Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

Resumen

Este protocolo describe la diferenciación de linfocitos T CD4⁺ naïve en linfocitos Th17 patógenos in vitro. Específicamente, cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica, se puede obtener una pureza del 90% de las células Th17 patógenas a partir de células T CD4⁺ naïve utilizando este método de diferenciación.

Resumen

In vitro Las técnicas de diferenciación de linfocitos T son esenciales para las investigaciones funcionales y mecanicistas de los linfocitos T CD4⁺ . Las células patógenas Th17 se han relacionado con una amplia gama de enfermedades en los últimos tiempos, como la esclerosis múltiple (EM), la artritis reumatoide, el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la sepsis y otros trastornos autoinmunes. Sin embargo, los protocolos de diferenciación in vitro actualmente conocidos tienen dificultades para lograr una alta pureza de las células Th17 patógenas, con una eficiencia de inducción a menudo inferior al 50%, lo cual es un desafío clave en los experimentos in vitro . En este protocolo, proponemos un protocolo mejorado de cultivo y diferenciación in vitro para células Th17 patógenas, que se utiliza para diferenciar directamente las células T CD4⁺ vírgenes aisladas del bazo de ratón en células Th17 patógenas. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre el aislamiento de esplenocitos, la purificación de células T CD4⁺ vírgenes y la diferenciación de células Th17 patógenas. A través de este protocolo, podemos lograr una pureza de diferenciación de aproximadamente el 90% para las células Th17 patógenas, lo que satisface las necesidades básicas de muchos experimentos celulares.

Introducción

Después de salir del timo, los linfocitos T CD4⁺ naïve pasan a través de los órganos linfoides secundarios. Las células presentadoras de antígenos que transmiten antígenos homólogos a los linfocitos T CD4⁺ naïve los activan, iniciando una serie de programas de diferenciación que finalmente dan como resultado la producción de^linajes de células T auxiliares (Th) altamente especializados. La producción de interleucina 17 (IL-17) caracteriza a las células Th17, una subpoblación de células Th proinflamatorias². Las células Th17 desempeñan un papel en la defensa del huésped contra patógenos extracelulares y en la patogénesis de muchas enfermedades autoinmunes, como la uveítis autoinmune y la esclerosis múltiple. Las señales de los receptores de linfocitos T y las citocinas IL-6 y el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) inducen la diferenciación de los linfocitos T vírgenes en linfocitos Th17 a través de la fosforilación del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT)3³. STAT3 se amplifica aún más en un bucle de retroalimentación positiva a través de la señalización mediada por IL-23 e IL-21 ^4,5. La fosforilación de STAT3 puede inducir la expresión de los factores de transcripción RORγt y RORα, que actúan como interruptores maestros que regulan el perfil de citocinas de IL-17A, IL-17F, IL-21 e IL-22 en las células Th17⁶. Sin embargo, se ha informado que las células Th17 inducidas por IL-6 y TGF-β son insuficientes para desencadenar enfermedades autoinmunes, que requieren coestimulación por IL-23 o coestimulación separada de IL-6, IL-1β e IL-23 en ausencia de TGF-β ^7,8.

Los subconjuntos Th17 que no pueden inducir eficazmente la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) a veces se denominan Th17 no patógenos, mientras que los subconjuntos Th17 Th17 patogénicos se conocen como Th17 patógenos⁹. Los estudios actuales han demostrado que, aunque el Th17 patógeno y el Th17 no patógeno co-expresan el factor de transcripción central RORγt, existen grandes diferencias en la capacidad de producir IL-17A y las propiedades proinflamatorias y antiinflamatorias¹⁰. Además de la alta expresión de RORγt, CCR6, STAT4 y RUNX4, que son factores de transcripción característicos comunes de Th17, las células patógenas Th17 también muestran características adicionales de expresión de señales génicas relacionadas con la enfermedad, como TBX21, IFN-γ y CXCR3, que tienen las características de los subconjuntos de células Th1. Las células patógenas Th17 pueden secretar altos niveles de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α y otras citocinas ^11,12. El fenotipo de las células Th17 no patógenas es inestable, y solo bajo la estimulación de CD3 y la citocina IL-2 pueden algunas de estas células diferenciarse en células Th17 patógenas. Por lo tanto, en modelos clínicos de enfermedades comunes como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y el síndrome de dificultad respiratoria aguda, las células patógenas Th17 ejercen principalmente efectos patógenos.

Las células Th17 patógenas y no patógenas pueden diferenciarse in vitro bajo la influencia de diferentes citocinas. En los últimos años, varios estudios han propuesto métodos para inducir la diferenciación de las células Th17 utilizando diferentes tipos y concentraciones de citocinas. Las células Th17 son estimuladas por una combinación de IL-6, IL-1β e IL-23 13,14,15,16. Se ha demostrado que IL-6 y TGF-β, dos citoquinas necesarias para la diferenciación de las células Th17, regulan sinérgicamente la expresión de RORγt y la diferenciación de las células Th17 al interactuar con dos diferentes secuencias de ADN no codificante conservadas en el locus¹⁷ del gen Rorc. La fase estable de las células patógenas Th17 es mantenida principalmente por la IL-23^18,19. La IL-23 se une a su receptor y activa la vía de señalización^{JAK-STAT 20}, lo que provoca la fosforilación de Jak2 y Tyk2 y promueve la fosforilación de STAT1, STAT3, STAT4 y STAT5. La IL-4 y el IFN-γ son reguladores negativos de esta vía. Sin embargo, los estudios han demostrado que la IL-1β puede regular positivamente la transcripción de Rorα y Rorγt a través de la vía mTOR para mantener la estabilidad del fenotipo de la célula Th17²¹.

Debido a la heterogeneidad de numerosos estudios, elegimos los protocolos de inducción para células Th17 patógenas y no patógenas de las últimas investigaciones como controles²². Los resultados indican que, asumiendo que todo se lleva a cabo según este protocolo, después de 5 días de cultivo bajo la condición de generar Th17 patógeno, más del 90% de las células supervivientes pueden ser células Th17 patógenas.

Protocolo

El Comité de Revisión Institucional para Estudios Animales de la Universidad del Sureste aprobó todos los estudios con animales que se detallan en este estudio, los cuales se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares de las oficinas locales e institucionales. Se tomaron muestras de bazo de ratones C57BL6/J. En este estudio se incluyeron ratones hembra y macho, con edades comprendidas entre las 5 y las 8 semanas. El medio de cultivo y el tampón se almacenaron a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave antes de su uso. Use guantes y mascarillas de látex para evitar la contaminación de la piel, los ojos y la ropa con reactivos; Use mucha agua o enjuague salino para la piel y los ojos.

1. Prerrecubrimiento de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con anti-CD3

1. Diluir el anti-CD3 hasta una concentración final de 1 μg/mL en un medio estéril de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x o RPMI 1640.
2. Llene un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 1 mL de solución anti-CD3 (1 μg/mL); Luego, cubre el pozo con parafilm.
3. Coloque la placa recubierta anti-CD3 en el refrigerador (2 °C-8 °C) durante 16 h o manténgala a 37 °C en una incubadora de celdas durante 2-3 h.

2. Aislamiento del bazo de ratón y preparación de la suspensión unicelular del bazo

1. Inducir la anestesia completa en C57BL/6J con isoflurano al 3% y eutanasiar inhalando dióxido de carbono al 100% durante 2 min. Inmediatamente después de la muerte de los ratones, sumérjalos en etanol al 75% para desinfectarlos y evitar la contaminación.
2. Coloque el ratón en posición supina en el banco limpio, córtelo a lo largo de la línea media del abdomen y separe las estructuras abdominales capa por capa. Abra suavemente el epiplón mayor y el estómago con pinzas, extraiga suavemente el bazo con el ligamento gastrosplénico y separe sin rodeos el bazo de los tejidos y ligamentos circundantes para obtener un bazo intacto (tenga cuidado de evitar que el bazo se aplaste o se rompa).
   NOTA: Para mantener un estado estéril, se realiza la siguiente operación en un banco súper limpio estéril.
3. Coloque un filtro celular de 70 μm en una placa de cultivo estéril de 100 mm, agregue el bazo al filtro celular y tritúrelo con un émbolo de jeringa. Al mismo tiempo, agregue 5-8 mL de líquido de lavado homogeneizado para empujar todas las células a través del filtro hacia la placa de cultivo.
   NOTA: La composición del kit de líquido de separación de linfocitos se puede ver en la Tabla de Materiales.
4. Centrifugar el filtrado a 450 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el pellet celular con el diluyente de muestra suministrado con el kit de separación de linfocitos o con medio PBS o RPMI 1640. Ajuste la concentración celular de la suspensión celular a 2 × 10^8-1 × 10^{9 células} /mL.
   NOTA: Por lo general, se requieren 4-6 mL de diluyente de muestra para un bazo.
6. En un tubo de centrífuga, tome la misma cantidad de solución de separación de linfocitos que la suspensión unicelular de tejido. Pipetear con cuidado la suspensión unicelular sobre la superficie de la solución de separación de linfocitos y centrifugar a 800 × g, 25 °C durante 30 min. Ajuste la aceleración y desaceleración de la centrífuga a un rango apropiado (por ejemplo, establezca en 3 si hay las marchas habituales de 1 a 9).
   NOTA: La solución de separación de linfocitos no debe ser inferior a 3 mL.
7. Después de la centrifugación, observe las cuatro capas en el tubo de centrífuga de arriba hacia abajo. La primera capa corresponde al diluyente de la muestra, seguida de la capa anular de linfocitos de color blanco lechoso. La tercera capa es el líquido de separación y la cuarta capa consta de glóbulos rojos.
8. Utilice una pipeta para extraer cuidadosamente la segunda capa de linfocitos anulares de color blanco lechoso en otro tubo de centrífuga y añada 10 ml de solución de limpieza al tubo de centrífuga para mezclar las células.
9. Centrifugar a 250 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Utilice 10 ml de medio RPMI 1640 para resuspender el pellet de celdas para el recuento de células.

3. Purificación de células T CD4+ ingenuas basada en la selección negativa de perlas magnéticas

NOTA: Aísle linfocitos T CD4⁺ vírgenes intactos y altamente purificados (CD4⁺CD44lowCD62Lhigh) de esplenocitos de ratón mediante selección inmunomagnética negativa.

1. Prepare la muestra para que tenga 1 × 10⁸ células/mL dentro del rango de volumen de 0,1-2 mL.
2. Añadir 50 μL/mL de suero de rata y transferir la muestra a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.
   NOTA: La composición del kit de clasificación de células T CD4 ingenuas se puede ver en la Tabla de Materiales.
3. Añadir 50 μL/mL de cóctel de aislamiento a la muestra, mezclar bien e incubar durante 7,5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir 50 μL/mL de Cóctel de Agotamiento a la muestra, mezclar bien e incubar durante 2,5 min a temperatura ambiente.
5. Agite las perlas magnéticas para garantizar una dispersión uniforme. Añada 75 μL/mL de las perlas magnéticas a la muestra, mezcle bien e incube durante 2,5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Las partículas deben aparecer dispersas uniformemente; El tiempo de vórtice no debe ser inferior a 30 s.
6. Rellene la muestra con medio RPMI 1640 hasta un volumen final de 2,5 mL. Mezcle varias veces pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
7. Coloque el tubo (sin la tapa) en el imán e incube durante 2,5 minutos a temperatura ambiente.
8. Levantando el imán, invierta el imán y el tubo en un movimiento continuo y vierta la suspensión de celda enriquecida en un tubo nuevo.
   NOTA: Mantenga el tubo y el imán invertidos durante 2-3 segundos antes de girarlos en posición vertical. No moleste las gotas que puedan quedar en la boca del tubo.
9. Determine el número de células con un hemocitómetro.
10. Realice un análisis de citometría de flujo para células T CD4⁺ vírgenes antes y después del aislamiento (Figura 1).
11. Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga, centrifugue a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
12. Resuspender las células en 200-500 μL de medio RPMI 1640 (suplementado con un 10% de suero fetal bovino). Por cada 1 mL de cultivo celular (por ejemplo, ~106 células/mL), agregue 2 μL de cóctel de activación de leucocitos y mezcle. Cultivar las células en una incubadora de CO2 a 37 °C y humedad saturada durante 4-6 h.
    NOTA: Las células se agitaron en vórtice una vez cada 1-2 h.
13. Centrifugar las células a 400 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS. Agregue 1 μL de bloqueador Fc a las células (por ejemplo, ~106 células/mL). Incubar las células durante 10 min a 4 °C.
14. Lavar las células una vez con 1 mL de PBS centrifugando a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS.
15. Añadir cóctel de anticuerpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) e incubar las células durante 15-20 min en la oscuridad a 4 °C.
16. Lavar las celdas con 2 x 1 mL de PBS y luego centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
17. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón fijo e incube durante 40-60 min en la oscuridad a 4 °C.
    NOTA: El tampón fijo se proporciona con el tampón de tinción Foxp3/factor de transcripción, que es una solución madre 4x que debe diluirse con diluyente de permeabilización.
18. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x para lavar las células 2x centrifugando las células a 300 × g, 4 °C durante 5 min.
19. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de permeabilización y agregue el anticuerpo (Foxp3 [nuclear], 1:200) a las células. Después de la fijación y la ruptura de la membrana, incubar las mezclas de células y anticuerpos en la oscuridad durante 40-60 minutos con agitación ocasional durante períodos cortos a 4 °C.
    NOTA: La solución de permeabilización/lavado es una solución madre 10x que debe diluirse antes de usarse con PBS.

4. Inducción de células patógenas Th17 in vitro

1. Retire el PBS estéril de las placas de 24 pocillos prerrevestidas antes de usarlo.
2. Utilice el medio de cultivo celular Th17 (Tabla 1) y el medio de contraste para el cultivo, incluido el medio de cultivo celular Th0 (Tabla 1), el medio de cultivo Th17 no patógeno clásico (Tabla 1) y el medio de cultivo Th17 patógeno clásico (Tabla 1). Vuelva a suspender las células T CD4+ naïve enriquecidas y dispense en diferentes pocillos en la misma placa de 24 pocillos (prerrecubierta con anti-CD3), ajustando la concentración a 4 × 10⁵ células/mL, con 1 mL de medio en cada pocillo.
3. Añadir 1 μL/mL de solución anti-CD28 (concentración final: diluida con medio a 2 μg/mL) a cada pocillo. Cultivar las células en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 5 días.
4. Reemplace el medio sobrenadante de cultivo celular con medio de cultivo (Th0, Th17 no patógeno, Th17 patógeno clásico y Th17 objetivo) pipeteando cuidadosamente para distribuir las células de manera uniforme, deseche la mitad del medio que contiene las células y luego agregue un medio nuevo igual al volumen de descarte el día 2. Repita el día 4.
5. Observe las células bajo un microscopio óptico el día 5 (Figura 2). Recoger los sobrenadantes celulares de cada grupo y criopreservarlos a -80 °C.

5. Análisis de citometría de flujo para la diferenciación de células patógenas Th17 y Th0

1. Coseche todas las células (por pocillo) después de 5 días del inicio del cultivo. Realice los pasos 3.12 a 3.15.
2. Añadir un cóctel de anticuerpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) e incubar las células durante 15-20 min en la oscuridad a 4 °C.
3. Realice los pasos 3.17 a 3.19.
4. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de permeabilización y agregue el cóctel de anticuerpos (IL-17A [intracelular], 1:200; RORγT [nuclear], 1:200) a las células. Después de la fijación y la ruptura de la membrana, incubar las mezclas de células y anticuerpos en la oscuridad durante 40-60 minutos con agitación ocasional durante períodos cortos a 4 °C.
5. Añadir 1 mL de solución de permeabilización/lavado 1x para lavar las células 2x, centrifugando las células a 400 × g durante 5 min a 4 °C; Luego, desecha el sobrenadante.
6. Examine las células en un citómetro de flujo y analice los datos utilizando el software (Figura 3).
   1. Encienda el citómetro de flujo y active el proceso de limpieza y calibración de inicio automático.
   2. Seleccione el canal láser utilizado en este experimento y configure un tubo en blanco, tubos de una sola tinción y tubos de muestra.
   3. Haga clic en la opción de tubo en blanco y pruebe en la máquina; Ajuste el voltaje para que el evento de celda esté, en la medida de lo posible, en el centro de la caja de recolección.
   4. Recoja células de tubo de un solo tinte y realice la detección espectral de los canales correspondientes para confirmar que el anticuerpo fluorescente se ha añadido correctamente.
   5. Haga clic en el botón desmezclar y deje que la máquina ajuste automáticamente la compensación espectral. Con otros instrumentos de citometría de flujo, ajuste la compensación de fluorescencia normalmente.
   6. Recoja cada celda de tubo de muestra, guarde el formato de datos como archivos FCS y exporte. Analice y trace en el software de análisis de datos de citometría de flujo correspondiente.
      1. Encierre en un círculo la población celular principal y elimine las posibles adherencias celulares a través de las puertas circulares diagonales de FSC-H y FSC-A.
      2. Circule las celdas vivas de acuerdo con el área del círculo negativo FVS; a continuación, encierre en un círculo la población de células CD4+.
      3. Construya la puerta transversal con el eje horizontal como IL-17 A y el eje vertical como RORγT; la doble selección positiva en el área Q2 es la población de células Th17.

6. Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para la detección de la secreción de IL-17A inducida por diferentes medios

1. Descongele los sobrenadantes celulares congelados recogidos en la sección 4.5.
2. Agregue 100 μL del patrón diluido, blanco y muestra en los pocillos designados. Utilice el sellador para cubrir la placa e incubar durante 90 min a 37 °C.
   NOTA: Agregue las soluciones al fondo del pozo de la placa de micro-ELISA sin tocar la pared interior ni causar espuma.
3. Decantar el líquido de cada pocillo y añadir inmediatamente 100 μL de solución de trabajo de anticuerpos de detección biotinilados. Utilice un sellador nuevo para cubrir la placa e incubar durante 1 h a 37 °C.
4. Decantar la solución y añadir 350 μL de tampón de lavado a cada pocillo. Después de 1 minuto, aspire o decante la solución de cada pocillo y séquela con palmaditas contra papel absorbente limpio. Repite este paso de lavado 3 veces.
5. Agregue 100 μL de la solución de trabajo conjugada de peroxidasa de rábano picante a cada pocillo. Utilice un sellador nuevo para cubrir la placa e incube durante 30 minutos a 37 °C.
6. Decantar la solución de cada pocillo y repetir el proceso de lavado 5 veces como se describe en el paso 6.4.
7. Añadir 90 μL del reactivo de sustrato a cada pocillo e incubar durante unos 15 minutos a 37 °C con un nuevo sellador, protegiendo la placa de la luz.
   NOTA: El tiempo de reacción puede modificarse en función del cambio de color real, pero no debe exceder los 30 minutos. Deje que el lector de microplacas se caliente durante ~ 15 minutos antes de la medición de OD.
8. Agregue 50 μL/pocillo de solución de parada en el mismo orden que la solución de sustrato.
9. Determine la densidad óptica (valor OD) de cada pozo a la vez con un lector de microplacas configurado a 450 nm.
10. Obtenga los valores de DE para las muestras estándar y los pocillos replicados de las muestras, y reste los valores de DE de los pocillos en blanco para obtener los valores corregidos. A continuación, realice un ajuste lineal con la concentración como abscisa y el valor OD como ordenada. Con base en la ecuación ajustada, calcule los valores de concentración de IL-17A para los pocillos de muestra.
    NOTA: Después de 4 días de diferenciación, el contenido de IL-17A en el sobrenadante de cada grupo se muestra en la Figura 4. El método de ajuste puede referirse al software Orgin21. La curva estándar obtenida de este experimento tiene un valor R² de 0,9946.

7. Diferenciación de células T mediante ensayos de expresión génica de firma mediante PCR cuantitativa (qPCR)

NOTA: Para descartar la posibilidad de inestabilidad de la citometría de flujo debido a los efectos de los colorantes y la fijación/ruptura, detectamos la expresión de genes característicos por qPCR para dilucidar el efecto de diferenciación del Th17 patógeno a nivel transcripcional.

