Pipeline pour l’étude anatomique tridimensionnelle multi-échelle du cœur humain

Résumé

Ce protocole présente un pipeline complet pour analyser des échantillons obtenus à partir de cœurs humains qui couvrent les échelles microscopique et macroscopique.

Résumé

L’étude détaillée des cœurs humains non défaillants rejetés pour la transplantation offre une occasion unique d’effectuer des analyses structurelles à des échelles microscopiques et macroscopiques. Ces techniques comprennent l’élimination des tissus (imagerie tridimensionnelle (3D) modifiée par immunomarquage des organes éliminés par solvant) et la coloration immunohistochimique. Les procédures d’examen mésoscopique comprennent la dissection stéréoscopique et la tomodensitométrie (TDM). Les procédures d’examen macroscopique comprennent la dissection macroscopique, la photographie (y compris les anaglyphes et la photogrammétrie), la tomodensitométrie et l’impression 3D du cœur disséqué physiquement ou virtuellement ou entier. Avant l’examen macroscopique, une fixation par perfusion de pression peut être effectuée pour maintenir l’architecture 3D et la morphologie physiologiquement pertinente du cœur. L’application combinée de ces techniques à l’étude du cœur humain est unique et cruciale pour comprendre la relation entre des caractéristiques anatomiques distinctes telles que la coronaroplastie et l’innervation myocardique dans le contexte de l’architecture 3D du cœur. Ce protocole décrit les méthodologies en détail et comprend des résultats représentatifs pour illustrer les progrès de la recherche sur l’anatomie cardiaque humaine.

Introduction

Comme la fonction suit la forme, la compréhension de l’architecture du cœur est fondamentale pour apprécier sa physiologie. Bien que de nombreuses recherches aient révélé l’anatomie cardiaque à l’échelle microscopique ^1,2,3, de nombreuses questions restent en suspens, en particulier celles liées à l’anatomie cardiaque humaine. Cela s’explique en partie par le fait que les études fondamentales axées sur l’anatomie fonctionnelle ont généralement utilisé des cœurs d’animaux ^4,5,6

Protocole

Cette étude a utilisé des échantillons de tissus anonymisés prélevés sur des cœurs humains de donneurs non défaillants et a été approuvée par le conseil d’examen institutionnel de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Des échantillons ont été prélevés à partir de cœurs non défaillants qui ont été rejetés pour la transplantation. Les cœurs ont été perfusés sous pression, fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et imagés avant le traitement des tissus selon les méthodes suivantes. La figure 1 résume l’organigramme de l’ordre de l’étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la

Discussion

La présente étude démontre le pipeline complet d’analyse d’échantillons obtenus à partir de cœurs humains entiers. Les résultats représentatifs montrent des examens anatomiques à l’échelle microscopique et macroscopique effectués en routine pour un seul cœur. Comme un échantillon de cœur humain est extrêmement précieux, une approche multi-échelle est idéale et efficace afin de ne gaspiller aucune partie de l’échantillon en appliquant plusieurs protocoles à diverses fins, y compris la découver.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN