ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

要約

このプロトコルは、人間の心臓から得られたサンプルを微視的スケールと巨視的スケールで分析するための包括的なパイプラインを提供します。

要約

移植が拒否された機能不全のない人間の心臓の詳細な研究は、微視的および巨視的なスケールで構造分析を実行するユニークな機会を提供します。これらの技術には、組織透明化(溶媒で透明化された臓器の修飾免疫標識対応3次元(3D)イメージング)および免疫組織化学染色が含まれます。メゾスコピック検査の手順には、立体解剖とマイクロコンピューター断層撮影(CT)スキャンが含まれます。肉眼的検査手順には、肉眼的解剖、写真撮影(アナグリフおよび写真測量を含む)、CT、および物理的または仮想的に解剖された心臓または全身の3Dプリントが含まれます。肉眼検査の前に、心臓の3D構造と生理学的に関連する形態を維持するために、圧力灌流固定を行う場合があります。これらの技術を組み合わせて人間の心臓を研究するための適用は、心臓の3D構造の文脈で冠状血管系と心筋神経支配などの異なる解剖学的特徴との関係を理解する上でユニークで重要です。このプロトコルでは、方法論を詳細に説明し、ヒト心臓解剖学の研究の進歩を示す代表的な結果が含まれています。

概要

機能が形に従うように、心臓の構造を理解することは、その生理機能を理解するための基本です。数多くの調査により、ミクロスケールからマクロスケールまでの心臓の解剖学的構造が明らかになりました^1,2,3、^特に人間の心臓の解剖学的構造に関連する複数の問題が未解決のままです。これは、機能解剖学に焦点を当てた基礎研究が一般的に動物の心臓^4,5,6を使用しており、これらはしばしば人間の心臓^1,7,8とは異なるためである。さらに、個々の研究は、人間の心臓サンプルを使用したものであっても、非常に特殊な構造に焦点を当てる傾向があり、その結果を心臓全体の文脈に適用することが困難になります。これは、集束構造が近縁部⁹や神経節^神経叢10のようなミクロスケールまたはメソスケールにある場合はなおさらである。

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プロトコル

この研究は、機能不全ではないドナーのヒト心臓から収集された匿名化された組織サンプルを使用し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の治験審査委員会によって承認されました。サンプルは、移植が拒否された非機能不全の心臓から採取されました。心臓を加圧灌流し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、以下の方法により組織処理前に画像化した。 図1 は、調査の順序のフローチャートをまとめたものです。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. マイクロスケールの検査

1. 溶媒で除去された臓器の修飾免疫標識対応3Dイメージング(iDISCO+)プロトコルを使用した組織透明化。
   1. 共焦点顕微鏡用の3 mm×16 mm×25 mmのチャンバー内に収まるように、メスで4% PFA固定組織を解剖します。より厚い組織をイメージングするために、追加のチャンバーおよび/またはスペーサーをスライド上に積み重ねることができます。
   2. グレードドメタノール(MeOH)シリーズ(脱イオンH₂O [vol/vol]中の20%、40%、60%、80%、100%MeOH)を用いて、室温(RT)で各1時間攪拌しながら試料を脱水します。
   3. 100% MeOHでRTで1時....

ディスカッション

本研究は、人間の心臓全体から得られたサンプルを分析するための包括的なパイプラインを示しています。代表的な結果は、単一の心臓に対して日常的に実施されたミクロスケールからマクロスケールの解剖学的検査を示しています。ヒトの心臓試料は非常に貴重であるため、科学研究における発見、臨床手技の改善、全身の解剖学的相関性を保ちながらの解剖学教育など、様々な目的に対?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN