Экспериментальная модель лигатурно-индуцированного периимплантита у мышей

Резюме

Это отчет об экспериментальной модели лигатур-индуцированного периимплантита у мышей. Мы описываем все хирургические этапы, начиная с пред- и послеоперационного ведения животных, удаления, установки имплантатов и лигатурно-индуцированного периимплантита.

Аннотация

Зубные имплантаты имеют высокий успех и приживаемость. Однако такие осложнения, как периимплантит (ПИ), очень сложно поддаются лечению. ПИ характеризуется воспалением в тканях вокруг зубных имплантатов с прогрессирующей потерей опорной кости. Чтобы оптимизировать долговечность зубных имплантатов с точки зрения здоровья и функциональности, крайне важно понимать патофизиологию периимплантита. В связи с этим использование мышиных моделей в исследованиях доказало явные преимущества при воссоздании клинических обстоятельств. Целью данного исследования было описание экспериментальной модели лигатурно-индуцированного периимплантита у мышей и определение эффективности индуцирования этого заболевания с учетом наблюдаемых изменений в костях и тканях. Экспериментальная индукция периимплантита включает в себя следующие этапы: удаление зубов, установка имплантата и лигатурно-индуцированная ПИ. Выборка из восемнадцати 3-недельных самцов мышей C57BL/6J была разделена на две группы: лигатурную (N=9) и контрольную (N=9). Проведена оценка клинических, рентгенологических и гистологических факторов. Лигатурная группа показала значительно более высокую потерю костной массы, повышенный отек мягких тканей и миграцию апикального эпителия, чем группа без лигатуры. Был сделан вывод о том, что данная доклиническая модель может успешно индуцировать периимплантит у мышей.

Введение

Зубные имплантаты становятся все более распространенным выбором для замены отсутствующих зубов¹. По прогнозам, распространенность зубных имплантатов среди взрослого населения США увеличится до 23% к 2026^году. Согласно отчету об анализе рынка Grand View Research (2022 г.), объем мирового рынка зубных имплантатов в 2022 году достигнет примерно 4,6 млрд долларов США. Кроме того, ожидается, что до 2030 г. он будет демонстрировать устойчивые ежегодные темпы роста на уровне около 10%³. К сожалению, использование зубных имплантатов может привести к осложнениям, таким как периимплантит. Периимплантит был определен как состояние, индуцированное биопленкой, характеризующееся воспалением в оболочкой вокруг имплантата и последующей прогрессирующей потерей опорной кости⁴.

Систематический обзор показал, что средняя распространенность периимплантита составила 19,53% (95% доверительный интервал [ДИ], от 12,87 до 26,19%) на уровне пациента и 12,53% (95% ДИ от 11,67 до 13,39%) на уровне^{имплантата 5}. Периимплантит представляет собой растущую проблему общественного здравоохранения в связи с увеличением числа случаев отторжения имплантатов и, как следствие, значительными^{затратами} на лечение6.

Понимание патогенеза периимплантита имеет решающее значение для разработки системного подхода к предотвращению его возникновения и прогрессирования и максимизации долговечности зубных имплантатов с точки зрения эстетики и функции ^7,8. В этом смысле использование мышиных моделей в стоматологических исследованиях оказалось полезным, учитывая, что мыши разделяют более 95% своих генов с людьми ^9,10, количество доступных генетических онлайн-баз данных и способность воспроизводить клинические^{сценарии.} Все описанные преимущества позволяют расчленять генетические механизмы при различных заболеваниях¹², доступное приспособление и лечение, а также антитела, широко доступные в виде панелей для человека, помимо наличия генетических модификаций (например, нокаута и гиперэкспрессии) для оценки воспалительных тканей и картирования заболевания¹³. Несмотря на преимущество, существует мало публикаций, посвященных периимплантиту у мышей. Это связано, в частности, с методологическими проблемами, в том числе со сложностью получения мини-имплантатов или их установки.

Для развития периимплантита у мышей было описано множество протоколов, таких как периимплантит, индуцированный лигатурой, периимплантит, индуцированный бактериями¹⁴, периимплантит, индуцированный липополисахаридами (ЛПС)¹⁵ или комбинация ЛПС + лигатурно-индуцированный периимплантит¹⁶. Здесь мы сосредоточимся на лигатурной модели, потому что она является наиболее распространенным методом индуцирования пародонтита 17,18,19 и, в последнее время, периимплантита ^20,21. Лигатура, размещенная вокруг имплантатов в подслизистом положении, стимулирует накопление бляшек и, как следствие, воспаление тканей. Таким образом, разработка данного подхода основана на указании жизнеспособной методики с точки зрения затрат и выгод для доклинических исследований периимплантных заболеваний. Целью данного исследования является описание экспериментальной модели лигатурно-индуцированного периимплантита у мышей и определение эффективности индуцирования этого заболевания с учетом наблюдаемых изменений в костях и тканях.

Общая цель этой статьи состоит в том, чтобы описать протокол, применяемый для индуцирования периимплантита у мышей с помощью лигатуры, и наблюдать его эффективность путем оценки тканей и потери костной массы вокруг имплантатов.

протокол

Процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по исследованиям на животных при канцлере Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (протокол ARC No 2002-125) и Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE)²². Для этого метода были использованы восемнадцать 3-недельных самцов мышей C57BL/6J, которым было проведено удаление зубов, установка имплантата и индукция периимплантита. Все стоматологические процедуры выполнялись под микроскопическим увеличением 10× и выполнялись обученными и откалиброванными операторами (рис. 1А).

1. Этапы предварительной экстракции

1. Проводите процедуру в операционной, соблюдая все стандарты биобезопасности и защиты.
2. Проводят асептику всех поверхностей тройным трением с использованием 70% раствора изопропилового спирта.
3. Обезболивайте 3-недельных самцов мышей C57BL/6J 3% изофлураном. Проверьте, нет ли реакции на отдергивание лапы при прикосновении, чтобы убедиться, что получена достаточная глубина анестезии.
4. Чтобы не мешать процедурам в полости рта, используйте носовой конус для поддержания анестезии изофлураном.
5. Иметь вспомогательного оператора для стабилизации животного и поддержания открытия рта (рис. 1B).
6. Нанесите офтальмологическую смазку, чтобы предотвратить раздражение глаз перед началом удаления.

Рисунок 1: Оперативная адаптация: (А) Микроскопическое увеличение. (B) Адаптированная система ингаляционной анестезии и стабилизации для открывания рта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Удаление зубов

1. При удалении зубов введите зубной проводник #5 между первым и вторым моляром, чтобы начать процедуры подъема и вывиха, перемещая инструмент в мезио-дистальном направлении до тех пор, пока зуб не переместится в лунку (рис. 2A).
2. Затем введите зубной эксплорер #5 в мезиальный участок первого моляра. Для этого перемещайте инструмент в мезио-дистальном направлении до тех пор, пока зуб не переместится в лунку.
3. После подъема используйте кончиковые щипцы и щипцы для завязывания швов, чтобы удалить^1-й моляр.
4. Затем введите зубной проводник между^2-м и^3-м молярами, чтобы поднять и вывихнуть^2-й моляр (рис. 2B).
5. Затем используйте щипцы для завязывания кончиков и/или щипцы для завязывания швов, чтобы удалить зуб с помощью инструментов, чтобы удерживать его и извлекать изо рта. (Рисунок 2В).
6. После удаления зубов обеспечьте полное достижение гемостаза с помощью стерильной ваты с наконечником (Рисунок 2D) в течение 1 минуты (Рисунок 2E, F).
7. Сразу после экстракции каждые 24 ч всем животным давать обезболивающие препараты (карпрофен/римадил 5 мг/кг). Вводят лекарство через подкожную инъекцию.
8. Кроме того, замените обычную пищу щадящей диетой. Антибиотик (Амоксил 0,25 мг/мл) назначают перорально, добавляя лекарство в питьевую воду. Делайте это в течение четырех недель после удаления.

Рисунок 2: Начальная последовательность удаления: (A, B) Верхнечелюстная область с 1-м и 2-м коренными зубами и использование стоматологического эксплорера для поднятия и вывиха. (C) Использование щипцов на кончике и эксплорера для вывиха и удаления зуба. (D) Гемостаз. (Е, Ф) Альвеолярный вид после удаления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Установка имплантата

1. Используя лезвие 15c, создайте мезио-дистальный разрез через ороговевшую ткань в области, соответствующей ранее присутствующим зубам. Используйте правые верхнечелюстные моляры в качестве пространственной привязки (рис. 3А).
2. Поднимите щечные и нёбные лоскуты на всю толщину с помощью стоматологического эксплорера #5, обеспечивая полное поднятие лоскута (Рисунок 3B).
3. Выполните остеотомию с помощью твердосплавной ручной дрели диаметром 0,3 мм, прикрепленной к тискам (ручной дрели), и активируйте ее вращением по часовой стрелке. Создайте участки остеотомии на глубину около 1 мм в зажившие лунки для удаления зубов (Рисунок 3C).
4. Установите специально разработанные винтовые имплантаты с гладкой обработанной поверхностью (длиной 1,0 мм и диаметром 0,5 мм), изготовленные из титановых стержней 6AL4V (рис. 3D), по одному на животное, путем самопостукивания в область первого и второго левых моляров верхней челюсти с помощью винтового движения по часовой стрелке (рис. 3E-I).
5. Сразу после установки имплантата вводите обезболивающее лекарство (карпрофен/римадил 5 мг/кг каждые 24 ч) через подкожную инъекцию.
6. Дайте имплантатам зажить в течение четырех недель, в течение которых вводите антибиотики и кормите, как описано выше.
7. По окончании периода заживления следите за тем, чтобы рана слизистой полностью закрылась и имела светло-розовый вид.

Рисунок 3: Последовательность установки имплантата: (A) Разрез с помощью лезвия 15c, прикрепленного к ручке. (B) Лоскуты полной толщины с использованием стоматологического эксплорера #5. (C) Остеотомия с использованием твердосплавного ручного сверла диаметром 0,3 мм, прикрепленного к тискам. (D) Титановый зубной имплантат. (Е, Ф) Опора для имплантата и держатель имплантата. (Г-И) Установка имплантата с помощью завинчивающих движений по часовой стрелке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

4. Индукция периимплантита

1. Поместите шелковую лигатуру (6-0) вокруг каждого приспособления непосредственно апикально к головке имплантата, очертив контур поверхности имплантата и зафиксировав ее двойным узлом. Держать лигатуру в течение двух недель, допуская развитие периимплантита.
2. Проверяйте лигатуры каждые два дня, чтобы убедиться, что они все еще присутствуют. Если его нет, установите новую лигатуру.

Рисунок 4: Последовательность лигатурно-индуцированного периимплантита. (А-Д) Шелковая лигатура (6.0) размещается вокруг головки имплантата. (Э-Г) Застежка узла. (H) Лигатурный разрез. (I) Окончательный внешний вид. Клинические изображения, полученные от живых животных под седацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Жертвоприношение

1. После периода индукции периимплантита (две недели) жертвуют всех животных высокой концентрацией ингаляционного изофлурана с последующим вторичным методом вывиха шейки матки с вдавливанием стержня в основание черепа и быстрым вытягиванием задних конечностей, вызывая отделение шейных позвонков от черепа.
2. Отделите верхнюю челюсть с помощью острых инструментов, таких как хирургические ножницы, которые отделят всю челюсть животного от остального тела.
3. Сфотографируйте верхнюю челюсть с помощью оптического микроскопа, зафиксируйте ее в 10% формалине в течение 24 ч, затем храните в 70% этаноле.

6. Микрокомпьютерная томография (мкКТ)

1. Сканируйте верхнюю челюсть, как описано ранее ^18,19, с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ).
2. Включите сканер и компьютер, затем откройте программное обеспечение сканирования, нажмите на знак радиации и подождите 15 минут, чтобы нагреть его.
3. Откройте дверцу оборудования, нажав на иконку двери.
4. Используйте поворотный стол размером в четверть. Поместите верхнюю челюсть в коническую трубку объемом 15 мл. Закрепите трубку в основании поворотного стола. Поместите поворотный стол в винт оборудования.
5. Закройте дверцу оборудования, нажав на значок двери.
6. Включите источник рентгеновского излучения.
7. Нажмите на иконку захвата изображения и убедитесь, что кость находится на поле.
8. Регулировка разрешения 10 мкм, размер пикселя, энергия рентгеновского излучения 55 кВп и 181 мкА, фильтр AI 0,5 мм, шаг вращения 0,4, средний кадр 10. При таких настройках расчетное время сканирования составит 24 минуты.
9. Начните сбор данных.
10. Для восстановления откройте программу реконструкции. Используйте упрочнение балки 20%. Используйте кольцевой артефакт 5%. Используйте динамический диапазон 0-0,13. Снимите флажок с метки ON. Нажмите « Предварительный просмотр». Выберите подходящий вид, видимый для интересующей области, и сохраните его в формате TIFF.
11. Ориентируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для просмотра и анализа данных. Длинная ось головки имплантата должна быть параллельна сагиттальной и корональной осям и перпендикулярна осевой оси.
12. Сохраните сагиттальное изображение как единое изображение для линейного анализа костей.
13. Сохранение трансаксиального изображения в виде набора данных для объемного анализа костной ткани.
14. Выполняйте линейный анализ костей с помощью программного обеспечения для анализа данных. Измерьте расстояния в миллиметрах между головкой имплантата и альвеолярной костью в сагиттальной и корональной плоскостях, включая мезиальные, дистальные, щечные и нёбные участки.
15. Выполняйте объемный анализ костей с помощью программного обеспечения для анализа данных. Отслеживайте потерю костной массы вокруг имплантатов, рисуя интересующую область на всех предметных стеклах, соответствующую потере костной массы.

7. Статистический анализ

1. Измерьте линейную и объемную микротомографическую потерю костной массы и нормализуйте эти значения, разделив каждое значение на среднее значение контрольной группы. Представьте среднее значение по всем группам, как среднее ± стандартную ошибку среднего (SEM).
2. Сравните значимость с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки с 95% доверительным интервалом. (Призма 5). Примените уровни значимости следующим образом: p≤0.01**, p≤0.001****.

Результаты

Для этого метода были использованы восемнадцать 3-недельных самцов мышей C57BL/6J, которым было проведено удаление зубов, установка имплантата и индукция периимплантита. В каждой группе было девять животных, что было статистически значимым, учитывая, что линейная потеря костной массы дост...

Обсуждение

Этот протокол представляет собой описательный отчет о хирургических процедурах для индукции периимплантита с использованием лигатурной модели на мышах. Работа с мышами имеет такие преимущества, как экономическая эффективность, наличие обширного генетического массива с учетом множе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 dental explorer	Hu-Friedy, Chicago, IL	392-0911	Dental luxation
15c blade and surgical scalpel	Henry Schein Inc., Melville, NY	1126186	Tissue incision
6-0 silk ligatures	Fisher Scientific, Hampton, NH	NC9201232	Ligature
Amoxicillin 50μg/mL	Zoetis, San Diego, CA	TS/DRUGS/57/2003	Oral suspension
Bacon Soft Diet	Bio Serve®, Frenchtown, NJ	14-726-701	-
C57BL/6J male mice	The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA	000664	Age: 3-week-old
CTAn software	V.1.16 Bruker, Billerica, MA	-	Volumetric analysis
Dolphin software	Navantis, Toronto, CA	-	Linear bone analysis
Implant carrier & Tip	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	Implant holder
Implant support	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	Implant capture
Isoflurane	Vet One, Boise, ID	NDC13985-528-60	Inhalational anesthetic
Micro-CT scan 1172	SkyScan, Kontich, Belgium	-	μCT scans
Nrecon Software	Bruker Corporation, Billerica, MA	-	Images reconstruction
Ø 0.3mm - L 2.5mm Micro Drills	Sphinx, Hoffman Estates, IL	ART. 50699	Osteotomy
Ø 0.5mm - L 1.0mm Titanium implants	D. P. Machining Inc., La Verne, CA	Unique product	-
Ophthalmic lubricant	Apexa, Ontario, CA	NDC13985-600-03	Artificial tears
Pin Vise	General Tools, Secaucus, NJ	90	Osteotomy
Rimadyl 50mg/ml	Zoetis, San Diego, CA	4019449	Anti-inflammatory
Sterile cotton tipped	Dynarex, Glendale, AZ	4304-1	Hemostasis
Tip forceps	Fine Science Tools, Foster City, CA	11071-10	Dental Extraction
Tying forceps	Fine Science Tools, Foster City, CA	18025-10	Ligature placement