Pipeline für dreidimensionale multidimensionale anatomische Untersuchung des menschlichen Herzens

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.

Zusammenfassung

Die detaillierte Untersuchung von nicht versagenden menschlichen Herzen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden, bietet eine einzigartige Möglichkeit, strukturelle Analysen auf mikroskopischer und makroskopischer Skala durchzuführen. Zu diesen Techniken gehören das Tissue Clearing (modifizierte Immunmarkierungs-gestützte dreidimensionale (3D) Bildgebung von Organen, die durch Lösungsmittel freigegeben wurden) und die immunhistochemische Färbung. Zu den mesoskopischen Untersuchungsverfahren gehören stereoskopische Dissektion und mikrocomputertomographische (CT) Scans. Zu den makroskopischen Untersuchungsverfahren gehören grobe Dissektion, Fotografie (einschließlich Anaglyphen und Photogrammetrie), CT und 3D-Druck des physisch oder virtuell präparierten oder ganzen Herzens. Vor der makroskopischen Untersuchung kann eine Druck-Perfusionsfixation durchgeführt werden, um die 3D-Architektur und die physiologisch relevante Morphologie des Herzens zu erhalten. Die Anwendung dieser Techniken in Kombination zur Untersuchung des menschlichen Herzens ist einzigartig und entscheidend für das Verständnis der Beziehung zwischen unterschiedlichen anatomischen Merkmalen wie koronaren Gefäßen und Myokardinnervation im Kontext der 3D-Architektur des Herzens. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden im Detail und enthält repräsentative Ergebnisse, um die Fortschritte in der Erforschung der menschlichen Herzanatomie zu veranschaulichen.

Einleitung

Da die Funktion der Form folgt, ist das Verständnis der Architektur des Herzens von grundlegender Bedeutung für das Verständnis seiner Physiologie. Obwohl zahlreiche Untersuchungen die kardiale Anatomie von der Mikro- bis zur Makroskala aufgedeckt haben ^1,2,3, sind mehrere Fragen ungeklärt, insbesondere solche, die sich auf die menschliche Herzanatomie beziehen. Dies liegt zum Teil daran, dass grundlegende Studien, die sich auf die funktionelle Anatomie konzentrierten, im Allgemeinen Tierherzen verwendeten ^4,5,6<....

Protokoll

Diese Studie verwendete anonymisierte Gewebeproben, die von nicht versagenden menschlichen Spenderherzen entnommen wurden, und wurde vom Institutional Review Board der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Es wurden Proben von nicht versagenden Herzen entnommen, die für eine Transplantation abgestoßen wurden. Die Herzen wurden druckperfundiert, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und vor der Gewebeverarbeitung mit den folgenden Methoden abgebildet. Abbildung 1 fasst das Flussdiagramm der Reihenfolge der Studie zusammen. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der M....

Diskussion

Die vorliegende Studie zeigt die umfassende Pipeline zur Analyse von Proben, die aus ganzen menschlichen Herzen gewonnen wurden. Repräsentative Befunde zeigen mikro- bis makroskalige anatomische Untersuchungen, die routinemäßig an einem einzelnen Herzen durchgeführt werden. Da eine menschliche Herzprobe äußerst wertvoll ist, ist ein Multiskalenansatz ideal und effektiv, um keine Teile der Probe zu verschwenden, indem mehrere Protokolle für verschiedene Zwecke angewendet werden, einschließlich der Entdeckung in de.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN