Modelo experimental de periimplantitis inducida por ligadura en ratones

Resumen

Este es un informe sobre un modelo experimental de periimplantitis inducida por ligadura en ratones. Describimos todos los pasos quirúrgicos, desde el manejo pre y postoperatorio de los animales, las extracciones, la colocación de implantes y la periimplantitis inducida por ligaduras.

Resumen

Los implantes dentales tienen una alta tasa de éxito y supervivencia. Sin embargo, las complicaciones como la periimplantitis (PI) son muy difíciles de tratar. La PI se caracteriza por la inflamación de los tejidos que rodean los implantes dentales con pérdida progresiva del hueso de soporte. Para optimizar la longevidad de los implantes dentales en términos de salud y funcionalidad, es crucial comprender la fisiopatología de la periimplantitis. En este sentido, el uso de modelos de ratón en la investigación ha demostrado claros beneficios en la recreación de circunstancias clínicas. El objetivo de este estudio fue describir un modelo experimental de periimplantitis inducida por ligaduras en ratones y determinar si existe efectividad en la inducción de esta enfermedad, dados los cambios óseos y tisulares observados. La inducción experimental de periimplantitis comprende los siguientes pasos: extracción de dientes, colocación de implantes e IP inducida por ligadura. Una muestra de dieciocho ratones machos C57BL/6J de 3 semanas de edad se dividió en dos grupos, ligadura (N = 9) y control sin ligadura (N = 9). Se realizó la evaluación de factores clínicos, radiográficos e histológicos. El grupo con ligadura mostró una pérdida ósea significativamente mayor, un aumento del edema de tejidos blandos y una migración epitelial apical que el grupo sin ligadura. Se concluyó que este modelo preclínico puede inducir con éxito periimplantitis en ratones.

Introducción

Los implantes dentales son cada vez más frecuentes como una opción deseable para^{reemplazar los dientes} perdidos. Se prevé que la prevalencia de implantes dentales en la población adulta de EE. UU. aumente hasta un 23% para 2026². Según un informe de análisis de mercado de Grand View Research (2022), se proyectó que el tamaño del mercado global de implantes dentales alcanzaría aproximadamente US $ 4.6 mil millones en 2022. Además, se prevé que muestre una tasa de crecimiento anual constante de alrededor del 10% hasta el año 2030³. Desafortunadamente, el uso de implantes dentales puede provocar complicaciones, como la periimplantitis. La periimplantitis se ha definido como una afección inducida por biofilm caracterizada por la inflamación de la mucosa periimplantaria y la consiguiente pérdida progresiva del hueso de soporte⁴.

Una revisión sistemática encontró que la prevalencia media de periimplantitis fue del 19,53% (intervalo de confianza [IC] del 95%, 12,87 a 26,19%) a nivel del paciente y del 12,53% (IC del 95%: 11,67 a 13,39%) a nivel del implante⁵. La periimplantitis representa un problema de salud pública creciente, debido al aumento del fracaso de los implantes y, en consecuencia, a los costes sustanciales del tratamiento⁶.

Comprender la patogénesis de la periimplantitis es crucial para desarrollar un enfoque sistemático que prevenga su aparición y progresión y maximice la longevidad de los implantes dentales en términos de estética y función ^7,8. En este sentido, el uso de modelos murinos en la investigación odontológica ha demostrado ser ventajoso, dado que los ratones comparten más del 95% de sus genes con los humanos ^9,10, el número de bases de datos genéticas disponibles en línea y la capacidad de reproducir escenarios clínicos¹¹. Todas las ventajas descritas permiten la disección de los mecanismos genéticos en diferentes enfermedades¹², el alojamiento y el manejo accesibles, y los anticuerpos ampliamente disponibles como paneles humanos, más allá de la disponibilidad de modificación genética (por ejemplo, knockout y sobreexpresión) para la evaluación del tejido inflamatorio y el mapeo de la enfermedad¹³. Aunque es ventajoso, hay pocas publicaciones que aborden la periimplantitis en ratones. Esto se debe, entre otros, a retos metodológicos, entre los que se encuentra la dificultad para obtener miniimplantes o instalarlos.

Para desarrollar periimplantitis en ratones, se han descrito muchos protocolos, como la periimplantitis inducida por ligaduras, la periimplantitis inducida por bacterias¹⁴, la periimplantitis¹⁵ inducida por lipopolisacáridos (LPS) o la combinación de LPS + periimplantitis inducida por ligaduras¹⁶. Aquí, nos centraremos en el modelo de ligadura porque es el método más aceptado para inducir periodontitis 17,18,19 y, más recientemente, periimplantitis^20,21. La ligadura colocada alrededor de los implantes en posición submucosa estimula la acumulación de placa y, en consecuencia, la inflamación de los tejidos. Por lo tanto, el desarrollo de este enfoque se basa en la indicación de una técnica viable de costo-beneficio para investigaciones preclínicas en enfermedades periimplantarias. Este estudio tiene como objetivo describir un modelo experimental de periimplantitis inducida por ligaduras en ratones y determinar si existe efectividad en la inducción de esta enfermedad dados los cambios óseos y tisulares observados.

El objetivo general de este artículo es reportar el protocolo aplicado para inducir periimplantitis en ratones por ligadura y observar su efectividad a través de la evaluación de tejidos y pérdida ósea alrededor de los implantes.

Protocolo

Los procedimientos que involucran a sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller de la Universidad de California, Los Ángeles (número de protocolo ARC 2002-125), y el Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE)²². Para este método, se utilizaron dieciocho ratones machos C57BL/6J de 3 semanas de edad y se sometieron a extracciones dentales, colocación de implantes e inducción de periimplantitis. Todos los procedimientos odontológicos se realizaron con un aumento microscópico del 10× y fueron realizados por operadores entrenados y calibrados (Figura 1A).

1. Pasos previos a la extracción

1. Realizar el procedimiento en un quirófano cumpliendo con todas las normas de bioseguridad y protección.
2. Realizar asepsia de todas las superficies con triple fricción utilizando una solución de alcohol isopropílico al 70%.
3. Anestesiar ratones machos C57BL/6J de 3 semanas de edad con isoflurano al 3%. Verifique la falta de respuesta a la pata que se retira al tacto para asegurarse de que se obtenga suficiente profundidad anestésica.
4. Para evitar interferir con los procedimientos en la boca, use una nariz para mantener la anestesia con isoflurano.
5. Contar con un operador auxiliar para estabilizar al animal y mantener la apertura de la boca (Figura 1B).
6. Aplicar lubricante oftálmico, para evitar la irritación en los ojos antes de iniciar la extracción.

Figura 1: Adaptaciones operativas: (A) Aumento microscópico. (B) Sistema de anestesia inhalatoria adaptado y estabilización para la apertura de la boca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Extracción dental

1. Para extracciones dentales, introduzca un explorador dental #5 entre el primer y el segundo molar para iniciar los procedimientos de elevación y luxación moviendo el instrumento en la dirección mesio-distal hasta que el diente se mueva en el alvéolo (Figuras 2A).
2. A continuación, introduzca el explorador dental #5 en el sitio mesial del primer molar. Haga esto moviendo el instrumento en la dirección mesio-distal hasta que el diente se mueva en el alvéolo.
3. Después de la elevación, use las pinzas de punta y las pinzas de sutura para quitar el^1er molar.
4. A continuación, introduzca el explorador dental entre el^2º y el^3º molar para elevar y luxar el^2º molar (Figura 2B).
5. Luego, use las pinzas de punta y/o las pinzas de sutura para extraer el diente usando los instrumentos para sostenerlo y sacarlo de la boca. (Figura 2C).
6. Después de las extracciones dentales, asegúrese de lograr la hemostasia completa utilizando una punta de algodón estéril (Figura 2D) durante 1 minuto (Figura 2E, F).
7. Inmediatamente después de la extracción, proporcionar a todos los animales analgésicos (Carprofeno/Rimadyl 5 mg/kg) cada 24 h. Administrar el medicamento a través de una inyección subcutánea.
8. Además, sustituya la comida habitual por una dieta blanda. Administrar el antibiótico (Amoxil 0,25 mg/mL) por vía oral incorporando el medicamento en el agua de bebida. Haga esto durante cuatro semanas después de las extracciones.

Figura 2: Secuencia inicial de extracción: (A, B) Región maxilar con 1º y 2º molar y uso de explorador dental para elevación y luxación. (C) Uso de las pinzas de punta y el explorador para la luxación y la extracción de dientes. d) Hemostasia. (E, F) Aspecto alveolar después de extracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Colocación del implante

1. Con una cuchilla de 15c, cree una incisión mesiodistal a través del tejido queratinizado en el área correspondiente a los dientes previamente presentes. Utilice los molares maxilares derechos como referencia espacial (Figura 3A).
2. Levante los colgajos bucales y palatinos de espesor completo utilizando un explorador dental #5, asegurando la elevación completa del colgajo (Figura 3B).
3. Realice la osteotomía utilizando un micro taladro manual de carburo de 0,3 mm de diámetro unido a un Pin Vise (taladro manual) y actívelo en el sentido de las agujas del reloj. Cree sitios de osteotomía con aproximadamente 1 mm de profundidad en los alvéolos de extracción cicatrizados (Figura 3C).
4. Coloque los implantes en forma de tornillo diseñados a medida con una superficie mecanizada lisa (1,0 mm de largo y 0,5 mm de diámetro) fabricados a partir de varillas de titanio 6AL4V (Figura 3D), uno por animal, autorroscantes en la región del primer y segundo molar maxilar izquierdo con un movimiento de atornillado en el sentido de las agujas del reloj (Figura 3E-I).
5. Inmediatamente después de la colocación del implante, administrar analgésicos (Carprofeno/Rimadyl 5 mg/kg cada 24 h) mediante inyección subcutánea.
6. Deje que los implantes cicatricen durante cuatro semanas, tiempo durante el cual administre antibióticos y aliméntelos como se describió anteriormente.
7. Al final del período de curación, asegúrese de que la herida mucosa esté completamente cerrada y tenga una apariencia rosa clara.

Figura 3: Secuencia de colocación del implante: (A) Incisión con una cuchilla de 15c unida al mango. (B) Colgajos de espesor completo usando el explorador dental # 5. (C) Osteotomía con un microtaladro manual de carburo de 0,3 mm unido a un tornillo de banco. (D) Implante dental de titanio. (E, F) Soporte del implante y soporte del implante. (G- I) Colocación del implante mediante un movimiento de atornillado en el sentido de las agujas del reloj. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Inducción de periimplantitis

1. Coloque una ligadura de seda (6-0) alrededor de cada accesorio inmediatamente apical a la cabeza del implante contorneando la superficie del implante y fijándolo con un nudo doble. Mantener la ligadura durante dos semanas permitiendo el desarrollo de la periimplantitis.
2. Revise las ligaduras cada dos días para asegurarse de que todavía estén presentes. Si falta, coloque una nueva ligadura.

Figura 4: Secuencia de periimplantitis inducida por ligadura. (A-D) Ligadura de seda (6.0) colocada alrededor de la cabeza del implante. (E-G) Cierre de nudos. (H) Corte de ligadura. (I) Comparecencia final. Imágenes clínicas obtenidas de animales vivos bajo sedación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Sacrificio

1. Después del período de inducción de la periimplantitis (dos semanas), sacrificar a todos los animales con una alta concentración de isoflurano inhalado, seguido de un método secundario de luxación cervical con una varilla presionada en la base del cráneo y tirando rápidamente de las extremidades posteriores, provocando la separación de las vértebras cervicales del cráneo.
2. Separe los maxilares con instrumentos afilados, como tijeras quirúrgicas, que separarán toda la mandíbula del animal del resto del cuerpo.
3. Fotografíe los maxilares con un microscopio óptico, fíjelo en formalina al 10% durante 24 h, luego guárdelo en etanol al 70%.

6. Microtomografía computarizada (μCT)

1. Gammagrafía de los maxilares como se ha descrito anteriormente^18,19 mediante microtomografía computarizada (micro-TC).
2. Encienda el escáner y la computadora, luego abra el software de escaneo, haga clic en el signo de radiación y espere 15 minutos para precalentarlo.
3. Abra la puerta del equipo haciendo clic en el icono de la puerta.
4. Usa una mesa giratoria del tamaño de una moneda de veinticinco centavos. Coloque el maxilar en un tubo cónico de 15 ml. Fije el tubo en la base de la mesa giratoria. Coloque la mesa giratoria en el tornillo del equipo.
5. Cierre la puerta del equipo haciendo clic en el icono de la puerta.
6. Encienda la fuente de rayos X.
7. Haga clic en el icono de captura de imagen y asegúrese de que el hueso esté en el campo.
8. Ajuste una resolución de tamaño de píxel de 10 μm, energía de rayos X de 55 KVp y 181 μA, filtro de IA 0,5 mm, paso de rotación 0,4, fotograma medio 10. Esta configuración generará un tiempo de escaneo estimado de 24 minutos.
9. Inicie la adquisición.
10. Para la reconstrucción, abra el software de reconstrucción. Utilice un endurecimiento de viga del 20%. Usa un artefacto de anillo del 5%. Utilice un rango dinámico de 0-0,13. Anule la selección de la etiqueta ON. Haga clic en Vista previa. Elija la vista adecuada que se ve para la región de interés y guárdela como TIFF.
11. Orientar las imágenes obtenidas mediante software para la visualización y análisis de datos. Hacer que el eje longitudinal de la cabeza del implante sea paralelo a los ejes sagital y coronal y perpendicular al eje axial.
12. Guarde la imagen sagital como una sola imagen para el análisis óseo lineal.
13. Guarde la imagen transaxial como un conjunto de datos para el análisis óseo volumétrico.
14. Realice análisis óseos lineales utilizando el software de análisis de datos. Mida las distancias en milímetros entre la cabeza del implante y el hueso alveolar en los planos sagital y coronal, incluidos los sitios mesial, distal, bucal y palatino.
15. Realice análisis óseos volumétricos utilizando un software de análisis de datos. Realice un seguimiento de la pérdida ósea alrededor de los implantes dibujando la región de interés en todas las diapositivas correspondientes a la pérdida ósea.

7. Análisis estadístico

1. Mida la pérdida ósea microtomográfica lineal y volumétrica y normalice estos valores dividiendo cada valor por el promedio del grupo control. Presentar un promedio para todos los grupos, como media ± error estándar de la media (SEM).
2. Compare la significación mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) seguido de una prueba de Tukey con un intervalo de confianza del 95%. (Prisma 5). Aplique los niveles de significación de la siguiente manera: p≤0.01**, p≤0.001****.

Resultados

Para este método, se utilizaron dieciocho ratones machos C57BL/6J de 3 semanas de edad y se sometieron a extracciones dentales, colocación de implantes e inducción de periimplantitis. Hubo nueve animales por grupo, lo cual fue estadísticamente significativo, considerando la pérdida ósea lineal alcanzando un 80% de potencia, un 15% de desviación estándar (σ) y un intervalo de confianza del 95% (α = 0,05). Los ratones fueron alimentados con una dieta blanda ad libitum durante el experimento. Nueve ratone...

Discusión

Este protocolo presenta un informe descriptivo sobre los procedimientos quirúrgicos para la inducción de periimplantitis utilizando un modelo de ligadura en ratones. Trabajar con ratones tiene ventajas, como ser costo-efectivo, la disponibilidad de un extenso conjunto genético dados los múltiples antecedentes²³ entre otros aspectos^24,25. A lo largo de los años, varios estudios han utilizado con éxito ratones en los campos médico y d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 dental explorer	Hu-Friedy, Chicago, IL	392-0911	Dental luxation
15c blade and surgical scalpel	Henry Schein Inc., Melville, NY	1126186	Tissue incision
6-0 silk ligatures	Fisher Scientific, Hampton, NH	NC9201232	Ligature
Amoxicillin 50μg/mL	Zoetis, San Diego, CA	TS/DRUGS/57/2003	Oral suspension
Bacon Soft Diet	Bio Serve®, Frenchtown, NJ	14-726-701	-
C57BL/6J male mice	The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA	000664	Age: 3-week-old
CTAn software	V.1.16 Bruker, Billerica, MA	-	Volumetric analysis
Dolphin software	Navantis, Toronto, CA	-	Linear bone analysis
Implant carrier & Tip	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	Implant holder
Implant support	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	Implant capture
Isoflurane	Vet One, Boise, ID	NDC13985-528-60	Inhalational anesthetic
Micro-CT scan 1172	SkyScan, Kontich, Belgium	-	μCT scans
Nrecon Software	Bruker Corporation, Billerica, MA	-	Images reconstruction
Ø 0.3mm - L 2.5mm Micro Drills	Sphinx, Hoffman Estates, IL	ART. 50699	Osteotomy
Ø 0.5mm - L 1.0mm Titanium implants	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	-
Ophthalmic lubricant	Apexa, Ontario, CA	NDC13985-600-03	Artificial tears
Pin Vise	General Tools, Secaucus, NJ	90	Osteotomy
Rimadyl 50mg/ml	Zoetis, San Diego, CA	4019449	Anti-inflammatory
Sterile cotton tipped	Dynarex, Glendale, AZ	4304-1	Hemostasis
Tip forceps	Fine Science Tools, Foster City, CA	11071-10	Dental Extraction
Tying forceps	Fine Science Tools, Foster City, CA	18025-10	Ligature placement