Pipeline para el estudio anatómico tridimensional multiescala del corazón humano

Resumen

Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.

Resumen

El estudio detallado de los corazones humanos no defectuosos rechazados para trasplante ofrece una oportunidad única para realizar análisis estructurales a escala microscópica y macroscópica. Estas técnicas incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente) y tinción inmunohistoquímica. Los procedimientos de examen mesoscópico incluyen la disección estereoscópica y la tomografía microcomputarizada (TC). Los procedimientos de examen macroscópico incluyen la disección macroscópica, la fotografía (incluidos los anaglifos y la fotogrametría), la tomografía computarizada y la impresión 3D del corazón o del corazón entero, disecado física o virtualmente. Antes del examen macroscópico, se puede realizar una fijación de presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón. La aplicación de estas técnicas en combinación para estudiar el corazón humano es única y crucial para comprender la relación entre las distintas características anatómicas, como la vasculatura coronaria y la inervación miocárdica, en el contexto de la arquitectura 3D del corazón. Este protocolo describe las metodologías en detalle e incluye resultados representativos para ilustrar el progreso en la investigación de la anatomía cardíaca humana.

Introducción

Dado que la función sigue a la forma, la comprensión de la arquitectura del corazón es fundamental para apreciar su fisiología. A pesar de que numerosas investigaciones han revelado la anatomía cardíaca desde la micro hasta la macroescala ^1,2,3, múltiples preguntas siguen sin resolverse, especialmente las relacionadas con la anatomía cardíaca humana. Esto se debe, en parte, a que los estudios básicos centrados en la anatomía funcional generalmente utilizaban corazones de animales ^4,5,6

Protocolo

Este estudio utilizó muestras de tejido no identificadas recolectadas de corazones humanos de donantes no fallantes y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). Se obtuvieron muestras de corazones no defectuosos que fueron rechazados para trasplante. Los corazones se perfundieron a presión, se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% y se tomaron imágenes antes del procesamiento de tejidos según los siguientes métodos. En la Figura 1 se resume el diagrama de flujo del orden del estudio. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la T....

Discusión

El presente estudio demuestra el proceso exhaustivo para analizar muestras obtenidas de corazones humanos completos. Los resultados representativos muestran exámenes anatómicos a micro y macroescala realizados de forma rutinaria para un solo corazón. Dado que una muestra de corazón humano es extremadamente valiosa, un enfoque multiescala es ideal y eficaz para no desperdiciar ninguna parte de la muestra mediante la aplicación de múltiples protocolos para diversos fines, incluido el descubrimiento en la investigaci?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN