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요약

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

초록

인비트로(In vitro ) T 세포 분화 기법은 CD4+ T 세포의 기능적 및 기계론적 연구에 필수적입니다. 병원성 Th17 세포는 최근 다발성 경화증(MS), 류마티스 관절염, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 패혈증 및 기타 자가면역 질환을 포함한 광범위한 질병과 관련이 있습니다. 그러나 현재 알려진 in vitro 분화 프로토콜은 고순도의 병원성 Th17 세포를 달성하는 데 어려움이 있으며, 유도 효율이 종종 50% 미만이며, 이는 in vitro 실험의 주요 과제입니다. 이 프로토콜에서는 병원성 Th17 세포에 대한 향상된 시험관 내 배양 및 분화 프로토콜을 제안하며, 이는 마우스 비장에서 분리된 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 직접 분화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 비장 세포 분리, naive CD4+ T 세포 정제 및 병원성 Th17 세포 분화에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜을 통해 병원성 Th17 세포에 대해 약 90%의 분화 순도를 달성할 수 있으며, 이는 많은 세포 실험의 기본 요구 사항을 충족합니다.

서문

흉선을 떠난 후, 미성숙한 CD4+ T 림프구는 2차 림프구를 통과합니다. 상동성 항원을 naive CD4+ T 세포에 전달하는 항원 제시 세포는 이 세포를 활성화하여 일련의 분화 프로그램을 시작하여 결국 고도로 전문화된 T helper(Th) 세포 계통을 생산하게 됩니다1. 인터루킨 17(IL-17) 생산은 전염증성 Th 세포의 하위 집단인 Th17 세포를 특성화합니다2. Th17 세포는 세포외 병원체에 대한 숙주의 방어와 자가면역 포도막염 및 다발성 경화증과 같은 많은 자가면역 질환의 발병에 중요한 역할을 합니다. T 세포 수용체 및 사이토카인 IL-6 및 형질전환 성장 인자 β(TGF-β)의 신호는 신호 전달자 및 전사 활성제(STAT)의 인산화를 통해 미성숙 T 세포를 Th17 세포로 분화하도록 유도합니다.33. STAT3는 IL-23 및 IL-21 4,5에 의해 매개되는 시그널링을 통한 포지티브 피드백 루프에서 더욱 증폭됩니다. STAT3의 인산화는 Th17 세포에서 IL-17A, IL-17F, IL-21 및 IL-22의 사이토카인 프로필을 조절하는 마스터 스위치 역할을 하는 전사 인자 RORγt 및 RORα의 발현을 유도할 수 있습니다6. 그러나 IL-6 및 TGF-β 유도 Th17 세포는 IL-23에 의한 동시 자극 또는 TGF-β 7,8이 없는 경우 IL-23에 의한 동시 자극 또는 IL-6, IL-1β 및 IL-23의 별도 동시 자극이 필요한 자가면역 질환을 유발하기에 불충분한 것으로 보고되었습니다.

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 효과적으로 유도할 수 없는 Th17 subset은 비병원성 Th17이라고도 하며, EAE를 유도할 수 있는 Th17 subset은 병원성 Th17로 알려져 있다9. 현재 연구에 따르면 병원성 Th17과 비병원성 Th17이 핵심 전사 인자 RORγt를 함께 발현하지만, IL-17A를 생성하는 능력과 전염증 및 항염증 특성에는 큰 차이가 있는 것으로 나타났습니다10. 병원성 Th17 세포는 Th17의 일반적인 특성 전사 인자인 RORγt, CCR6, STAT4 및 RUNX4의 높은 발현 외에도 Th1 cell subset의 특성을 가진 TBX21, IFN-γ, CXCR3 등 질병과 관련된 추가적인 유전자 신호 발현 특성을 보여줍니다. 병원성 Th17 세포는 높은 수준의 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), IFN-γ, TNF-α 및 기타 사이토카인을 분비할 수 있습니다11,12. 비병원성 Th17 세포의 표현형은 불안정하며, CD3 및 사이토카인 IL-2의 자극 하에서만 이러한 세포 중 일부가 병원성 Th17 세포로 분화할 수 있습니다. 따라서 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 급성 호흡곤란 증후군과 같은 일반적인 임상 질환 모델에서 병원성 Th17 세포는 주로 병원성 효과를 발휘합니다.