1. Mida el número de células al final del cultivo de células T. Recoja las células en tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 400 × g durante 5 minutos. Deseche con cuidado todos los sobrenadantes.
2. Extracción de ARN
   NOTA: El proceso de extracción debe llevarse a cabo en una campana extractora o en un banco ultralimpio para evitar la contaminación de la enzima ARN.
   1. Añadir 500 μL de tampón de lisis (por ejemplo, a 1-2 × 10⁶ células) al tubo de muestra (paso 7.1), agitar y mezclar inmediatamente hasta que no quede masa celular, y dejar reposar durante 1 min.
   2. Añadir la mezcla a la columna de adsorción colocada en un tubo de recogida, centrifugar a 13.400 × g durante 30 s y desechar el filtrado.
   3. Agregue la cantidad especificada de etanol absoluto a la botella de tampón de lavado antes de usarla por primera vez. Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción, centrifugar a 13.400 × g durante 30 s y desechar el filtrado.
   4. Repita el lavado en el paso 7.2.3.
   5. Coloque la columna de adsorción RA en el tubo de recogida vacío y centrifuga a 13.400 × g durante 2 minutos para eliminar la solución de enjuague.
      NOTA: La solución de enjuague debe retirarse para evitar que el etanol residual en la solución de enjuague inhiba la reacción posterior.
   6. Retire la columna de adsorción RA y colóquela en un tubo centrífugo limpio y libre de RNasa. Añadir 50 μL de H₂O libre de RNasa en el centro de la membrana de adsorción, dejar reposar durante 1 min a temperatura ambiente y centrifugar a 9.600 × g durante 1 min.
3. Mida la pureza y la concentración de ARN.
4. Sintetice la primera hebra de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.
   1. Eliminar el ADN genómico. Tome 500 ng del ARN molde extraído en un tubo centrífugo libre de ARNasa; agregue ddH₂O sin RNasa y una mezcla de ADNg 4x para formar una mezcla. Triturar suavemente con una pipeta y colocar en un baño de agua a 42 °C durante 2 min.
      NOTA: La cantidad de la mezcla de reacción y la cantidad agregada están relacionadas con la concentración de ARN; Consulte las instrucciones en detalle. En este experimento se utilizó el sistema de reacción de 20 μL.
   2. Agregue directamente un sistema de reacción de transcripción inversa 5x en el tubo de reacción del paso anterior. Tome 4 μL del sistema de reacción de transcripción inversa y 16 μL de la mezcla del paso anterior y mezcle suavemente con una pipeta.
      NOTA: El sistema de transcripción inversa incluye toda la transcriptasa inversa requerida, que es un sistema de transcripción inversa configurado directamente.
   3. Ajuste la reacción de transcripción inversa: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s y finalmente enfríe a 4 °C.
5. Configure la reacción de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
   1. Agregue 10 μL de mezcla de enzimas de reacción de PCR 2x en el tubo de qPCR, 0,4 μL de cebador 1, 0,4 μL de cebador 2, 0,4 μL de 50x de ROX Reference Dye 1, 2 μL de ADNc molde y 6,8 μL de ddH₂O para preparar una mezcla de 20 μL.
   2. Realice la PCR en el instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real utilizando los siguientes ajustes: etapa 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; etapa 2, primero 95 °C, 10 s, luego 60 °C, 30 s, Rep x 40; etapa 3, primero 95 °C, 15 s, siguiente 60 °C, 60 s, finalmente 95 °C, 15 s, Rep x 1.
      NOTA: Después de 4 días de diferenciación, los niveles de expresión relativa de Il17a, Il17f, Rera e Il23r en células T CD4⁺ vírgenes se muestran en la Figura 5.

Discusión

Este procedimiento ofreció una forma productiva de aumentar el número de células T CD4+ naïve esplénicas de ratones para la producción in vitro de células Th17 patógenas. Aunque utilizamos más citocinas que otros medios de cultivo celular Th17 reportados, estamos comprometidos a optimizar las condiciones de crecimiento de las células Th17 patógenas. Estamos considerando una mayor optimización de nuestro protocolo de diferenciación inducida.

En este caso, simplemente utilizamos la citometría de flujo y la qPCR para examinar la producción de citocinas distintivas. Con algunas modificaciones menores, este enfoque también se puede utilizar para otras pruebas de función, como la proliferación celular.

Utilizamos un kit de aislamiento de linfocitos producido en China para aislar los linfocitos del bazo de ratón porque es eficaz y ahorra tiempo. Las soluciones de separación de linfocitos basadas en otras marcas también pueden lograr el propósito de separar los linfocitos del bazo de ratón a través de diferentes pasos. Otro método es lisar directamente los glóbulos rojos de la suspensión de células del bazo obtenida; Sin embargo, descubrimos que los glóbulos rojos del bazo a menudo no se pueden lisar a la vez.

Algunos problemas pueden surgir durante la ejecución de este protocolo. En primer lugar, el número de linfocitos T CD4⁺ vírgenes obtenidos mediante clasificación magnética de perlas puede ser muy bajo (paso 3 del protocolo). Esto podría atribuirse a que el proceso de trituración de órganos es insuficiente. Es importante asegurarse de que el órgano esté correctamente homogeneizado. Aumentar la frecuencia de enjuague durante el proceso de homogeneización mejorará la tasa de recuperación. Para obtener un mayor número de linfocitos T CD4⁺ naïve esplénicos, sugerimos utilizar ratones más jóvenes (6-10 semanas de edad). Existen varios métodos disponibles para separar los linfocitos del bazo, y el rendimiento puede variar según el líquido de separación utilizado. Se recomienda utilizar un líquido de separación certificado universalmente y tratar de extraer la capa de linfocitos tanto como sea posible.

En segundo lugar, la proporción de linfocitos T CD4⁺ en la citometría de flujo puede ser del <80% (paso 5 del protocolo). Una posible causa de este problema podría ser un recuento inexacto de esplenocitos, lo que resulta en un recuento de células mayor que el del cóctel de anticuerpos adicional y las perlas magnéticas. Para aumentar la eficacia de la purificación ingenua de células T CD4⁺ , el recuento de células debe ser preciso. Además, se puede utilizar un 10% más de cóctel de anticuerpos y perlas magnéticas de lo que recomienda este protocolo. Por último, la citometría de flujo se puede realizar inmediatamente después de clasificar las células T CD4⁺ vírgenes.

En tercer lugar, es posible que no se formen muchos grupos de células T durante el cultivo, y que la mayoría de las células hayan muerto durante la diferenciación de las células T (paso 4 del protocolo). La posible razón de este problema puede ser la determinación inexacta del número de células para las células T CD4⁺ vírgenes antes de la siembra, lo que resulta en una baja densidad de células. Se recomienda adoptar un método de conteo más preciso para lograr la densidad celular deseada de aproximadamente 4 × 10⁵ celdas/mL para cada pocillo en una placa de 48 pocillos. Otra posible causa podrían ser problemas técnicos con la incubadora de CO₂ , como una temperatura o concentración de CO₂ incorrectas. Por último, una fuerza excesiva al cambiar el medio de cultivo celular podría causar la muerte celular.

En cuarto lugar, los niveles relativos de expresión de los genes de citocinas característicos pueden ser bajos (paso 7 del protocolo). Para garantizar la autenticidad del ARN extraído, se recomienda utilizar una concentración de detección de nanogotas de más de 100 ng/mL. La posible razón de la disminución de la concentración puede ser la naturaleza poco saludable de las células cultivadas, como que una gran parte de las células recolectadas estén muertas o en proceso de muerte. Para obtener la verdadera concentración de ARN, es necesario resolver la situación que puede conducir a un crecimiento deficiente durante el cultivo celular. Una razón alternativa detrás de esta preocupación podría ser el recuento final de células excesivamente bajo logrado durante la extracción de ARN, posiblemente debido a la pérdida inadvertida de células durante la eliminación del sobrenadante. El empleo de técnicas avanzadas de extracción de ARN, como los kits de extracción de ARN de un solo paso, podría resultar ventajoso. La relación ideal OD260/OD280, medida por Nanodrop, debe estar dentro del rango de 1,9-2,1. En el caso de una proporción excesivamente baja, la contaminación de proteínas se convierte en una posibilidad. El aumento de la frecuencia de lavado del tampón sin RNasa puede ayudar a mitigar este problema. Por el contrario, una proporción inusualmente baja implica una posible degradación del ARN. Para contrarrestar este problema, se recomienda emplear agua libre de RNasa y utilizar tubos de 1,5 mL para la descontaminación de la RNasa.

En conclusión, el protocolo actual describe el uso de un nuevo medio de cultivo celular para inducir directamente a las células T CD4⁺ vírgenes naïve para diferenciarse en células Th17 patógenas in vitro. En comparación con la separación directa, no hay duda de que este método es más directo, económico y más eficiente. La configuración del medio también es muy sencilla, por lo que las células Th17 construidas pueden utilizarse de forma más intuitiva para experimentos posteriores, proporcionando un muy buen modelo celular para el estudio de muchas enfermedades.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilution	BD	Cat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilution	BioLegend	Cat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilution	Invitrogen	Cat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilution	Invitrogen	Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purified	biogems	Cat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purified	biogems	Cat#10312-25
Anti-Mouse IFN gamma	biogems	Cat#80822-25
Anti-Mouse IL-4	biogems	Cat#81112-25
Ethanol	Xilong scientific	Cat#64-17-5
Fetal bovine serum	Gibco	Cat#10437-028
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	Cat#130-092-575
GlutaMAX supplement	gibco	Cat#35050079
Mouse rIL-1 beta	Sino Biological	Cat#50101-MNAE
Mouse rIL-6	Sino Biological	Cat#50136-MNAE
Mouse rIL-23	Sino Biological	Cat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1	Sino Biological	Cat#50698-M08H
PBS	Procell	Cat#PB180327
Recombinant Murine IL-2	peprotech	Cat#212-12
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco	Cat#11875-119
Penicillin-streptomycin solution	Gibco	Cat#15070063
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	Cat#M6250-100ML
Critical commercial assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution Kit	Tbdscience	Cat#TBD0018SOP	Contains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)	Vazyme	Cat#Q341-02	https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixation/permeabilization Concentrate	invitrogen	Cat#00-5123-43
Fixation / Permeabilization Diluent	invitrogen	Cat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506	invitrogen	Cat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	Cat#R223-01	https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activation Cocktail	BD	Cat#550583
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA Kit	Elabscience®	Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouse	STEMCELL	Cat#19765	EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C.
Permeabilization Buffer	invitrogen	Cat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA Kit	Sparkjade	Cat#AC0205-B	https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimental models: Organisms/strains
Mouse: C57BL/6	Gempharmatech	Cat#000013
Oligonucleotides
Mouse Il17a TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Il17f TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Il23r TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Mouse Rora TaqMan primers with probe	ribobio	NA
β-actin TaqMan primers with probe	ribobio	NA
Software and algorithms
Cytek Aurora	Cytek	https://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1	Tree Star	https://www.flowjo.com
GraphPad prism 9	GraphPad Software	https://www.graphpad-prism.cn
Other
1 mL syringe	Kindly	NA
1.5 mL Centrifuge tubes	Eppendorf	Cat#MCT-150-C
5 mL Round-bottom tubes	Corning	Cat#352235
15 mL Centrifuge tubes	NEST	Cat#601052
48-Well tissue culture plate (flatten bottom)	Corning	Cat#3548
50 mL Centrifuge tubes	NEST	Cat#602052
70 µm Cell strainer	Biosharp	Cat#BS-70-XBS
96-well Unskirted qPCR Plates	VIOX scientific	Cat#V4801-M
100 mm Petri dish	Corning	Cat#430167
Centrifuge	Eppendorf	5425R
Cell culture CO2 incubator	Thermo Fisher	HEPA Class100
Cytek Aurora	Cytek	NA
dissecting scissors	RWD	S12003-09
Hemocytometer	AlphaCell	Cat#J633201
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-2000
Real-time PCR System	Roche	LightCycler96
Surgical tweezers	RWD	F12005-10
Thermal cycler	Bio-Rad	C1000 Touch