인간 심장의 다차원 3차원 해부학 연구를 위한 파이프라인

요약

이 프로토콜은 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 인간의 심장에서 얻은 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 제공합니다.

초록

이식을 거부당한 실패하지 않는 인간 심장에 대한 상세한 연구는 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 구조 분석을 수행할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이러한 기술에는 조직 투명화(용매가 제거된 장기의 수정된 면역 표지 지원 3차원(3D) 이미징) 및 면역조직화학적 염색이 포함됩니다. Mesoscopic 검사 절차에는 입체 절개 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔이 포함됩니다. 거시적 검사 절차에는 전체 해부, 사진 촬영(애너글리프 및 사진 측량 포함), CT 및 물리적 또는 가상으로 절개된 심장 또는 전체 심장의 3D 프린팅이 포함됩니다. 거시적 검사 전에 심장의 3D 구조 및 생리학적으로 관련된 형태를 유지하기 위해 압력 관류 고정을 수행할 수 있습니다. 인간의 심장을 연구하기 위해 이러한 기술을 조합하여 적용하는 것은 심장의 3D 아키텍처의 맥락에서 관상 동맥 혈관 구조 및 심근 신경 분포와 같은 뚜렷한 해부학적 특징 간의 관계를 이해하는 데 독특하고 중요합니다. 이 프로토콜은 방법론을 자세히 설명하고 인간 심장 해부학 연구의 진행 상황을 보여주는 대표적인 결과를 포함합니다.

서문

기능이 형태를 따르듯이 심장의 구조를 이해하는 것은 심장의 생리학을 이해하는 데 필수적입니다. 수많은 연구에서 미시적 규모에서 거시적 규모에 이르기까지 심장 해부학이 밝혀졌지만 ^1,2,3 특히 인간의 심장 해부학과 관련된 여러 질문은 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이는 부분적으로는 기능적 해부학에 초점을 맞춘 기초 연구가 일반적으로 인간의 심장 ^1,7,8과 구별되는 동물의 심장 ^4,5,6을 활용했기 때문이다. 더욱이, 각 개별 연구는 심지어 인간의 심장 샘플을 사용하는 연구조차도 매우 특정한 구조에 초점을 맞추는 경향이 있어 연구 결과를 전체 심장의 맥락에서 적용하기가 어렵습니다. 이것은 초점이 맞춰진 구조가 perinexus⁹ 및 ganglion....

프로토콜

이 연구는 실패하지 않은 기증자의 심장에서 수집한 비식별화된 조직 샘플을 사용했으며 UCLA(University of California, Los Angeles)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 샘플은 이식을 위해 거부된 실패하지 않는 심장에서 얻었습니다. 심장을 압력 관류하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 다음 방법에 따라 조직 처리 전에 이미지를 촬영했습니다. 그림 1 은 연구 순서의 순서도를 요약한 것입니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마이크로 스케일 검사

1. iDISCO+(Modified Immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs) 프로토콜을 사용한 조직 투명화.
   1. 컨포칼 현미경 검사를 위해 3mm × 16mm × 25mm 챔버 내에 맞도록 메스로 4% PFA 고정 조직을 절개합니다. 더 두꺼운 조직을 이미지화하기 위해 추가 챔버 및/또는 스페이서를 슬라이드에 쌓을 수 있습니다.
   2. 등급이 매겨진 메....

토론

본 연구는 인간의 심장 전체에서 채취한 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 보여줍니다. 대표적인 결과는 단일 심장에 대해 일상적으로 수행되는 미시적 및 거시적 해부학적 검사를 보여줍니다. 인간의 심장 검체는 매우 소중하기 때문에 과학 연구의 발견, 임상 절차의 개선, 전체 심장의 맥락에서 해부학적 상관 관계를 유지하는 해부학 교육 등 다양한 목적으로 여러 프로토콜을 적용.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN