Ensayo de complementación basado en Escherichia coli para estudiar la función chaperona de la proteína de choque térmico 70

Resumen

Este protocolo demuestra la actividad chaperona de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células de E. coli dnaK756 sirven como modelo para el ensayo, ya que albergan una Hsp70 nativa y funcionalmente deteriorada, lo que las hace susceptibles al estrés térmico. La introducción heteróloga de Hsp70 funcional rescata la deficiencia de crecimiento de las células.

Resumen

La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una proteína conservada que facilita el plegamiento de otras proteínas dentro de la célula, lo que la convierte en una chaperona molecular. Si bien Hsp70 no es esencial para las células de E. coli que crecen en condiciones normales, esta chaperona se vuelve indispensable para el crecimiento a temperaturas elevadas. Dado que Hsp70 está altamente conservado, una forma de estudiar la función chaperona de los genes Hsp70 de varias especies es expresarlos heterólogamente en cepas de E. coli que son deficientes en Hsp70 o expresan una Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. Las células de E. coli dnaK756 son incapaces de soportar el ADN del bacteriófago λ. Además, su Hsp70 nativo (DnaK) exhibe una elevada actividad de ATPasa al tiempo que demuestra una afinidad reducida por GrpE (factor de intercambio de nucleótidos Hsp70). Como resultado, las células de E. coli dnaK756 crecen adecuadamente a temperaturas que oscilan entre 30 °C y 37 °C, pero mueren a temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razón, estas células sirven como modelo para estudiar la actividad chaperona de Hsp70. Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de estas células para realizar un ensayo de complementación, lo que permite el estudio de la función chaperona in cellulo de Hsp70.

Introducción

Las proteínas de choque térmico desempeñan un papel importante como chaperonas moleculares al facilitar el plegamiento de proteínas, prevenir la agregación de proteínas y revertir el mal plegamiento de proteínas ^1,2. La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una de las chaperonas moleculares más prominentes, desempeñando un papel central en la homeostasis de las proteínas ^3,4. DnaK es el homólogo de E. coli Hsp70⁵.

Se han desarrollado varios ensayos biofísicos, bioquímicos y celulares para ....

Protocolo

1. Transformación

NOTA: Utilice cristalería estéril para el cultivo, puntas de pipeta y medios recién preparados y esterilizados en autoclave. Preparar cultivos de las células de E. coli en 2x triptona de levadura (YT) [triptona al 1,6% (p/v), extracto de levadura al 1% (p/v), NaCl al 0,5% (p/v), agar agar al 1,5% (p/v)]. Los reactivos generales utilizados en el protocolo y sus fuentes se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Etiquete los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml y una alícuota de 50 μl de células competentes de E. coli dnaK756, manteniendo las células en hielo.
....

Discusión

El protocolo demuestra la utilidad de las células dnaK756 de E. colien la exploración de la función chaperona de la Hsp70 expresada heterólogamente. Este ensayo podría adoptarse para detectar inhibidores dirigidos a la función de Hsp70 en el celullo. Sin embargo, una limitación de este método es que las Hsp70 incapaces de sustituir al DnaK en E. coli no son compatibles con este ensayo. La falta de modificación postraduccional²¹ de algunas Hsp70 no nativas puede .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody