Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Résumé

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Résumé

Le transport bidirectionnel des cargaisons le long de l’axone est essentiel au maintien des synapses fonctionnelles, de la connectivité neuronale et des neurones sains. Le transport axonal est perturbé dans de multiples maladies neurodégénératives, et les neurones de projection sont particulièrement vulnérables en raison de la nécessité de transporter des matériaux cellulaires sur de longues distances et de maintenir une masse axonale substantielle. Les modifications pathologiques de plusieurs protéines liées à la maladie affectent négativement le transport, notamment la tau, la β amyloïde, la α-synucléine, la superoxyde dismutase et la huntingtine, fournissant un mécanisme commun potentiel par lequel les protéines pathologiques exercent une toxicité dans la maladie. Des méthodes d’étude de ces mécanismes toxiques sont nécessaires pour comprendre les troubles neurodégénératifs et identifier les interventions thérapeutiques potentielles.

Ici, des neurones primaires de l’hippocampe de rongeurs en culture sont co-transfectés avec plusieurs plasmides pour étudier les effets des protéines pathologiques sur le transport axonal rapide à l’aide de l’imagerie confocale de cellules vivantes de protéines cargo marquées par fluorescence. Nous commençons par la récolte, la dissociation et la culture des neurones primaires de l’hippocampe à partir de rongeurs. Ensuite, nous co-transfectons les neurones avec des constructions d’ADN plasmidique pour exprimer la protéine cargo marquée fluorescente et la protéine tau de type sauvage ou mutant (utilisée comme exemple de protéines pathologiques). Les axones sont identifiés dans les cellules vivantes à l’aide d’un anticorps qui se lie à un domaine extracellulaire de la neurofascine, une protéine du segment initial de l’axone, et une région axonale d’intérêt est imagée pour mesurer le transport de fret fluorescent.

À l’aide de KymoAnalyzer, une macro ImageJ disponible gratuitement, nous caractérisons de manière approfondie la vitesse, la fréquence de pause et la densité de cargaison directionnelle du transport axonal, qui peuvent toutes être affectées par la présence de protéines pathologiques. Grâce à cette méthode, nous identifions un phénotype d’augmentation de la fréquence des pauses de cargaison associé à l’expression de la protéine tau pathologique. De plus, des constructions de shRNA de silençage génique peuvent être ajoutées au mélange de transfection pour tester le rôle d’autres protéines dans la médiation de la perturbation du transport. Ce protocole est facilement adaptable pour être utilisé avec d’autres protéines liées à des maladies neurodégénératives et constitue une méthode reproductible pour étudier les mécanismes de perturbation du transport axonal par ces protéines.

Introduction

Les neurones dépendent du transport bidirectionnel de la cargaison le long de l’axone pour maintenir les synapses fonctionnelles et la connectivité neuronale. On pense que les déficits de transport axonal contribuent de manière essentielle à la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres tauopathies, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington ^1,2,3. En effet, les modifications pathologiques de plusieurs protéines liées à la maladie affectent négativement le transport (examiné dans ⁴). Il est nécessaire de développer des méthodes pour étudier les mécanismes par lesquels les protéines pathologiques exercent une toxicité dans la maladie afin de comprendre les troubles neurodégénératifs et d’identifier des cibles potentielles pour une intervention thérapeutique.

Plusieurs connaissances importantes sur le transport axonal, y compris la découverte de la kinésine conventionnelle, des voies dépendantes de la kinase et de la phosphatase régulant les protéines motrices, et des mécanismes par lesquels les protéines pathologiques perturbent la régulation du transport axonal, ont été réalisées à l’aide du modèle isolé de l’axoplasme de calmar ^4,5. La perfusion de l’axoplasme du calmar avec des formes pathologiques de la protéine tau inhibe le transport axonal rapide antérograde (FAT), un effet dépendant de l’exposition au domaine activateur de la phosphatase de tau, qui active la protéine phosphatase 1 (PP1)^6,7,8. PP1 active la glycogène synthase kinase 3 (GSK3), qui à son tour phosphoryle les chaînes légères de kinésine, provoquant la libération de cargaison. Une autre protéine pathologique de la MA est la β amyloïde. Les formes oligomères de β amyloïde inhibent la FAT bidirectionnelle par l’intermédiaire de la caséine kinase 2, qui phosphoryle les chaînes légères de kinésine⁹. De plus, la protéine huntingtine pathologique hébergeant une expansion de la polyglutamine et un mutant SOD1 familial lié à la SLA perturbent chacun le transport axonal dans l’axoplasme du calmar par l’activité de la protéine kinase N-terminale c-Jun et de la protéine kinase activée par les mitogènes p38, respectivement^10,11.

