İnsan Kalbinin Çok Ölçekli Üç Boyutlu Anatomik Çalışması için Boru Hattı

Özet

Bu protokol, mikroskobik ve makroskopik ölçekleri kapsayan insan kalplerinden elde edilen örnekleri analiz etmek için kapsamlı bir boru hattı sunar.

Özet

Transplantasyon için reddedilen başarısız insan kalplerinin ayrıntılı çalışması, mikroskobik ve makroskopik ölçeklerde yapısal analizler yapmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknikler arasında doku temizleme (modifiye immünoetiketleme özellikli solventle temizlenmiş organların üç boyutlu (3D) görüntülemesi) ve immünohistokimyasal boyama yer alır. Mezoskopik muayene prosedürleri stereoskopik diseksiyon ve mikro bilgisayarlı tomografik (BT) taramayı içerir. Makroskopik muayene prosedürleri arasında brüt diseksiyon, fotoğrafçılık (anaglifler ve fotogrametri dahil), BT ve fiziksel veya sanal olarak diseke edilmiş veya tüm kalbin 3D baskısı yer alır. Makroskopik incelemeden önce, kalbin 3D mimarisini ve fizyolojik olarak ilgili morfolojisini korumak için basınç-perfüzyon fiksasyonu yapılabilir. Bu tekniklerin insan kalbini incelemek için kombinasyon halinde uygulanması, kalbin 3D mimarisi bağlamında koroner vaskülatür ve miyokard innervasyonu gibi farklı anatomik özellikler arasındaki ilişkiyi anlamada benzersiz ve çok önemlidir. Bu protokol, metodolojileri ayrıntılı olarak açıklar ve insan kardiyak anatomisi araştırmalarındaki ilerlemeyi göstermek için temsili sonuçlar içerir.

Giriş

İşlev formu takip ettiğinden, kalbin mimarisini anlamak, fizyolojisinin takdir edilmesi için esastır. Çok sayıda araştırma, mikrodan makro ölçeklere^{kadar kardiyak} anatomiyi ortaya çıkarmış olsa da, ^1,2,3, özellikle insan kardiyak anatomisi ile ilgili olanlar olmak üzere birçok soru çözülmeden kalmıştır. Bu kısmen, fonksiyonel anatomiye odaklanan temel çalışmaların genellikle insan kalbinden farklı olan hayvan kalplerini^{4,5,6 kullanmasından kaynaklanmaktadır}

Protokol

Bu çalışma, başarısız olmayan donör insan kalplerinden toplanan tanımlanmamış doku örneklerini kullandı ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Transplantasyon için reddedilen başarısız kalplerden örnekler alındı. Kalpler basınçla perfüze edildi, %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi ve aşağıdaki yöntemlere göre doku işlemeden önce görüntülendi. Şekil 1 , etüt sırasının akış şemasını özetlemektedir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikro ölçekli inceleme

Tartışmalar

Bu çalışma, tüm insan kalplerinden elde edilen örnekleri analiz etmek için kapsamlı bir boru hattını göstermektedir. Temsili sonuçlar, tek bir kalp için rutin olarak gerçekleştirilen mikro-makro ölçekli anatomik muayeneleri göstermektedir. Bir insan kalbi örneği son derece değerli olduğundan, bilimsel araştırmalarda keşif, klinik prosedürlerin iyileştirilmesi ve tüm kalp bağlamında anatomik korelasyonun sürdürülmesi ile anatomik eğitim dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için birden fa.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN