta che i filmati vengono raccolti.
   1. Acquisisci immagine per raccogliere l'immagine di riferimento prestimolazione.
   2. Stimolazione; ROI: S1; Intervallo: NoDelay; Durata 1,64 s, Loops: 7. Questo passaggio sbianca la fluorescenza di fondo con diversi impulsi del laser.
   3. Acquisisci immagine. Questo passaggio raccoglie un'immagine di riferimento post-stimolazione.
   4. In attesa; Nessuna azione; 2 min. Questa fase fornisce un periodo di recupero per il carico fluorescente per ripopolare il ROI sbiancato.
   5. Acquisizione; Intervallo: NoDelay; Durata 5 min, Anelli: 8.615. Questo passaggio raccoglie le immagini alla velocità massima per il periodo di imaging di 5 minuti.
8. Dopo aver impostato il protocollo ND Setup, fare clic sul pulsante Applica impostazioni di stimolazione nella scheda ND Setup . Fare clic su Esegui ora quando si è pronti per visualizzare il trasporto merci. In questo modo verrà avviato il protocollo di acquisizione ND dal passaggio 4.7.
   NOTA: Sebbene la frequenza dei fotogrammi sia impostata su 32 fotogrammi/s, la frequenza dei fotogrammi pratica potrebbe essere più lenta (~28,7 fotogrammi/s). Questo valore deve essere registrato per un'analisi chimografica accurata nella sezione 5. Idealmente, l'imaging del trasporto di cellule vive viene eseguito con il frame rate più veloce possibile (ad esempio, >25 fotogrammi/s) per decifrare meglio i movimenti del carico.
9. Reimpostare il campo visivo sull'intera immagine; quindi, raccogli e salva un'immagine dell'intero neurone nei canali 561 e 647 con la casella ROI inclusa. Registrare le coordinate XY in cui è stata scattata l'immagine per la conferma della postfissazione dell'espressione della proteina di interesse.
10. Raccogli video di trasporto da almeno due neuroni per l'analisi. Assicurarsi che ogni replica indipendente provenga dalle medie delle variabili misurate da un singolo prelievo di neuroni primari (cioè, non da singoli neuroni).
    NOTA: Per un dato prelievo di neuroni primari, raccogliamo video da 2-4 neuroni per condizione.
11. Fissare le cellule rimuovendo il terreno e incubando con paraformaldeide preriscaldata al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone e lavare le celle per 3 x 5 minuti ciascuna in TBS.
    NOTA: Per la fissazione della paraformaldeide, utilizziamo il tampone citoscheletro, un tampone comune che mantiene la struttura del citoscheletro (10 mM 2-(N-morfolino)acido etansolfonico [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ e 4 mM EGTA, pH 6,1). Per il fissaggio possono essere utilizzati anche altri tamponi (ad es. TBS, PBS).
12. Confermare che i neuroni analizzati esprimano sia la proteina di interesse che la proteina cargo marcata in fluorescenza attraverso la colorazione in immunocitofluorescenza. Colorazione per tau umana (Tau12) per confermare l'espressione di tau esogena e tubulina β-III (Tuj1) per verificare che i neuroni siano rimasti sani durante il processo di imaging.
    NOTA: Osserviamo la co-espressione di entrambi i costrutti di DNA in quasi tutte le cellule trasfettate utilizzando questi metodi.

5. Generare e analizzare i chimografi

NOTA: I chimografi possono essere generati e analizzati utilizzando una varietà di programmi diversi. Descriviamo brevemente il software KymoAnalyzer (v. 1.01) disponibile gratuitamente utilizzando sei plug-in ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. Questi plugin possono essere scaricati dagli sviluppatori sul sito web del laboratorio Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Istruzioni più dettagliate sull'uso di questo software sono disponibili su questo sito.

1. Raggruppa i filmati generati nel passaggio 4.9 in base alle condizioni sperimentali e replicali. Eseguire la macro BatchKymographGeneration e selezionare la cartella appropriata. Disegna una polilinea del chimografo per tracciare l'assone a partire dall'estremità prossimale in quella particolare immagine. I chimografi risultanti vengono memorizzati nella cartella selezionata (Figura 2).
2. Assegnare manualmente le tracce eseguendo la macro Tracce, selezionando una singola cartella di filmati, selezionando Sì per aggiungere una traccia e quindi facendo clic per tracciare la traiettoria di ciascuna particella. Eseguire il clic iniziale nella parte superiore della traccia e fare nuovamente clic in ogni punto in cui la particella cambia velocità o direzione in modo che la polilinea si sovrapponga alla traccia della particella sul chimografo. Dopo aver posato la polilinea sull'intera traccia, fare clic su OK. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le tracce sono state assegnate.
3. Esegui le macro rimanenti, assegnando la frequenza dei fotogrammi e la dimensione dei pixel in base ai parametri di imaging. Innanzitutto, esegui CargoPopulation, quindi NetCargoPopulation e infine Segments. Immettere la dimensione in pixel e la frequenza dei fotogrammi dei filmati quando richiesto (0,22 μm e 28,7 fotogrammi/s, rispettivamente, con queste impostazioni). Infine, eseguire la macro poolData per calcolare e raggruppare i dati dei parametri di trasporto da tutti i chimografi nella cartella selezionata.
4. Tracciare i risultati dai file di dati e confrontare le varie condizioni con le repliche indipendenti rappresentate dai valori medi di tutti i neuroni analizzati all'interno di una condizione sperimentale per un singolo prelievo di neuroni.

Risultati

Utilizzando questi metodi, abbiamo caratterizzato il trasporto assonale in presenza di forme wild-type o correlate alla malattia della proteina tau per esaminare i potenziali meccanismi di neurotossicità patologica indotta dalla tau nella malattia^12,13. Il software KymoAnalyzer calcola e raggruppa una varietà di parametri diversi da tutti i chimografi all'interno di una determinata cartella. Le tariffe di trasporto sono calcola...

Discussione

Ci sono prove crescenti che più proteine patologiche associate a una varietà di malattie neurodegenerative interrompono il trasporto assonale veloce nei neuroni. Ciò rappresenta un potenziale meccanismo comune di neurotossicità in queste malattie. Per comprendere meglio il processo attraverso il quale queste proteine interrompono il trasporto, abbiamo bisogno di strumenti e modelli che ci permettano di affrontare domande specifiche. Il metodo qui descritto consente l'esame dei meccan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427