병원성 및 비병원성 Th17 세포는 다양한 사이토카인의 영향으로 시험관 내에서 분화할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 여러 연구에서 다양한 유형과 농도의 사이토카인을 사용하여 Th17 세포의 분화를 유도하는 방법을 제안했습니다. Th17 세포는 IL-6, IL-1β 및 IL-23 13,14,15,16의 조합에 의해 자극됩니다. Th17 세포 분화에 필요한 두 가지 사이토카인인 IL-6 및 TGF-β가 Rorc 유전자좌17에서 두 개의 서로 다른 보존된 non-coding DNA 서열과 상호 작용하여 RORγt 및 Th17 세포 분화의 발현을 시너지 효과로 조절하는 것으로 입증되었습니다. 병원성 Th17 세포의 안정상은 주로 IL-2318,19에 의해 유지된다. IL-23은 수용체에 결합하고 JAK-STAT 신호 경로20을 활성화하여 Jak2 및 Tyk2의 인산화를 유발하고 STAT1, STAT3, STAT4 및 STAT5의 인산화를 촉진합니다. IL-4 및 IFN-γ는 이 경로의 음성 조절자입니다. 그러나 연구에 따르면 IL-1β는 Th17 세포 표현형21의 안정성을 유지하기 위해 mTOR 경로를 통해 Rorα 및 Rorγt의 전사를 긍정적으로 조절할 수 있습니다.

수많은 연구의 이질성으로 인해 최신 연구에서 병원성 및 비병원성 Th17 세포에 대한 유도 프로토콜을 대조군22로 선택했습니다. 결과는 모든 것이 이 프로토콜에 따라 수행된다고 가정할 때 병원성 Th17을 생성하는 조건에서 5일 동안 배양한 후 살아남은 세포의 90% 이상이 병원성 Th17 세포가 될 수 있음을 나타냅니다.

프로토콜

동남대학교의 동물연구를 위한 기관 검토 위원회(Institutional Review Committee for Animal Studies)는 이 연구에 자세히 설명된 모든 동물 연구를 승인했으며, 이는 지역 및 기관 사무실 표준에 따라 수행되었습니다. 비장 샘플은 C57BL6/J 마우스에서 채취하였다. 5주에서 8주 사이의 암컷과 수컷 쥐 모두가 이 연구에 포함되었습니다. 배양 배지 및 완충액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하였다. 수술 기구는 사용 전에 고압 멸균되었습니다. 시약으로 피부, 눈 및 의복이 오염되지 않도록 라텍스 장갑과 마스크를 착용하십시오. 피부와 눈에 물이나 식염수를 많이 사용하십시오.

1. 24웰 조직 배양 플레이트에 anti-CD3 사전 코팅

  1. 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 RPMI 1640 배지에 anti-CD3를 최종 농도 1μg/mL로 희석합니다.
  2. 24웰 조직 배양 플레이트에 1mL의 항-CD3 용액(1μg/mL)을 잘 채웁니다. 그런 다음 파라 필름으로 우물을 덮으십시오.
  3. anti-CD3 코팅 플레이트를 냉장고(2°C-8°C)에 16시간 동안 넣거나 세포 인큐베이터에서 37°C에서 2-3시간 동안 보관합니다.

2. 마우스 비장 분리 및 비장 단세포 현탁액의 제조

  1. 3% 이소플루란으로 C57BL/6J에서 완전 마취를 유도하고 2분 동안 100% 이산화탄소를 흡입하여 안락사시킵니다. 생쥐가 죽은 직후에는 오염을 방지하기 위해 소독을 위해 75% 에탄올에 담그십시오.
  2. 깨끗한 벤치에 마우스를 누운 자세로 놓고 복부 정중선을 따라 잘라 열고 복부 구조를 층별로 분리합니다. 핀셋으로 대구와 위를 부드럽게 열고 위비장 인대로 비장을 부드럽게 빼내고 비장을 주변 조직 및 인대와 뭉툭하게 분리하여 온전한 비장을 얻습니다(비장이 눌리거나 파열되지 않도록 주의).
    알림: 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 슈퍼 클린 벤치에서 다음 작업을 수행합니다.
  3. 70μm 세포 필터를 100mm 멸균 배양 접시에 넣고 비장을 세포 여과기에 넣고 주사기 플런저로 분쇄합니다. 동시에 5-8mL의 균질액 세척액을 추가하여 필터를 통해 모든 세포를 배양 접시로 밀어 넣습니다.
    알림: 림프구 분리액 키트의 구성은 재료 표에서 볼 수 있습니다.
  4. 여과액을 450× g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리십시오.
  5. 림프구 분리 키트 또는 PBS 또는 RPMI 1640 배지와 함께 제공된 샘플 희석제로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 현탁액의 세포 농도를 2 × 108-1 × 109 cells/mL로 조정합니다.
    참고: 일반적으로 비장 하나에 4-6mL의 시료 희석제가 필요합니다.
  6. 원심분리기 튜브에서 조직 단세포 현탁액과 동일한 양의 림프구 분리 용액을 복용합니다. 단세포 현탁액을 림프구 분리 용액의 표면에 조심스럽게 피펫팅하고 800× g, 25°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리기의 가속 및 감속을 적절한 범위로 설정합니다(예: 일반적인 1-9 기어가 있는 경우 3으로 설정).
    참고: 림프구 분리 용액은 3mL 이상이어야 합니다.
  7. 원심분리 후 원심분리기 튜브의 4개 층을 위에서 아래로 관찰합니다. 첫 번째 층은 샘플 희석제에 해당하고 그 다음은 환형 유백색 림프구 층에 해당합니다. 세 번째 층은 분리액이고 네 번째 층은 적혈구로 구성됩니다.
  8. 피펫을 사용하여 환형 유백색 림프구 층의 두 번째 층을 다른 원심분리기 튜브에 조심스럽게 끌어들이고 원심분리기 튜브에 10mL의 세척액을 추가하여 세포를 혼합합니다.
  9. 250× g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리십시오. 10mL의 RPMI 1640 배지를 사용하여 세포 계수를 위해 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.

3. magnetic bead의 negative selection에 기반한 naive CD4+ T cell의 정제

참고: 면역자기 음성 선택을 통해 마우스 비장 세포에서 손대지 않고 고도로 정제된 naive CD4+ T 세포(CD4+CD44lowCD62Lhigh)를 분리합니다.

  1. 0.1-2mL의 부피 범위 내에서 1 × 108 cells/mL를 갖도록 샘플을 준비합니다.
  2. 50μL/mL의 쥐 혈청을 넣고 샘플을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
    참고: naive CD4 T cell sorting kit의 구성은 재료 표에서 볼 수 있습니다.
  3. 50 μL/mL의 Isolation Cocktail을 샘플에 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 7.5분 동안 배양합니다.
  4. 50 μL/mL의 Depletion Cocktail을 샘플에 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 2.5분 동안 배양합니다.
  5. 균일한 분산을 보장하기 위해 마그네틱 비드를 소용돌이치게 합니다. 75 μL/mL의 마그네틱 비드를 샘플에 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 2.5분 동안 배양합니다.
    참고: 입자는 균일하게 분산되어 나타나야 합니다. 소용돌이 시간은 30초 이상이어야 합니다.
  6. RPMI 1640 배지로 시료를 최종 부피 2.5mL까지 보충합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 여러 번 혼합합니다.
  7. 튜브(뚜껑 제외)를 자석에 넣고 실온에서 2.5분 동안 배양합니다.
  8. 자석을 집어 들고 자석과 튜브를 한 번의 연속 동작으로 뒤집고 농축된 셀 현탁액을 새 튜브에 붓습니다.
    알림: 튜브와 자석을 똑바로 세우기 전에 2-3초 동안 뒤집어 두십시오. 튜브 입구에 남아 있을 수 있는 방울을 방해하지 마십시오.
  9. 혈구계를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
  10. 분리 전후에 naive CD4+ T cell에 대한 유세포 분석을 수행합니다(그림 1).
  11. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 400×g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  12. 200-500 μL의 RPMI 1640 배지(10% 소 태아 혈청 보충)에 세포를 재현탁시킵니다. 세포 배양 1mL(예: ~106세포/mL)당 2μL의 백혈구 활성화 칵테일을 추가하고 혼합합니다. CO2 인큐베이터에서 37°C와 포화 습도에서 4-6시간 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 세포는 1-2시간마다 한 번씩 소용돌이쳤습니다.
  13. 400× g, 4°C에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 200μL의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다. 세포에 1μL의 Fc 차단제를 추가합니다(예: ~106 cells/mL). 4°C에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
  14. 400× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다. 상층액을 버리고 200μL의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다.
  15. 항체 칵테일 (Fixable Viability Dye, 1 : 1,000; anti-CD4, 1 : 200; anti-CD44, 1 : 200; anti-CD62L, 1 : 200)을 넣고 4 ° C의 어두운 곳에서 15-20 분 동안 세포를 배양합니다.
  16. 2 x 1mL의 PBS로 세포를 세척한 다음 400× g 으로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  17. 상층액을 버리고 세포를 250μL의 고정 완충액에 재현탁시킨 다음 4°C의 어두운 곳에서 40-60분 동안 배양합니다.
    참고: 수정 완충액은 투과화 희석제로 희석해야 하는 4x 스톡 용액인 Foxp3/transcription factor 염색 완충액과 함께 제공됩니다.
  18. 1x 투과화 완충액 1mL를 추가하여 세포를 300× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다.
  19. 상층액을 버리고, 200μL의 투과화 완충액에 세포를 재현탁시킨 다음 항체(Foxp3 [nuclear], 1:200)를 세포에 추가합니다. 고정 및 막 파열 후 세포-항체 혼합물을 어두운 곳에서 40-60분 동안 배양하고 4°C에서 가끔 짧게 흔듭니다.
    알림: 투과성/세척 용액은 PBS와 함께 사용하기 전에 희석해야 하는 10배 스톡 용액입니다.

4. in vitro에서 병원성 Th17 세포 유도

  1. 사용하기 전에 사전 코팅된 24웰 플레이트에서 멸균 PBS를 제거합니다.
  2. Th0 세포 배양 배지(표 1), 고전적 비병원성 Th17 배양 배지(표 1) 및 고전적 병원성 Th17 배양 배지(표 1)를 포함한 배양용 Th17 세포 배양 배지(표 1)와 조영제를 사용합니다. 농축된 naive CD4 + T 세포를 재현탁하고 동일한 24웰 플레이트(anti-CD3로 사전 코팅됨)의 다른 웰에 분주하여 농도를 4 × 105 cells/mL로 조정하고 각 웰에 1mL의 배지를 사용합니다.
  3. 1 μL/mL의 anti-CD28 용액(최종 농도: 2 μg/mL로 매체로 희석)을 각 웰에 추가합니다. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 세포를 배양합니다.
  4. 세포 배양 상층액 배지를 배양 배지(Th0, 비병원성 Th17, 고전적 병원성 Th17 및 대물렌즈 Th17)로 조심스럽게 피펫팅하여 세포가 고르게 분포되도록 교체하고 세포가 포함된 배지의 절반을 버린 다음 2일차에 폐기량과 동일한 새 배지를 추가합니다. 4일째에 반복합니다.
  5. 5일째에 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다(그림 2). 각 그룹에서 세포 상층액을 수집하고 -80°C에서 냉동 보존합니다.

5. 병원성 Th17 및 Th0 세포 분화를 위한 유세포 분석

  1. 배양 시작 후 5일 후에 모든 세포(웰당)를 수확합니다. 3.12-3.15단계를 수행합니다.
  2. 항체 칵테일(Fixable Viability Dye, 1:1,000; anti-CD4, 1:200)을 넣고 4°C의 어두운 곳에서 15-20분 동안 세포를 배양합니다.
  3. 3.17-3.19단계를 수행합니다.
  4. 상층액을 버리고, 세포를 200μL의 투과화 완충액에 재현탁시키고, 항체 칵테일(IL-17A [intracellular], 1:200; RORγT [핵], 1:200)을 세포에 추가합니다. 고정 및 막 파열 후 세포-항체 혼합물을 어두운 곳에서 40-60분 동안 배양하고 4°C에서 가끔 짧게 흔듭니다.
  5. 1mL의 1x 투과성/세척 용액을 추가하여 세포를 2배 세척하고 400× g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 버리십시오.
  6. 유세포분석기에서 세포를 검사하고 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다(그림 3).
    1. 유세포분석기를 켜고 자가 시작 세척 및 보정 프로세스를 켭니다.
    2. 이 실험에 사용된 레이저 채널을 선택하고 빈 튜브, 단일 염색 튜브 및 샘플 튜브를 설정합니다.
    3. 빈 튜브 옵션을 클릭하고 기계에서 테스트하십시오. 볼륨 조정tage 셀 이벤트가 가능한 한 수집 상자의 중앙에 오도록 합니다.
    4. 단일 염색된 튜브 세포를 수집하고 해당 채널의 스펙트럼 검출을 수행하여 형광 항체가 올바르게 추가되었는지 확인합니다.
    5. unmix 버튼을 클릭하고 기계가 스펙트럼 보정을 자동으로 조정하도록 합니다. 다른 유세포 분석 기기를 사용하여 형광 보정을 일반적으로 조정하십시오.
    6. 각 샘플 튜브 셀을 수집하고 데이터 형식을 FCS 파일로 저장한 다음 내보냅니다. 관련 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어에서 분석하고 플롯합니다.
      1. 주 세포 집단에 동그라미를 치고 FSC-H 및 FSC-A의 대각선 원 게이트를 통해 가능한 세포 접착을 제거합니다.
      2. FVS 네거티브 서클 영역에 따라 라이브 셀을 동그라미로 만듭니다. 다음으로, CD4+ 세포 집단에 동그라미를 칩니다.
      3. 수평축을 IL-17 A로, 수직축을 RORγT로 하여 크로스게이트를 구축합니다. Q2 영역의 이중 양성 선택은 Th17 세포 집단입니다.

6. 다양한 매체에 의해 유도된 IL-17A 분비 검출을 위한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

  1. 섹션 4.5에서 수집된 동결 세포 상층액을 해동합니다.
  2. 희석된 표준물질 100μL를 블랭크 및 샘플로 지정된 웰에 넣습니다. 밀봉기를 사용하여 플레이트를 덮고 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
    알림: 내벽을 만지거나 거품을 일으키지 않고 micro-ELISA 플레이트 웰의 바닥에 용액을 추가하십시오.
  3. 각 웰에서 액체를 디캔팅하고 즉시 100μL의 비오틴화 검출 항체 작업 용액을 추가합니다. 새 밀봉기를 사용하여 플레이트를 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 용액을 디캔팅하고 각 웰에 350μL의 세척 완충액을 추가합니다. 1분 후 각 웰에서 용액을 흡입하거나 디캔팅하고 깨끗한 흡수성 종이에 두드려 건조시킵니다. 이 세탁 단계를 3회 반복합니다.
  5. 100 μL의 양 고추냉이 과산화효소 접합 작업 용액을 각 웰에 추가합니다. 새 밀봉기를 사용하여 플레이트를 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  6. 각 웰에서 용액을 디캔팅하고 5단계에서 설명한 대로 세척 과정을 6.4번 반복합니다.
  7. 각 웰에 90 μL의 기질 시약을 추가하고 플레이트를 빛으로부터 보호하여 새 밀봉기로 37 °C에서 약 15 분 동안 배양합니다.
    알림: 반응 시간은 실제 색상 변화에 따라 변경할 수 있지만 30분을 초과해서는 안 됩니다. OD 측정 전에 마이크로플레이트 리더를 ~15분 동안 예열하십시오.
  8. 50 μL/웰의 Stop Solution을 기질 용액과 동일한 순서로 추가합니다.
  9. 각 웰의 광학 밀도(OD 값)를 450nm로 설정된 microplate reader를 사용하여 한 번에 측정합니다.
  10. 표준 샘플에 대한 OD 값을 구하고 샘플의 반복 웰을 구하고, 빈 웰의 OD 값을 빼서 수정된 값을 얻습니다. 그런 다음, 농도를 가로 좌표축으로, OD 값을 세로좌표로 하여 선형 피팅을 수행합니다. 적합된 방정식을 기반으로 샘플 웰의 IL-17A 농도 값을 계산합니다.
    참고: 4일간의 분화 후 각 그룹의 상층액에 있는 IL-17A의 함량은 그림 4에 나와 있습니다. 피팅 방법은 Orgin21 소프트웨어를 참조할 수 있습니다. 이 실험에서 얻은 표준 곡선의 R2 값은 0.9946입니다.

7. 정량적 PCR(qPCR)을 통한 시그니처 유전자 발현 분석에 의한 T 세포 분화

참고: 염료의 영향 및 고정/파열로 인한 유세포 분석 불안정 가능성을 배제하기 위해 qPCR에 의한 특성 유전자의 발현을 검출하여 전사 수준에서 병원성 Th17의 분화 효과를 규명했습니다.

  1. T 세포 배양 말기의 세포 수를 측정합니다. 1.5mL 원심분리기 튜브에 세포를 수집하고 400× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 모든 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
  2. RNA 추출
    알림: 추출 과정은 RNA 효소 오염을 방지하기 위해 흄 후드 또는 매우 깨끗한 벤치에서 수행해야 합니다.
    1. 500 μL의 용해 완충액(예: 1-2 × 106 세포)을 시료 튜브에 추가하고(단계 7.1), 즉시 세포 질량이 없을 때까지 흔들어 혼합한 다음 1분 동안 그대로 둡니다.
    2. 혼합물을 수집 튜브에 놓인 흡착 컬럼에 넣고 13,400× g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 여과액을 버립니다.
    3. 처음 사용하기 전에 Washing Buffer 병에 지정된 양의 절대 에탄올을 추가하십시오. 흡착 컬럼에 세척 완충액 500μL를 추가하고 13,400× g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 여과액을 버립니다.
    4. 7.2.3단계에서 세탁을 반복합니다.
    5. 흡착 컬럼 RA를 빈 수집 튜브에 넣고 13,400× g 에서 2분 동안 원심분리하여 헹굼 용액을 제거합니다.
      알림: 헹굼 용액의 잔류 에탄올이 다운스트림 반응을 억제하지 않도록 헹굼 용액을 제거해야 합니다.
    6. 흡착 컬럼 RA를 제거하고 깨끗한 RNase가 없는 원심분리기 튜브에 넣습니다. 흡착막 중앙에 RNase-free H2O 50 μL를 첨가하고 실온에서 1분 동안 방치한 후 9,600 × g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
  3. RNA의 순도와 농도를 측정합니다.
  4. 키트 제조업체의 지침에 따라 cDNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다.
    1. 게놈 DNA를 제거합니다. RNase-free 원심분리기 튜브에서 추출된 템플릿 RNA 500ng를 취합니다. RNase-free ddH2O 및 4x gDNA 혼합물을 첨가하여 혼합물을 형성합니다. 피펫으로 부드럽게 블렌딩하고 42°C 수조에 2분 동안 담뱉니다.
      참고: 반응 혼합물의 양과 첨가된 양은 RNA 농도와 관련이 있습니다. 자세한 내용은 지침을 참조하십시오. 이 실험에는 20μL 반응 시스템이 사용되었습니다.
    2. 이전 단계의 반응 튜브에 5x 역전사 반응 시스템을 직접 추가합니다. 이전 단계에서 4 μL의 역전사 반응 시스템과 16 μL의 혼합물을 취하여 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
      참고: 역전사 시스템에는 직접 구성된 역전사 시스템인 필요한 모든 역전사 효소가 포함됩니다.
    3. 역전사 반응을 37°C 15분, 85°C, 5초로 설정하고 마지막으로 4°C로 냉각합니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 PCR 반응을 설정합니다.
    1. qPCR 튜브에 2x PCR 반응 효소 혼합물 10μL, 프라이머 1 0.4μL, 프라이머 2 0.4μL, ROX 참조 염료 1 50배 0.4μL, 템플릿 cDNA 2μL 및 ddH2O6.8μL를 추가하여 20μL 혼합물을 제조합니다.
    2. 다음 설정을 사용하여 실시간 형광 정량 PCR 기기에서 PCR을 수행합니다: stage 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; 2단계, 처음 95°C, 10초, 그 다음 60°C, 30초, Rep x 40; 3단계, 처음 95°C, 15초, 다음 60°C, 60초, 마지막으로 95°C, 15초, Rep x 1.
      참고: 4일간의 분화 후 naive CD4+ T 세포에서 Il17a, Il17f, Rora 및 Il23r의 상대적 발현 수준이 그림 5에 나와 있습니다.

대표적 결과

당사의 프로토콜은 병원성 Th17 세포 분화에 대한 이전 연구를 기반으로 개발되었습니다. 실험의 첫 번째 단계는 자기 비드 분류를 통해 비장에서 분리된 naive CD4+ T 세포의 순도를 검출하는 것이며, 이는 후속 병원성 Th17 세포 분화 성공의 기초가 됩니다. naive CD4+ T 세포의 순도는 표면 마커 CD62L23 및 CD4424 를 사용하여 검출되었으며 FOXP325 는 Treg 세포의 마커로 사용되었습니다. 분류 후 Treg 세포의 함량이 현저히 감소했으며 naive CD4+ T 세포의 순도가 95% 이상에 도달할 수 있음을 발견했습니다(그림 1). 병원성 Th17 세포의 분화를 비교하기 위해 naive CD4+ T 세포를 Th0 배지(표 1) 및 Th17 분화 배지(표 1)로 총 5일 동안 배양했습니다. T 세포는 Th0 및 Th17 매체 모두에서 클러스터 성장을 보이는 것으로 밝혀졌습니다(그림 2).

다음으로, 세포를 고정, 투과화하고 유세포 분석을 기반으로 분화된 CD4+ T 세포에서 여러 사이토카인에 대한 항체로 표지했습니다. Th17 세포 분화의 특징인 IL17A26 및 RORγT27 을 조사한 결과, naive CD4+ T 세포의 90%가 새로운 Th17 세포 배양 배지의 자극 하에 병원성 Th17 세포로 성공적으로 분화했음을 발견했습니다(그림 3). 그림 5 는 PCR에 의해 검출된 Th17 세포의 시그니처 유전자를 나타낸 것으로, 분화로 얻은 병원성 Th17 세포가 안정적으로 발현되고 있음을 입증하였다.

figure-representative results-1257
그림 1: naive CD4+ T 세포 분리 전후의 C57BL/6J 마우스에서 시그니처 사이토카인 분석을 위한 게이팅 전략. 약어: FSC-H = 전방 산란 피크 높이; SSC-H = 측면 산란-완두콩 높이; FSC-A = 전방 산란 피크 면적; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-representative results-1771
그림 2: 병원성 Th17 및 Th0 조건에서 5일 동안 배양한 마우스 순진한 CD4+ T 세포의 대표 이미지. (A) Th0 세포; (B) 병원성 Th17 세포. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: Th0 세포 배양 배지 및 Th17 세포 배양 배지에 의해 유도된 분화 후 유세포 분석. 약어: FSC-H = 전방 산란 피크 높이; SSC-H = 측면 산란-완두콩 높이; FSC-A = 전방 산란 피크 면적; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-representative results-2739
그림 4: 분화 유도 후 Th0 세포 배양 배지와 Th17 세포 배양 배지의 상층액에서 IL-17A의 함량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-representative results-3127
그림 5: C57BL/6J 마우스의 분화된 CD4+ T 세포에서 시그니처 사이토카인의 발현 수준을 나타내는 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표적 병원성 Th17 세포 배양 배지Th0 세포 배양 배지고전적인 비병원성 Th17 세포 배양 배지고전적인 병원성 Th17 세포 배양 배지.
시약최종 농도분량최종 농도분량최종 농도분량최종 농도분량
페니실린-스트렙토마이신(×100)1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터
소 태아 세럼10%5mL10%5mL10%5mL10%5mL
β-메르캅토에탄올50 마이크로미터50 μL50 마이크로미터50 μL50 마이크로미터50 μL50 마이크로미터50 μL
GlutaMAXTM 보충제(×100)1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터1배500 마이크로리터
피루브산 나트륨 용액(×100)1 m엠500 마이크로리터1 m엠500 마이크로리터1 m엠500 마이크로리터1 m엠500 마이크로리터
안티-마우스 IFN 감마(1mg/mL)5μg/mL250 마이크로리터10μg/mL500 마이크로리터10μg/mL500 마이크로리터
안티-마우스 IL-4 (2 mg/mL)5μg/mL125 마이크로리터5μg/mL250 마이크로리터10μg/mL250 마이크로리터
마우스 rIL-1 베타(20μg)20ng/mL해당 없음
마우스 rIL-6 (20 μg)20ng/mL해당 없음50ng/mL해당 없음50ng/mL해당 없음
마우스 rIL-23 (50 μg)50ng/mL해당 없음10ng/mL해당 없음
마우스 TGF 베타(100μg)3ng/mL해당 없음1ng/mL해당 없음1ng/mL해당 없음
뮤린 IL-2 (5 μg)20ng/mL해당 없음
RPMI 1640년해당 없음최대 50mL해당 없음최대 50mL해당 없음최대 50mL
합계해당 없음50mL해당 없음50mL해당 없음50mL

표 1: 표적 병원성 Th17 세포 배양, Th0 세포 배양, 고전적인 비병원성 및 병원성 Th17 세포 배양 배지.

토론

이 절차는 병원성 Th17 세포의 시험관 내 생산을 위해 생쥐 비장 순진한 CD4+ T 세포의 수를 증가시키는 생산적인 방법을 제공했습니다. 당사는 보고된 다른 Th17 세포 배양 배지보다 더 많은 사이토카인을 사용하지만, 병원성 Th17 세포의 성장 조건을 최적화하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 우리는 유도 차별화 프로토콜의 추가 최적화를 고려하고 있습니다.

여기서는 유세포 분석과 qPCR을 사용하여 특징적인 사이토카인의 생산을 조사했습니다. 몇 가지 사소한 수정을 통해 이 접근 방식은 세포 증식과 같은 다른 기능 테스트에도 사용할 수 있습니다.

우리는 중국에서 생산된 림프구 분리 키트를 사용하여 쥐 비장 림프구를 분리했는데, 이는 효과적이고 시간을 절약할 수 있기 때문입니다. 다른 브랜드를 기반으로 하는 림프구 분리 솔루션도 여러 단계를 통해 마우스 비장 림프구를 분리하는 목적을 달성할 수 있습니다. 또 다른 방법은 얻어진 비장 세포 현탁액의 적혈구를 직접 용해하는 것입니다. 그러나 우리는 비장 적혈구가 한 번에 용해되지 않는 경우가 많다는 것을 발견했습니다.

이 프로토콜을 실행하는 동안 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 마그네틱 비드 분류에 의해 얻어진 naive CD4+ T cell의 수가 매우 적을 수 있습니다(프로토콜 단계 3). 이것은 장기를 분쇄하는 과정이 불충분하기 때문일 수 있습니다. 장기가 적절하게 균질화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 균질화 과정에서 헹굼 빈도를 늘리면 회수율이 향상됩니다. 더 많은 수의 비장 순진한 CD4+ T 세포를 얻으려면 더 어린 마우스(6-10주령)를 사용하는 것이 좋습니다. 비장 림프구를 분리하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 사용하는 분리액에 따라 수율이 달라질 수 있습니다. 보편적으로 인증된 분리액을 사용하고 가능한 한 림프구층을 추출하도록 노력하는 것이 좋습니다.

둘째, 유세포 분석에서 CD4+ T 세포의 비율은 <80%일 수 있습니다(프로토콜 단계 5). 이 문제의 한 가지 가능한 원인은 부정확한 비장 세포 수일 수 있으며, 이로 인해 추가 항체 칵테일 및 자성 비드의 세포 수보다 더 많은 세포 수가 발생할 수 있습니다. naive CD4+ T 세포 정제의 효과를 높이려면 세포 계수가 정밀해야 합니다. 또한 이 프로토콜에서 권장하는 것보다 10% 더 많은 항체 칵테일과 마그네틱 비드를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, naive CD4+ T 세포를 분류한 직후 유세포 분석을 수행할 수 있습니다.

셋째, 배양 중에 형성된 T 세포 클러스터가 많지 않을 수 있으며, 대부분의 세포가 T 세포의 분화 중에 죽었을 수 있습니다(프로토콜 단계 4). 이 문제의 잠재적 원인은 seeding 전에 naive CD4+ T cell의 세포 수를 부정확하게 측정하여 세포 밀도가 낮아지기 때문일 수 있습니다. 48웰 플레이트의 각 웰에 대해 약 4 × 105 cells/mL의 원하는 세포 밀도를 달성하기 위해 보다 정확한 계수 방법을 채택하는 것이 좋습니다. 또 다른 가능한 원인은 잘못된 온도 또는 CO2 농도와 같은 CO2 인큐베이터의 기술적 문제일 수 있습니다. 마지막으로, 세포 배양 배지를 변경하는 동안 과도한 힘을 가하면 잠재적으로 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.

넷째, 시그니처 사이토카인 유전자의 상대적 발현 수준이 낮을 수 있다(프로토콜 단계 7). 추출된 RNA의 신뢰성을 보장하려면 100ng/mL 이상의 나노방울 검출 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 농도 감소의 잠재적 원인은 수집된 세포의 상당 부분이 죽었거나 사멸 과정에 있는 것과 같은 배양된 세포의 건강하지 않은 특성일 수 있습니다. 실제 RNA 농도를 얻기 위해서는 세포 배양 중 성장 저하로 이어질 수 있는 상황을 해결해야 합니다. 이러한 우려의 이면에 있는 또 다른 이유는 RNA 추출 중에 달성되는 최종 세포 수가 과도하게 낮기 때문일 수 있으며, 이는 상층액 폐기 중 부주의한 세포 손실로 인한 것일 수 있습니다. 원스텝 RNA 추출 키트와 같은 고급 RNA 추출 기술을 사용하는 것이 유리할 수 있습니다. Nanodrop으로 측정한 이상적인 OD260/OD280 비율은 1.9-2.1 범위에 속해야 합니다. 비율이 과도하게 낮을 경우 단백질 오염이 발생할 수 있습니다. RNase-free buffer washing의 빈도를 늘리면 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반대로, 비정상적으로 낮은 비율은 잠재적인 RNA 분해를 의미합니다. 이 문제를 해결하려면 RNase가 없는 물을 사용하고 RNase 오염 제거를 위해 1.5mL 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.

결론적으로, 현재 프로토콜은 새로운 세포 배양 배지를 사용하여 naive CD4+ T 세포가 in vitro에서 병원성 Th17 세포로 분화하도록 직접 유도하는 방법을 설명합니다. 직접 분리와 비교할 때 이 방법이 더 직접적이고 저렴하며 효율적이라는 것은 의심의 여지가 없습니다. 배지의 구성도 매우 간단하여 구성된 Th17 세포를 후속 실험에 보다 직관적으로 사용할 수 있어 많은 질병 연구를 위한 매우 우수한 세포 모델을 제공합니다.

공개

저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국가중점연구개발프로그램(No.2022YFC2304604), 중국국가자연과학재단(No.81971812), 중국국가자연과학재단(No.82272235), 장쑤성 건강위원회 과학재단(No. ZDB2020009), 장쑤성 중점연구개발프로그램(사회개발) 특별사업(제BE2021734호), 과학기술부 국가중점R&D사업(제2020YFC083700호), 장쑤성 중점의학연구실(BM2020004), 중국국가자연과학재단(81930058), 중국국가자연과학재단(82171717), 중앙대학교 기초연구기금(2242022K4007), 및 Jiangsu Provincial Natural Science Foundation General Project (BK20211170).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilutionBDCat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilutionBioLegendCat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilutionBioLegendCat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilutionBioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilutionInvitrogenCat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilutionInvitrogenCat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purifiedbiogemsCat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purifiedbiogemsCat#10312-25
Anti-Mouse IFN gammabiogemsCat#80822-25
Anti-Mouse IL-4biogemsCat#81112-25
EthanolXilong scientificCat#64-17-5
Fetal bovine serumGibcoCat#10437-028
FcR Blocking reagentMiltenyi BiotecCat#130-092-575
GlutaMAX supplementgibcoCat#35050079
Mouse rIL-1 betaSino BiologicalCat#50101-MNAE
Mouse rIL-6Sino BiologicalCat#50136-MNAE
Mouse rIL-23Sino BiologicalCat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1Sino BiologicalCat#50698-M08H
PBSProcellCat#PB180327
Recombinant Murine IL-2peprotechCat#212-12
RPMI 1640 with L-glutamineGibcoCat#11875-119
Penicillin-streptomycin solutionGibcoCat#15070063
β-mercaptoethanolSigma-AldrichCat#M6250-100ML
Critical commercial assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution KitTbdscienceCat#TBD0018SOPContains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)VazymeCat#Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixation/permeabilization ConcentrateinvitrogenCat#00-5123-43
Fixation / Permeabilization DiluentinvitrogenCat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506invitrogenCat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VazymeCat#R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activation CocktailBDCat#550583
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA KitElabscience®Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouseSTEMCELLCat#19765EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C.
Permeabilization BufferinvitrogenCat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA KitSparkjadeCat#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimental models: Organisms/strains
Mouse: C57BL/6GempharmatechCat#000013
Oligonucleotides
Mouse Il17a TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Il17f TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Il23r TaqMan primers with proberibobioNA
Mouse Rora TaqMan primers with proberibobioNA
β-actin TaqMan primers with proberibobioNA
Software and algorithms
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
GraphPad prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
Other
1 mL syringeKindlyNA
1.5 mL Centrifuge tubesEppendorfCat#MCT-150-C
5 mL Round-bottom tubesCorningCat#352235
15 mL Centrifuge tubesNESTCat#601052
48-Well tissue culture plate (flatten bottom)CorningCat#3548
50 mL Centrifuge tubesNESTCat#602052
70 µm Cell strainerBiosharpCat#BS-70-XBS
96-well Unskirted qPCR PlatesVIOX scientificCat#V4801-M
100 mm Petri dishCorningCat#430167
CentrifugeEppendorf5425R
Cell culture CO2 incubatorThermo FisherHEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
dissecting scissorsRWDS12003-09
HemocytometerAlphaCellCat#J633201
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo FisherND-2000
Real-time PCR SystemRocheLightCycler96
Surgical tweezersRWDF12005-10
Thermal cyclerBio-RadC1000 Touch

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