Bien que le modèle de l’axoplasme du calmar continue d’être un outil précieux pour comprendre les effets des protéines pathologiques sur le transport axonal, l’accès limité à l’équipement et aux échantillons empêche son utilisation plus large. Nous avons mis au point un test de transport utilisant l’imagerie par microscopie confocale de cellules vivantes de neurones primaires de rongeurs (souris et rats). Ce modèle représente une approche basée sur les neurones de mammifères, facilement adaptable et manipulable, utilisant des sources cellulaires et des systèmes de microscopie largement disponibles. Par exemple, une variété de protéines pathologiques (par exemple, hébergeant des modifications liées à la maladie) sont exprimées pour identifier comment des modifications spécifiques de ces protéines affectent le transport dans les axones. De même, une variété de protéines cargo marquées par fluorescence peuvent être utilisées pour examiner les changements spécifiques à la cargaison. De plus, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont étudiés relativement facilement en ciblant l’expression (c’est-à-dire l’inactivation ou la surexpression) de protéines sélectionnées qui peuvent médier ces effets. Cette méthode est également facilement adaptable pour les neurones primaires dérivés d’une grande variété de modèles animaux.

Nous présentons un protocole détaillé décrivant le test de transport axonal de cellules vivantes qui a été précédemment utilisé dans les neurones primaires de l’hippocampe pour montrer que les protéines tau mutantes associées aux démences lobaires frontotemporales ; P301L ou R5L tau) augmentent la fréquence de pause des protéines cargo marquées par fluorescence de manière bidirectionnelle¹². De plus, le renversement de l’isoforme PP1γ a sauvé les effets de pause¹². Cela fournit un soutien au modèle de perturbation pathologique induite par la protéine tau qui est médiée par l’activation aberrante d’une voie de signalisation initiée par PP1 comme décrit ci-dessus ^6,7,12. Dans une étude distincte, nous avons montré que la pseudophosphorylation de tau à S199/S202/T205 (le phosphoépitope pathogène AT8 pertinent pour les tauopathies) augmentait la fréquence des pauses de cargaison et la vitesse du segment antérograde. Ces effets dépendaient du domaine d’activation de la phosphatase N-terminale de tau¹³. Ces exemples soulignent l’utilité de ce modèle pour identifier les mécanismes par lesquels les protéines pathologiques perturbent le transport des axones dans les neurones des mammifères.

Cet article fournit une description détaillée de la méthode commençant par la récolte, la dissociation et la culture des neurones primaires de l’hippocampe de souris, suivie de la transfection des neurones avec des protéines cargo fusionnées avec une protéine fluorescente, et enfin, de l’approche d’imagerie et d’analyse d’images de cellules vivantes. Nous démontrons comment cette méthode est utilisée pour étudier les effets de la protéine tau modifiée sur le transport bidirectionnel de la protéine associée à la vésicule, la synaptophysine, à titre d’exemple. Cependant, il existe une flexibilité dans la protéine pathogène et la protéine de transport d’intérêt, ce qui en fait une approche polyvalente pour étudier le transport axonal.

Protocole

Ces protocoles ont été approuvés par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été appliqué avec succès à des souris Tau Knockout dans le fond C57BL/6J et à des rats Sprague Dawley de type sauvage. D’autres souches devraient également être acceptables.

1. Prélèvement de neurones primaires de l’hippocampe

1. Enduire une lame de chambre inférieure en verre à 4 puits avec de la poly-d-lysine (PDL) filtrée à 0,5 mg/mL dans un tampon de borate (12,5 mM de borate de sodium décahydraté et 50 mM d’acide borique). Ajouter 750 μL/puits et incuber à température ambiante pendant la nuit.
2. Lavez la lame de chambre 4 fois avec de l’eau déminéralisée stérile. Sécher à l’air libre après le dernier lavage et conserver à 4 °C pour un stockage à court terme (<1 semaine).
   REMARQUE : Ne laissez pas le PDL sécher sur la lame avant et entre les lavages car cela est toxique pour les cultures. Nous constatons que le stockage à long terme des lames recouvertes de PDL peut affecter la santé neuronale et que le maintien d’intervalles cohérents entre l’enrobage et le placage réduit la variabilité de la viabilité de la culture entre les cycles.
3. Obtenez une souris ou un rat enceinte à retardement.
   REMARQUE : Les animaux en gestation peuvent être commandés auprès de diverses entreprises ou élevés en interne. Le jour zéro embryonnaire fait référence au jour où le plug vaginal est trouvé, et nous avons réussi à cultiver des neurones primaires de l’hippocampe et du cortical de souris E16-18 avec cette approche. Les neurones du rat sont également récoltés au 18e jour embryonnaire.
4. À E18, euthanasier la femelle enceinte selon une méthode approuvée. Coupez à travers la paroi abdominale et retirez les deux cornes utérines. Transférez-les dans une boîte de Pétri contenant 0,9 % de solution saline glacée. Rincez jusqu’à ce que la solution saline soit propre.
   REMARQUE : Nous administrons une surdose de pentobarbital sodique (au moins 100 mg / kg) par injection intrapéritonéale.
5. Décapitez les chiots. En commençant par le foramen magnum (l’ouverture à l’arrière du crâne), utilisez des ciseaux de microdissection pour couper la peau et le crâne le long de la ligne médiane, en inclinant la pointe inférieure des ciseaux contre la partie interne du crâne pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
6. Retirez la peau sus-jacente et retirez soigneusement le crâne pour exposer le cerveau.
7. Utilisez des pinces pour tenir la bouche / le nez et tournez le crâne de manière à ce que le cerveau soit tourné vers le bas au-dessus d’une boîte de Pétri remplie de solution saline à 0,9%. Retournez le cerveau hors du crâne et coupez les nerfs et le tronc cérébral pour libérer le cerveau dans la solution saline.
8. Placez la boîte de Pétri sous un microscope de dissection pour la dissection de l’hippocampe. Insérez des ciseaux dans la ligne médiane du cerveau, inclinez les ciseaux de manière à ce que la lame supérieure pousse l’un des hémisphères cérébraux vers l’extérieur et coupez pour séparer l’hémisphère des régions sous-corticales.
9. Faites une coupe verticale à travers le cortex de sorte que le cortex frontal soit antérieur et l’hippocampe est postérieur au site de coupe. Insérez la pointe inférieure des ciseaux dans le trou résultant et coupez soigneusement le long de l’apex du cortex en vous arrêtant à l’extrémité postérieure.
10. À l’aide de la pince, balancez délicatement le cortex et terminez la coupe postérieure. L’hippocampe doit ressembler à un croissant. Coupez soigneusement le cortex restant afin que l’hippocampe conserve sa forme arrondie et en croissant.
11. À l’aide d’une pince et de ciseaux, retirez délicatement les méninges de l’hippocampe.
    REMARQUE : Il est important d’enlever toutes les méninges du cerveau pour réduire le nombre de cellules non neuronales qui sont collectées tout en s’abstenant d’endommager ou de déchirer le tissu de l’hippocampe.
12. Coupez l’hippocampe en quatre morceaux égaux et placez le tissu dans un tube conique de 15 ml rempli d’un tampon glacé sans calcium ni magnésium (CMF ; PBS de Dulbecco avec 0,1 % de glucose, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 50 μg/mL de gentamicine).
    REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, prélevez l’hippocampe de 5 à 10 petits par dissociation. Chaque hippocampe devrait fournir environ 300 000 cellules pour les souris et 500 000 cellules pour les rats.

2. Dissociation et placage des neurones primaires de l’hippocampe

1. Retirez le CMF à l’aide d’une pipette Pasteur et rincez le tissu avec du CMF 4x frais et froid, en remuant doucement entre les rinçages.
2. Retirer le CMF et ajouter 3 mL de solution de trypsine filtrée à 0,125 % (diluer la trypsine à 2,5 % dans du CMF préchauffé à [37 °C]). Incuber le tissu pendant exactement 15 min à 37 °C ; Agitez doucement toutes les 5 min.
   REMARQUE : Préparez la solution de trypsine immédiatement avant utilisation.
3. Préparez 5 mL de solution d’inactivation de la trypsine (TIS ; Solution saline équilibrée de Hanks, 20 % de sérum de veau nouveau-né et 1 solution de DNase I [10 x stock : 5 mM d’acétate de sodium, 1 μM de chlorure de calcium, 0,5 mg/mL de DNase I]).
4. Retirez la solution de trypsine et lavez-la 2 fois avec du CMF froid. Ajouter 3 mL de TIS froid.
5. Dissocier les cellules par trituration à l’aide d’une seringue de 3 mL avec des aiguilles de plus en plus petites : triturer 30 fois à l’aide d’une aiguille de 14 G, 30 fois à l’aide d’une aiguille de 15 G, 20 fois à l’aide d’une aiguille de 16 G, 20 fois à l’aide d’une aiguille de 18 G et 15 fois à l’aide d’une aiguille de 21 G. Utilisez des tirages de 2 s avec les quatre premières aiguilles et des tirages de 3 s avec l’aiguille de 21 G.
   REMARQUE : D’autres méthodes de trituration (par exemple, des pipettes en verre poli au feu^{14, 15}) peuvent également être utilisées. Nous constatons que l’utilisation d’aiguilles de seringue métalliques normalisées réduit considérablement la variabilité de l’agglutination et de la viabilité des cellules.
6. À l’aide de l’aiguille de 21 G, placez une gouttelette de la suspension cellulaire sur une lame de microscope et vérifiez qu’il n’y a pas d’amas de cellules. Si plusieurs amas sont observés, triturez trois fois de plus à l’aide d’une aiguille de 22 G et vérifiez à nouveau. Répétez ce processus jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire homogène, en prenant soin de triturer doucement tout au long du processus.
7. Filtrer 5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Superposez doucement la suspension cellulaire sur le FBS dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules (200 × g à 4 °C) pendant 5 min.
8. Retirez autant de FBS que possible sans perturber la pastille. Mettre en suspension dans 1 mL de milieu neurobasal chaud (37 °C) sans antibiotiques (NBM ; complété par 1x substitut de glutamine et 1x B-27).
9. Diluer la suspension cellulaire dans du bleu de trypan (0,4 %) et obtenir une numération cellulaire.
   REMARQUE : Une dilution de 1:1 fonctionne bien pour un compteur de cellules automatique et utilisez une dilution de 1:60 pour le comptage manuel avec un hémacytomètre. Pour passer à la placage cellulaire, la viabilité des neurones doit être supérieure à 90 % à ce stade. Cela augmente considérablement la probabilité d’une culture de neurones sains après dissociation.
10. Plaquez les cellules à une densité de 175 000 cellules/puits (70 000 cellules/mm²) dans une lame de chambre à quatre puits préchauffée recouverte de PDL dans 750 μL de NBM sans antibiotique. De plus, mettre en plaque 200 000 cellules/puits dans quatre puits d’une plaque de 24 puits recouverte de PDL dans 1,5 mL de NBM sans antibiotique pour utilisation comme milieu conditionné dans la transfection décrite à la section 3. Incuber les cellules dans une chambre à humidité contrôlée, à 37 °C et à 5 % de CO₂ .
    REMARQUE : La densité des cellules peut être ajustée en fonction des résultats. Des densités élevées peuvent rendre plus difficile l’imagerie des neurones, tandis que de faibles densités peuvent affecter négativement la santé de la culture et la survie des neurones. D’après notre expérience, les neurones de rat peuvent être plaqués à une densité inférieure à celle des neurones de souris.

3. Transfection des neurones

REMARQUE : Les neurones peuvent être transfectés sur DIV 7 ou DIV 8 sans changements notables dans l’efficacité de la transfection ou les résultats de transport. Ces volumes sont pour quatre puits d’une lame de chambre à fond de verre à quatre puits d’un volume/puits de 750 μL. Ce protocole décrit la transfection à l’aide de réactifs de transfection lipidique. Laissez le milieu et les réactifs de transfection se réchauffer à température ambiante avant de l’utiliser.

1. Préparez le réactif de transfection en ajoutant 4,4 μL de réactif de transfection à 127,6 μL de milieu à sérum réduit. Balancer doucement à la main pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min.
2. Préparez les stocks d’ADN pendant l’incubation par transfection lipidique. Ajouter 200 ng d’ADN cargo fluorescent (pFIN mApple-synaptophysine ; 12 112 paires de bases) et 200 ng d’ADN pour exprimer la protéine d’intérêt (les plasmides tau utilisés étaient des constructions pCMV tau-Flag ; 5 036 paires de bases) dans un milieu sérique réduit ou sans sérum jusqu’à un volume final de 32 μL¹². Ajouter 0,8 μL de réactif d’amplification de transfection (2 μL par μg d’ADN). Bien mélanger à la main.
   REMARQUE : Nous constatons qu’un dérivé de RFP fonctionne mieux (mApple ou mCherry), mais GFP peut également être utilisé. De plus, une construction d’ADN pour exprimer un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) de silençage génique peut être incluse pour tester les mécanismes des phénotypes observés avec l’expression de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, incluez 150 ng de chacune des trois constructions d’ADN dans le mélange d’ADN et ajustez la quantité de réactif d’amplification de transfection en conséquence. La modification des paramètres de l’ADN ou du réactif de lipofection peut affecter l’efficacité de la transfection et peut être ajustée en fonction de la nécessité de transfections plus ou moins efficaces.
3. Ajouter 32 μL de mélange de transfection lipidique dans chaque tube d’ADN. Balancer doucement à la main pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
4. Ajoutez lentement 64 μL de mélange ADN/réactif de transfection aux cellules en plaçant la pointe de la pipette juste sous la surface du milieu et en la déplaçant dans un mouvement serpentin dans tout le puits. Secouez doucement la lame de chambre à la main 3 fois après l’avoir ajoutée à tous les puits pour mélanger davantage et placez la lame de chambre dans l’incubateur. Incuber à 37 °C et 5% CO₂ pendant 2 h.
   REMARQUE : Minimisez le temps que les neurones passent à l’extérieur de l’incubateur, car ils sont très sensibles aux changements de température et de pH, qui peuvent se produire rapidement.
5. Effectuer un demi-changement moyen 2 h après la transfection avec un milieu conditionné + anticorps Neurofascin. Immédiatement avant le changement de milieu, mettez en pool 1,5 mL de NBM conditionné sans antibiotiques à partir des cellules cultivées sur la plaque à 24 puits. Ajouter 0,75 μL d’anticorps Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) au milieu conditionné.
   REMARQUE : L’anticorps NF-186 détecte un domaine extracellulaire de la neurofascine qui est enrichi dans le segment initial de l’axone (AIS) afin d’identifier définitivement l’axone pour l’imagerie.
6. Effectuer un changement complet de milieu 18 h après la transfection avec un milieu conditionné contenant l’anticorps secondaire. Ajouter 1 μL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à AlexaFluor 647 à 3 mL de NBM conditionné (sans antibiotique) provenant de la plaque de 24 puits. Bien mélanger.

4. Imagerie neuronale

1. Préparez-vous à l’imagerie 2 jours après la transfection. Réchauffez la chambre de cellules vivantes pour le microscope confocal à 37 °C (y compris l’objectif 60x et l’huile de l’objectif) et équilibrez la chambre à 5 % de CO₂.
2. Utilisez un objectif à fort grossissement et une chambre de cellules vivantes pour imager les cellules.
   REMARQUE : Nous utilisons un objectif 60x 1,40 NA sur un microscope confocal à balayage laser, mais d’autres systèmes de microscopie à fluorescence confocale (par exemple, disque rotatif) ou à champ large peuvent également être utilisés s’ils sont capables d’atteindre des fréquences d’images élevées.
3. Identifiez visuellement les neurones transfectés dans le canal contenant la protéine cargo à l’aide des oculaires. Ensuite, imagez les neurones pour identifier l’AIS dans le canal Cy5 (Figure 1).
4. Réglez le champ de vision sur une boîte rectangulaire de 32 pixels par 128 pixels et déplacez-le pour imager une région de l’axone distale de ~50-150 μm par rapport à l’AIS. Notez et enregistrez la directionnalité du transport de marchandises et l’orientation du retour sur investissement. Les points sur la boîte apparaîtront respectivement en haut et à droite de toutes les images et vidéos suivantes. Enregistrez le côté de l’image le plus proche du corps de la cellule et celui le plus proche de l’extrémité axonale afin que la polyligne du kymographe à l’étape 5.1 puisse être dessinée avec la bonne orientation.
   REMARQUE : Lors de la sélection de la région d’intérêt, la zone imagée d’un axone isolé doit être relativement droite et couper le champ de vision à chaque extrémité. L’ensemble du segment doit se trouver dans le même plan focal. La zone doit clairement indiquer le transport actif de marchandises. Les neurones excessivement brillants expriment généralement la protéine cargo et les protéines d’intérêt à des niveaux susceptibles d’être toxiques pour le neurone et doivent être évités.
5. Réglez la puissance du laser 561 sur 1,40, le sténopé sur 7,8, la taille sur 128 px² et la vitesse sur 32 images/s. Ajustez le gain pour visualiser le transport de vésicules de fret individuelles sans qu’il ne soit obscurci par le signal de fond (généralement entre 10 et 50 donne des kymographes de haute qualité).
   REMARQUE : La puissance laser extrêmement faible est réalisable grâce à des détecteurs GaAsP très sensibles et empêche les effets phototoxiques potentiels et le photoblanchiment des marchandises en mouvement. La taille du sténopé est réglée aussi large que possible pour augmenter la profondeur focale afin de garantir que l’ensemble du retour sur investissement est imagé, car l’axone peut ne pas reposer parfaitement à plat sur la surface de la lame.
6. Définissez le retour sur investissement en sélectionnant Dessiner un retour sur investissement rectangulaire... dans le menu déroulant ROI . Dessinez le retour sur investissement de manière à ce qu’il couvre l’ensemble du champ de vision. Faites un clic droit sur le retour sur investissement et sélectionnez Utiliser comme retour sur investissement de stimulation : S1.
7. Préparez la configuration ND en incluant les étapes suivantes dans l’onglet Configuration ND.
   REMARQUE : Il s’agit du protocole d’acquisition en cinq étapes qui est configuré une fois et qui sera ensuite exécuté par le logiciel chaque fois que les films sont collectés.
   1. Acquérir l’image pour collecter l’image de référence de préstimulation.
   2. Stimulation; ROI : S1 ; Intervalle : NoDelay ; Durée 1,64 s, Boucles : 7. Cette étape permet de blanchir la fluorescence de fond avec plusieurs impulsions du laser.
   3. Acquérir l’image. Cette étape permet de collecter une image de référence de post-stimulation.
   4. Attendre ; Aucune action ; 2 min. Cette étape prévoit une période de récupération pour la cargaison fluorescente afin de repeupler le retour sur investissement blanchi.
   5. Acquisition; Intervalle : NoDelay ; Durée 5 min, Boucles : 8 615. Cette étape collecte les images à la vitesse maximale pendant la période d’imagerie de 5 minutes.
8. Une fois le protocole de configuration ND configuré, cliquez sur le bouton Appliquer les paramètres de stimulation dans l’onglet Configuration ND . Cliquez sur Exécuter maintenant lorsque vous êtes prêt à imager le transport de marchandises. Cela lancera le protocole d’acquisition ND à partir de l’étape 4.7.
   REMARQUE : Bien que la fréquence d’images soit réglée sur 32 images/s, la fréquence d’images pratique peut être plus lente (~28,7 images/s). Cette valeur doit être enregistrée pour une analyse kymographe précise dans la section 5. Idéalement, l’imagerie du transport de cellules vivantes est réalisée avec la fréquence d’images la plus rapide possible (par exemple, >25 images/s) pour mieux déchiffrer les mouvements de fret.
9. Réinitialisez le champ de vision sur l’ensemble de l’image ; ensuite, collectez et enregistrez une image du neurone complet dans les canaux 561 et 647 avec la boîte ROI incluse. Enregistrer les coordonnées XY où l’image a été prise pour la confirmation post-fixation de l’expression de la protéine d’intérêt.
10. Collectez des vidéos de transport d’au moins deux neurones pour analyse. Assurez-vous que chaque réplique indépendante provient des moyennes des variables mesurées à partir d’une récolte individuelle de neurones primaires (c’est-à-dire pas de neurones individuels).
    REMARQUE : Pour une récolte de neurones primaires donnée, nous collectons des vidéos de 2 à 4 neurones par condition.
11. Fixez les cellules en retirant le milieu et en les incubant avec du paraformaldéhyde préchauffé à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Retirez le tampon et lavez les cellules pendant 3 x 5 min chacune dans TBS.
    REMARQUE : Pour la fixation du paraformaldéhyde, nous utilisons un tampon de cytosquelette, un tampon commun qui maintient la structure du cytosquelette (10 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique [MES], 138 mM de KCl, 3 mM de MgCl₂ et 4 mM d’EGTA, pH 6,1). D’autres tampons (par exemple, TBS, PBS) peuvent également être utilisés pour la fixation.
12. Confirmer que les neurones analysés expriment à la fois la protéine d’intérêt et la protéine cargo marquée par fluorescence par coloration par immunocytofluorescence. Coloration pour la tau humaine (Tau12) pour confirmer l’expression exogène de tau et la tubuline β-III (Tuj1) pour vérifier que les neurones sont restés sains tout au long du processus d’imagerie.
    REMARQUE : Nous observons la co-expression des deux constructions d’ADN dans presque toutes les cellules transfectées en utilisant ces méthodes.

5. Générer et analyser des kymographes

REMARQUE : Les kymographes peuvent être générés et analysés à l’aide d’une variété de programmes différents. Nous décrivons brièvement le logiciel KymoAnalyzer (v. 1.01) disponible gratuitement à l’aide de six plugins ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. Ces plugins peuvent être téléchargés auprès des développeurs sur le site Web du laboratoire Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Des instructions plus détaillées sur l’utilisation de ce logiciel peuvent être trouvées sur ce site.

1. Regroupez les vidéos générées à l’étape 4.9 en fonction des conditions expérimentales et répétez-les. Exécutez la macro BatchKymographGeneration et sélectionnez le dossier approprié. Tracez une polyligne kymographe pour tracer l’axone en commençant par l’extrémité proximale dans cette image particulière. Les kymographes résultants sont stockés dans le dossier sélectionné (Figure 2).
2. Attribuez des pistes manuellement en exécutant la macro Pistes, en sélectionnant un dossier de film individuel, en sélectionnant oui pour ajouter une piste, puis en cliquant pour suivre la trajectoire de chaque particule. Effectuez le clic initial en haut de la piste et cliquez à nouveau à chaque point où la particule change de vitesse ou de direction de sorte que la polyligne superpose la trace de la particule sur le kymographe. Une fois la polyligne posée sur l’ensemble de la piste, cliquez sur OK. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les pistes soient attribuées.
3. Exécutez les macros restantes, en attribuant la fréquence d’images et la taille des pixels en fonction des paramètres d’imagerie. Tout d’abord, exécutez CargoPopulation, puis NetCargoPopulation, puis Segments. Entrez la taille de pixel et la fréquence d’images des vidéos lorsque vous y êtes invité (0,22 μm et 28,7 images/s, respectivement, avec ces paramètres). Enfin, exécutez la macro poolData pour calculer et regrouper les données des paramètres de transport de tous les kymographes du dossier sélectionné.
4. Tracez les résultats des fichiers de données et comparez les différentes conditions avec les réplicats indépendants représentés par les valeurs moyennes de tous les neurones analysés dans une condition expérimentale pour une récolte de neurones individuelle.

Résultats

À l’aide de ces méthodes, nous avons caractérisé le transport axonal en présence de formes de protéine tau de type sauvage ou liées à une maladie afin d’examiner les mécanismes potentiels de neurotoxicité pathologique induite par la protéine tau dans la maladie^12,13. Le logiciel KymoAnalyzer calcule et regroupe une variété de paramètres différents de tous les kymographes dans un dossier donné. Les tarifs de tr...

Discussion

Il existe de plus en plus de preuves que de multiples protéines pathologiques associées à une variété de troubles neurodégénératifs perturbent le transport axonal rapide dans les neurones. Cela représente un mécanisme commun potentiel de neurotoxicité à ces maladies. Pour mieux comprendre le processus par lequel ces protéines perturbent le transport, nous avons besoin d’outils et de modèles qui nous permettent de répondre à des questions spécifiques. La méthode décri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427